Bioconversión de 4

Mar 08, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 1835 (2023) Citar este artículo

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Las actividades de cría de ganado y los desechos farmacéuticos conducen a una acumulación considerable de hormonas esteroides y estrógenos en las aguas residuales. Aquí los estrógenos actúan como agentes cancerígenos y disruptores endocrinos, interfiriendo con el desarrollo sexual de los animales acuáticos y teniendo efectos tóxicos en los humanos. Las bacterias ambientales juegan un papel vital en la degradación de los estrógenos. Su amplio reservorio de enzimas, como las dioxigenasas de escisión del anillo (RCD), puede degradar el núcleo del esteroide y catalizar la metaescisión de los anillos de esteroides A, B o D. En este trabajo, se aislaron 4 dioxigenasas de escisión del anillo extradiol (ERCD), PP28735, PP26077, PP00124 y PP00193, de la esfingomona marina Novosphingobium sp. PP1Y y caracterizado. Los parámetros cinéticos de las enzimas se determinaron sobre diferentes sustratos catecólicos sintéticos. Luego, se evaluó la bioconversión de catecol estrógenos. PP00124 demostró ser un catalizador eficaz para la degradación del 4-hidroxiestradiol (4-OHE2), un derivado hidroxilado cancerígeno de E2. La escisión completa de 4-OHE2 se obtuvo utilizando PP00124 tanto en forma soluble como en células de E. coli recombinantes completas. Los análisis de LC-MS/MS confirmaron la generación de un producto de semialdehído, a través de la metaescisión del anillo A. Hasta donde sabemos, PP00124 es la primera enzima caracterizada capaz de degradar directamente 4-OHE2 a través de la metaescisión. Además, la biodegradación completa de 4-OHE2 utilizando células completas recombinantes destacó las ventajas para fines de biorremediación.

Los estrógenos son las principales hormonas esteroides responsables de la regulación del sistema reproductivo femenino y el desarrollo de las características sexuales secundarias1. En todos los vertebrados, la estrona (E1) y el 17β-estradiol (E2) son las principales hormonas reguladoras (Fig. 1a). E2, que tiene una importante actividad estrogénica con concentraciones plasmáticas en hembras de mamíferos de hasta 500 pg/mL, se encuentra entre los principales efectores del desarrollo del sistema reproductivo en humanos2. Los estrógenos se excretan en la orina después de la hidroxilación o sulfonación3; varios estudios han demostrado que estos compuestos, y en particular sus formas hidroxiladas (4-hidroxiestradiol 4-OHE2 y 2-hidroxiestradiol 2-OHE2, Fig. 1a), pueden actuar como disruptores endocrinos y cancerígenos4,5.

Principales compuestos estrogénicos y vías de degradación de E2. (a) Estructuras y pesos moleculares (MW) de estrona (E1), 17 β-estradiol (E2), estratetraenol (E0), 4-hidroxiestradiol (4-OHE2) y 2-hidroxiestradiol (2-OHE2). Los anillos de esteroides AD se indican en rojo. (b) Principales vías de degradación de E2. i) hidroxilación del anillo E2 A19. ii) hidroxilación del anillo E2 B19. iii) Deshidratación del anillo E2 D20. iv) deshidrogenación de E2 a E1 y posterior deshidrogenación y escisión del anillo D21. iv.i) Deshidrogenación de E2 a E1 y posterior deshidrogenación y escisión del anillo A18. NB: la ruta iv.i) sigue esencialmente la misma reacción de escisión del anillo A que la ruta i). Aquí se separa porque el sustrato de escisión es 4-OHE1 en la ruta iv.i) y 4-OHE2 en la ruta i).

La presencia de estos compuestos nocivos en las aguas residuales y los ecosistemas acuáticos se debe principalmente a las excreciones de animales de granja en las actividades de cría de ganado6 y recientemente se ha convertido en una importante preocupación ambiental7,8,9; estas moléculas parecen, de hecho, ser responsables del desarrollo, la fertilidad y el deterioro de la función reproductiva en las poblaciones de mamíferos, peces y anfibios. De hecho, se han observado poblaciones de peces intersexuales en todo el mundo en ecosistemas contaminados con estrógenos [5,6,10,11,12 y referencias allí].

La creciente preocupación medioambiental ha aumentado recientemente el interés por los procesos biológicos implicados en la degradación de los estrógenos, en particular de E2, y la identificación tanto de nuevos degradadores potenciales como de actividades enzimáticas degradantes13. La degradación de los núcleos estrogénicos, a través de la disrupción de la estructura del anillo A aromático, es la clave para dificultar la interacción de estos compuestos con el ADN, neutralizando así su actividad y consecuente efecto cancerígeno13,14. Los procesos de degradación microbiana juegan un papel vital en la determinación del destino y transporte de los estrógenos en el medio ambiente. Las bacterias que poseen la maquinaria catalítica específica para la interrupción completa de los núcleos de esteroides en modo metabólico o co-metabólico juegan un papel central en la conversión de estrógenos a CO213,14,15.

La biodegradación de estrógenos puede ser catalizada por diferentes oxigenasas y deshidrogenasas, a través de diferentes vías catabólicas. Las dioxigenasas de escisión de anillo (RCD) juegan un papel fundamental en la degradación de los estrógenos, catalizando la escisión oxidativa de los anillos A estrogénicos hidroxilados. Estas familias de enzimas microbianas también desempeñan un papel central en las vías de degradación de los hidrocarburos aromáticos monocíclicos y policíclicos y los compuestos aromáticos complejos (p. ej., permitiendo la escisión de los contaminantes ambientales y los derivados de la lignina en el medio ambiente). Las oxigenasas suelen ser complejos enzimáticos que utilizan cofactores y realizan reacciones redox utilizando oxígeno como co-reactivo y NADH o hierro como donante de electrones16. La ruta de degradación de los compuestos aromáticos en las bacterias se puede dividir generalmente en dos pasos, indicados como rutas superior e inferior17. Las reacciones de las vías superiores implican la activación del anillo aromático mediante la adición de uno o dos grupos hidroxilo en dos átomos de carbono adyacentes, a menudo catalizada por monooxigenasas. Luego, las dioxigenasas operan la escisión del anillo oxidativo de los compuestos catecólicos. Las dioxigenasas se dividen comúnmente en dioxigenasas de escisión del anillo intradiol (IRCD) y extradiol (ERCD)18. Las enzimas IRCD escinden el enlace entre los dos grupos hidroxilo generando un compuesto dicarboxílico (un derivado del ácido cis-mucónico). Los ERCD catalizan la incorporación de oxígeno O2 en derivados de catecol, escindiendo así uno de los enlaces adyacentes al diol y generando un ácido alfa-hidroxi que contiene un grupo aldehídico o cetónico (un derivado del semialdehído cis-mucónico). Estas enzimas permiten la conversión de moléculas aromáticas dihidroxiladas en intermedios del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), que son fácilmente metabolizados por cualquier tipo de organismo. Según Yu y colaboradores14, las vías de degradación microbiana de los estrógenos se dividen en cuatro rutas principales, que se resumen en la figura 1b. Estas vías de degradación también podrían agruparse dependiendo de los anillos de esteroides involucrados en el primer paso de degradación: i) Un anillo: hidroxilación directa de E2 en C4 para formar 4-OHE2 y posterior escisión de 4-OHE2 a través del llamado 4,5-seco vía, realizada por ERCDs19; ii) anillo B: degradación de E2 a partir de la hidroxilación del anillo B saturado y posterior escisión19; iii) anillo D: degradación directa de E2 a través de la deshidratación del anillo D20; iv) Anillo D: en esta vía el primer paso siempre implica una deshidrogenación de E2 a E1. Posteriormente, E1 podría deshidrogenarse y escindirse en el anillo D (vía iv)21,22 o hidroxilarse a 4-OHE1 y escindirse en el anillo A a través de la vía 4,5-seco (vía iv.i), de manera similar a lo descrito en i) para 4-OHE219,23.

En los últimos años, diferentes trabajos han descrito el aislamiento de nuevas enzimas microbianas capaces de degradar E2, la mayoría de las cuales están involucradas en la deshidrogenación inicial de E2 a E1, que luego es hidroxilada y escindida, como se describe en la vía iv.i)19,23, 24,25,26,27,28.

La actividad de bioprospección es de suma importancia para arrojar luz sobre las rutas bioquímicas implicadas en la biodegradación de estrógenos y para ampliar la caja de herramientas enzimáticas para las aplicaciones biotecnológicas de estos catalizadores.

Novosphingobium sp. PP1Y, al igual que otras bacterias degradadoras de estrógenos, es una alfa-proteobacteria marina miembro del orden Sphingomonadales, que fue aislada de aguas altamente contaminadas en Pozzuoli (Italia). Varios rasgos fenotípicos de esta cepa, incluida la posibilidad de crecer en mezclas complejas de moléculas aromáticas disueltas en fases no polares como el diésel y la gasolina, sugieren una versatilidad metabólica única y la capacidad de catalizar la biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos complejos (PAH). 29 Novosphingobium sp. El genoma de PP1Y se ha secuenciado y anotado por completo30, y su análisis revela la presencia de más de 40 orf putativos que codifican mono y dioxigenasas, que representan un reservorio impresionante de actividades de oxigenasa probablemente responsables de la capacidad de esta cepa para degradar una amplia gama de compuestos aromáticos mono, bi, tri, tetra y pentacíclicos30,31.

En este trabajo, el microorganismo Novosphigobium sp. PP1Y se utilizó como fuente novedosa para el aislamiento de ERCD activos frente a estrógenos de catecol. Los genes que codifican cuatro ERCD se expresaron de forma recombinante en E. coli; se caracterizaron las enzimas correspondientes y se midieron las constantes cinéticas sobre diferentes sustratos catecólicos. Luego, se evaluó la bioconversión de catecol estrógenos utilizando extractos celulares o células recombinantes completas. El ERCD PP00124 se identificó y caracterizó como capaz de catalizar la bioconversión completa de 4-OHE2, tanto en forma soluble como en células recombinantes completas, mediante metaescisión.

La mayoría de las ERCD conocidas pertenecen a una familia heterogénea de proteínas caracterizada por la presencia de varias subfamilias32. Cada familia ha evolucionado para optimizar la escisión de un tipo específico de catecol sustituido: 3- o 4-alquilcatecoles, 3,4-dihidroxifenilacetato, 2,3-dihidroxibifenilo, 1,2-dihidroxinaftaleno, 3,4-dihidroxifenantreno.

El análisis del genoma de la cepa 30 de PP1Y reveló la presencia de 7 orfs que codifican ERCD putativos (tres presentes en copia doble con una identidad del 100 %). Un minucioso estudio filogenético, respaldado por un análisis de modelado de homología, permitió hipotetizar el papel de las siete enzimas en el metabolismo de los compuestos aromáticos mono y policíclicos30. En particular, se planteó la hipótesis de que los orfs AT15671/AT31616, Mpl3065, AT15599/AT31688 y AT32663 codifican, respectivamente, una supuesta (di)(metil)catecol dioxigenasa, una supuesta dihidroxibifenil dioxigenasa y dos dihidroxinaftaleno/dihidroxifenantreno dioxigenasas. En este documento, estas enzimas se denominarán, respectivamente, PP00193, PP26077, PP00124 y PP28735.

El modelado de homología/análisis de acoplamiento descrito en D'Argenio et al.30 sugirió que los sitios activos de los ERCD mencionados deberían poder albergar catecoles con sustituyentes en las posiciones 3 y/o 4, pero las dimensiones del sitio activo se embolsan progresivamente. aumento en el orden PP00193 < PP26077 < PP00124 < PP28735. Curiosamente, PP00124 y PP28735 mostraron bolsas de sitios activos lo suficientemente grandes como para albergar hidrocarburos aromáticos policíclicos dihidroxilados con 3 o 4 anillos (p. ej., fenantreno, antraceno, benz[a]antraceno y criseno) y 4-OHE2 que, desde un punto de vista estérico, es similar al 1,2-dihidroxicriseno (consulte la Figura complementaria S1). La determinación de la actividad específica de los cuatro ERCD en un panel limitado de sustratos, incluido el 4-OHE2, confirmó las funciones hipotéticas de estas proteínas en el metabolismo de los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) en la cepa PP1Y30.

Por lo tanto, los 4 ERCD se seleccionaron como actividades interesantes para detectar la bioconversión de estradiol. Las condiciones de expresión recombinante se optimizaron en células de E. coli BL21(DE3) transformadas con los correspondientes vectores pET22b(+), cuya construcción se describió previamente30. Las condiciones de expresión se optimizaron probando diferentes temperaturas de crecimiento, tiempos de inducción y concentraciones de IPTG, para obtener enzimas activas. Para seleccionar las condiciones de crecimiento, evaluamos la actividad catalítica de los ERCD en 2,3-dihidroxibifenilo (2,3-DHBP) como sustrato en células completas recombinantes de E. coli BL21 (DE3) (Figura complementaria S2 a), durante la fase de inducción por IPTG. Como se muestra en la Figura complementaria S2 b, todos los ERCD recombinantes se expresaron en la fracción soluble, excepto la proteína PP28735, que estaba presente principalmente en la fracción insoluble, como se destaca en el análisis SDS-PAGE de las fracciones soluble e insoluble después de la lisis celular (Suplementario Figura S2b). El nivel de expresión de proteínas en forma soluble (Tabla complementaria S1) se estimó en 120, 40 y 100 mg/L de cultivo para PP26077, PP00124 y PP00193, respectivamente, pero solo entre 1 y 2 mg/L para la enzima PP28735.

A continuación, los ERCD se purificaron mediante una cromatografía de intercambio aniónico en una resina Q-Sepharose FF. Se observó una marcada inestabilidad de todos los ERCD en tampones sin Fe (NH4) 2 (SO4) 2, lo que sugiere que, en ausencia de hierro exógeno en el tampón, el Fe (II) en el sitio activo fácilmente se perdió u oxidó a Fe (III) conduciendo así a la inactivación de la enzima. Por lo tanto, se estableció un protocolo para una cromatografía "por lotes" rápida, que implicaba el uso de un tampón que contenía glicerol al 30% y Fe(NH4)2(SO4)2 0,1 mM. Como se muestra en la Figura complementaria S3 a, el rendimiento de los procedimientos de purificación osciló entre el 44 y el 95 %, según la evaluación de la enzima activa purificada (unidades totales finales) en comparación con la cantidad de enzima activa en los lisados ​​celulares (unidades totales iniciales). El análisis SDS-PAGE de proteínas purificadas (Figura complementaria S3 b) reveló la presencia de contaminantes de hasta el 10-20 % de las proteínas totales para los ERCD PP26077, PP00124 y PP00193, mientras que el PP28735 purificado mostró una mayor presencia de proteínas contaminantes, probablemente relacionadas con la baja cantidad inicial de proteína en las fracciones solubles de los cultivos inducidos.

Como todas las Dioxigenasas de Desdoblamiento del Anillo están dotadas de un ion Fe(II) como cofactor en el sitio activo, y la falta de incorporación de Fe(II) a la proteína madura, o su oxidación a Fe(III), provoca la inactivación total de la actividad dioxigenasa, medimos el contenido de hierro mediante el ensayo Ferene S. Los resultados informados en la Tabla complementaria S1 destacaron que se encontró que el Fe (II) total era del 60 %, 100 % y 88 % para las proteínas PP26077, PP00124 y PP00193, respectivamente. El rendimiento de recuperación de la proteína PP28735 en las fracciones purificadas fue demasiado bajo para medir la cantidad de hierro. Además, el ensayo de hierro permitió estimar que el 25 % y el 7 % de las proteínas PP26077 y PP00193, respectivamente, estaban libres de hierro, mientras que las fracciones restantes estaban dotadas de Fe(III), lo que conducía a enzimas inactivas. Vale la pena señalar que la proteína PP00124 purificada retuvo el 100 % de Fe(II) al final del procedimiento de expresión y purificación, lo que indica una mayor estabilidad enzimática en comparación con los otros ERCD.

Luego, se determinaron la actividad específica (SA) y los parámetros cinéticos de los ERCD purificados en los cuatro sustratos catecólicos seleccionados, 2,3-DHBP, 3-metilcatecol (3MC), 4-metilcatecol (4MC) y catecol (CAT) ("Materiales y Métodos"). La actividad específica de los RCD purificados se midió controlando la formación a lo largo del tiempo de los semialdehídos cis-mucónicos correspondientes. Los resultados que se muestran en la Tabla 1 sugirieron que las proteínas PP28735, PP26077 y PP00124 eran principalmente activas en 2,3-DHBP y mostraron valores más bajos de SA en los otros sustratos monoaromáticos probados. Por el contrario, PP00193 fue más activo en CAT, 3-MC y 4-MC, como se esperaba según los resultados del modelo30, que indicaron que esta enzima tiene un sitio activo más pequeño.

Las características cinéticas de los 4 ERCD, resumidas en la Tabla 2, mostraron que las proteínas PP00124 y PP00193 estaban dotadas de la mayor actividad hacia todos los sustratos, con valores de KM que oscilaban entre 30 y 1 µM. Como era de esperar, PP00193 pareció la mejor enzima para la conversión de compuestos monoaromáticos y 2,3-DHBP, mostrando los valores más altos de kcat/KM para estos sustratos. Por el contrario, las proteínas PP28735 y PP26077 tenían una actividad significativa solo en 2,3-DHBP, el sustrato más grande, mientras que mostraban valores de KM superiores a 450 µM en catecoles monoaromáticos. De hecho, estas enzimas mostraron valores de kcat/KM para la conversión de 2,3-DHBP entre 80 y 200 veces más bajos en comparación con 3-MC. La proteína PP00124 mostró una actividad comparable en todos los sustratos probados, con una mayor eficacia frente a la 2,3-DHBP.

Se probó la bioconversión de estrógenos de catecol utilizando ERCD de cepa PP1Y. Los sustratos utilizados para las bioconversiones fueron 4-OHE2 y 2-OHE2 (Fig. 1a). Estos se derivan de la hidroxilación de E2, portando los sustituyentes –OH en las posiciones 3, 4 y 2, 3 del anillo aromático, respectivamente. A partir del análisis de acoplamiento molecular realizado previamente30, 4-OHE2 y 2-OHE2 deberían acomodarse mejor en los sitios activos de PP28735 y PP00124. Por lo tanto, estas enzimas deberían mostrar la mayor afinidad por los estrógenos de catecol seleccionados. Los datos preliminares obtenidos en nuestro trabajo anterior30 apoyaron aún más esta hipótesis. En este trabajo se determinó la SA de los cuatro ERCD para 4-OHE (Tabla 5 en 30). Los datos mostraron que las proteínas PP28735 y PP00124 fueron capaces de catalizar la escisión de 4-OHE2 en su supuesto semialdehído mucónico cis, mientras que las proteínas PP00193 y PP26077 mostraron una actividad insignificante.

Para seleccionar la mejor enzima para la conversión de 4-OHE2, realizamos experimentos de curso de tiempo (Fig. 2) realizados con proteínas PP28735 y PP00124 mediante análisis de espectrofotómetro. Las reacciones, realizadas a pH 7,5 en presencia de 4-OHE2 100 µM, condujeron a la formación de un producto de reacción dotado de λmax a 298 nm (Fig. 2). En un tiempo de incubación de 4 (PP00124) y 8 (PP28735) minutos, no se observaron más cambios en los espectros, lo que sugiere una conversión completa de 4-OHE2. Basándose en las propiedades espectrales de los productos de escisión, podría plantearse la hipótesis de que las dos enzimas catalizan la misma reacción. Sin embargo, vale la pena señalar que los semialdehídos obtenidos de la escisión meta de catecoles aparecen, en general, como productos amarillos con λmax entre aproximadamente 350 y 450 nm, mientras que el producto de escisión de 4-OHE2 se absorbe en la región del espectro UV con λmax a 298 nm. Es bien sabido que las formas de color amarillo representan la forma dianiónica de los semialdehídos, generalmente la más abundante a pH 7,5 al cual se realizaron las reacciones33. Para verificar las propiedades de los productos de conversión de 4-OHE2 por las proteínas PP28735 y PP00124, alcalinizamos la mezcla de reacción mediante la adición de NaOH. Las propiedades espectrales en el tampón alcalino informadas en la Figura complementaria S4 destacaron los productos de color amarillo (λmax a 417 nm) como se esperaba para los semialdehídos, lo que confirma la reacción de escisión del anillo y sugiere que se necesita un valor de pH más alto para obtener la forma amarilla dianiónica. .

Espectros UV-vis del curso temporal de la conversión enzimática de 4-OHE2. Las reacciones se llevaron a cabo utilizando las enzimas PP28735 (a) y PP00124 (b) en 1 ml de tampón Tris/HCl 50 mM pH 7,5 que contenía 4-OHE2 100 μM (líneas negras discontinuas). Las reacciones se iniciaron mediante la adición de enzimas purificadas. La producción de semialdehído fue monitoreada por el programa Scanning Kinetics en el espectrofotómetro Cary 100 UV-VIS en un rango de longitud de onda de 230 a 500 nm, registrando la absorción durante 4-8 min, a 25 °C (líneas de escala de grises). Las líneas negras en negrita representan los espectros de semialdehído al final de la reacción a pH 7,5 (λmax 298 nm).

También realizamos análisis cinéticos de conversión de 4-OHE2 por los ERCD para seleccionar el mejor catalizador. La formación del producto se controló espectrofotométricamente a 298 nm, longitud de onda a la que no se registró absorbancia para el sustrato 4-OHE2. Como se informa en la Tabla 3, la proteína PP00124 mostró los mejores parámetros cinéticos para la bioconversión de 4-OHE2 con un valor de KM submicromolar, lo que impulsó la configuración de un protocolo de bioconversión a pequeña escala utilizando lisados ​​celulares de E. coli que expresan PP00124 como Catalizador.

También probamos la capacidad de los ERCD para escindir 2-OHE2, pero no se observó ningún producto de conversión para ninguna de las proteínas, lo que sugiere una selectividad de estas enzimas hacia 4-OHE2.

Sobre la base de las interesantes propiedades cinéticas de la proteína PP00124, estudiamos más a fondo la cinética de la escisión de 4-OHE2 mediante extractos de células que contienen PP00124 realizando análisis de HPLC.

La conversión completa de 4-OHE2 se verificó espectrofotométricamente. A continuación, los productos de bioconversión obtenidos de la reacción se analizaron mediante HPLC. Los resultados que se muestran en la Fig. 3 revelaron que, en nuestras condiciones experimentales, la conversión completa de 4-OHE2 (tiempo de retención: 12,7 min y λmax: 279 nm, panel 3a) en un producto de semialdehído (tiempo de retención: 11,4 min y λmax: 305 nm , panel 3b), lo que confirma los análisis espectrofotométricos. Por el contrario, al utilizar 2-OHE2 como sustrato (tiempo de retención: 13,4 min y λmax: 286 nm) (Fig. 3, paneles c, d) no se observó conversión en ningún momento de la reacción, de acuerdo nuevamente con los análisis espectrofotométricos . Estos datos confirmaron la estrecha especificidad de PP00124 hacia sustratos que llevan sustituyentes en las posiciones 3, 4 de los anillos A aromáticos.

Análisis por HPLC de bioconversión de 4-OHE2 y 2-OHE2 usando PP00124 recombinante como catalizador. El ensayo se llevó a cabo en tampón Tris/HCl 50 mM pH 7,5 a 25 °C, con 4-OHE2 y 2-OHE2 100 µM y 200 µM, respectivamente. Se recogieron alícuotas de las mezclas de reacción antes de la adición de la enzima. Las muestras se acidificaron, se diluyeron 100 veces, se centrifugaron y se analizaron en HPLC como controles negativos (que se muestran en los paneles (a) y (c) como reacciones en blanco). Luego, se añadió lisado celular PP00124 para iniciar las reacciones. La formación del producto se siguió espectrofotométricamente durante 15 min. A continuación, las muestras se acidificaron, se diluyeron 100 veces, se centrifugaron y se analizaron mediante paneles de HPLC (b) y (d). (a) Cromatograma de HPLC de la reacción en blanco de 4-OHE2 y espectro UV-vis de 4-OHE. (b) Cromatograma de HPLC de la reacción de 4-OHE2: producto de reacción de semialdehído y espectro UV-vis correspondiente. (c) Cromatograma de HPLC de la reacción en blanco de 2-OHE2 y espectro UV-vis. (d) Cromatograma de HPLC de la reacción de 2-OHE2 y espectro UV-vis correspondiente. Todos los cromatogramas mostrados se adquirieron a 280 nm.

Se realizó un análisis de espectrometría de masas de alta resolución de los productos de conversión. Se recogieron alícuotas de las reacciones en blanco y de punto final y se sometieron a una extracción líquido-líquido con acetato de etilo. Los extractos obtenidos fueron analizados por LC-MS/MS en modo de iones negativos. Se detectaron dos productos de reacción principales generados por la bioconversión catalizada por PP00124 de 4-OHE2: dos especies coeluyentes, con pesos moleculares de 306,1839 (medido m/z 305,1761, Fig. 4b) y 324,1951 (medido m/z 323,1873, Fig. 4b). 4c), respectivamente.

Espectros de MS de alta resolución de productos de bioconversión de 4-OHE2. Los espectros de masa completa (MS1) se adquirieron en modo de iones negativos. (a) Espectro 4-OHE2 m/z (m/z 287,1652). (b) Espectro m/z del producto de metaescisión de 4-OHE2 (m/z 323,1873). (c) Espectro m/z del producto de ciclación de 4-OHE2 (hipotético). (m/z 305.1761).

Estos datos confirmaron la presencia del producto de semialdehído 4-OHE2 metaescindido (PM teórico 324.1937), como se esperaba en base al mecanismo catalítico de los ERCD que median la inserción de una molécula de O2 en el sustrato34. Esto se indica en la Fig. 4 como producto de metaescisión. El segundo producto de reacción podría generarse a partir del producto de escisión meta, a través de un ataque nucleofílico espontáneo del hidroxilo en C4 sobre el grupo carbonílico en C5, seguido de deshidratación (PM teórico 306.1831). Esto se indica en la Fig. 4c como producto de ciclación (hipotético). Las estructuras hipotéticas de estos compuestos y la reacción propuesta se informan en la Fig. 5.

Mecanismo hipotético de degradación de 4-OHE2 utilizando PP00124. La presencia del producto de semialdehído 4-OHE2 meta escindido (PM teórico 324,1951) se verificó por espectrometría de masas. Está en línea con el mecanismo catalítico de los ERCD que actúa a través de una inserción de O2 en el sustrato. Presumimos la generación del segundo producto identificado, a través de una ciclación del producto de escisión meta, con el ataque nucleofílico espontáneo del hidroxilo en C4 sobre el grupo carbonílico en C5. La estructura hipotética de este compuesto (PM teórico 306,1839) se informa como producto de ciclación de 4-OHE2 (hipotético).

Una vez confirmada la conversión completa de 4-OHE2 100 μM utilizando PP00124, evaluamos la posibilidad de obtener la bioconversión de 4-OHE2 con células enteras como biocatalizadores. Para ello, se utilizaron células recombinantes de E. coli que expresan PP00124.

Después de la expresión recombinante, las células se analizaron para probar la actividad de la proteína recombinante en 2,3-DHBP. Se midió una actividad específica de 0,7 U2,3DHBP/OD. Se incubaron 3,5 unidades totales de 2,3-DHBP (5 DO600) de células de E. coli que expresan PP00124 en medio mínimo que contenía 4-OHE2 100 µM (28 mg/l) y se llevó a cabo un experimento de evolución temporal. El experimento también se realizó con 10 células OD600 de E. coli BL21(DE3) transformadas con plásmido pET22b(+) vacío como control negativo. Cada punto de tiempo de las reacciones de control negativo de células PP00124 y E. coli se extrajo dos veces en acetato de etilo y se analizó mediante HPLC-MS/MS. No se observó degradación de 4-OHE2 utilizando células de E. coli transformadas con el plásmido vacío. Los resultados obtenidos para las células que expresan PP00124 se muestran en la Fig. 6. Como se observa en la reacción realizada con la enzima purificada, se observa una rápida disminución de 4-OHE2 (m/z 287) y formación en el tiempo de los dos compuestos generados por 4-OHE2. La hidrólisis de OHE2 fue evidente (m/z 305 y 323). Curiosamente, la acumulación cinética de estos dos compuestos era casi superponible, lo que sugiere que se produjo un equilibrio entre estas dos especies.

Bioconversión de células enteras de E. coli de 4-OHE2 usando PP00124 recombinante como catalizador. Las células recombinantes de E. coli que expresan P00124 se incubaron a 37 °C con 4-OHE2 100 μM en medio mínimo. En diferentes momentos, se recogieron y acidificaron alícuotas del sobrenadante. Se realizó una extracción líquido-líquido con acetato de etilo. Se llevaron a cabo análisis cuali-cuantitativos HPLC-MS/MS. Los espectros de masa completa (MS1) se adquirieron en modo de iones negativos de alta resolución. Se registraron las áreas de los picos de los cromatogramas de iones extraídos para cada compuesto y punto de tiempo. Se muestran las horas extraordinarias de tendencia de 4-OHE2 (m/z 287) y sus productos de escisión (m/z 305 y 323). ( a ) Bioconversión en un curso de tiempo de 2 h. (b) detalle de bioconversión de 20 min. Los datos se reportan en Área (%) expresando la abundancia relativa de los compuestos. Para cada compuesto, el área de pico más alta registrada se estableció como 100% de área. Las muestras se analizaron por triplicado y los datos se informaron como la media de las áreas medidas.

La tasa de bioconversión realizada usando células que expresan PP00124 fue significativamente más lenta que la realizada con la enzima purificada (descrita anteriormente). Sin embargo, PP00124 kcat/KM permitió la conversión completa de 4-OHE2 en 15 min utilizando 3,5 Unidades2,3-DHBP en 5 OD600. Cabe destacar que, hasta donde sabemos, no se han informado ejemplos de biodegradación de células completas de 4-OHE2 hasta el momento. Li y colaboradores mostraron una degradación completa de E2 utilizando un consorcio microbiano, después de 3 días de incubación a 20 mg/L35.

Los ERCD están recibiendo atención por su uso potencial en la bioconversión de estrógeno y compuestos similares al estrógeno. La identificación y caracterización de nuevas actividades enzimáticas es de suma importancia para arrojar luz sobre las rutas bioquímicas desarrolladas por las células bacterianas para degradar estas moléculas, lo que podría ser perjudicial para la salud humana. Además, los ERCD también podrían implementarse para aplicaciones biosintéticas, aprovechando la escisión del anillo específica del sitio realizada por estas enzimas36,37. Su especificidad de sustrato podría ajustarse para la biosíntesis de productos químicos finos.

Un análisis de bioprospección publicado previamente de Novosphingobium sp. El genoma de PP1Y reveló una notable abundancia de RCD que probablemente permiten a la cepa PP1Y metabolizar mezclas complejas de catecoles derivadas de la oxidación simultánea de varios hidrocarburos aromáticos monocíclicos y policíclicos, que son los sustratos de crecimiento preferidos para esta cepa29,30.

Este trabajo describe una caracterización cinética de cuatro ERCDs previamente aislados de Novosphingobium sp. PP1Y30. Se investigó su especificidad de sustrato y se obtuvo la biodegradación completa de 4-OHE2 utilizando la proteína PP00124, con células completas recombinantes o lisados ​​celulares.

Se determinaron los parámetros cinéticos de CAT, 3-MC, 4-MC y 2,3-DHBP de los 4 ERCD. Los datos obtenidos confirmaron el modelo de homología/análisis de acoplamiento realizado previamente para las enzimas en D'Argenio et al. (30 y Figura Suplementaria S7 en el mismo). De hecho, la proteína PP00193 tuvo la mayor eficiencia para la degradación de compuestos monoaromáticos, mostrando valores de kcat/KM que oscilaron entre 115 y 64 s−1 µM−1. Estos valores parecían ser comparables o incluso superiores a los descritos para enzimas similares de Pseudomonas putida mt-2 y Burkholderia sp. LB40038,39,40. La proteína PP00124 mostró una actividad comparable en todos los sustratos que hemos probado, pero con una mayor eficacia frente a la 2,3-DHBP. En general, aunque los valores de kcat/KM de las proteínas PP00124 y PP00193 hacia este sustrato no fueron superiores a los descritos para otras bifenildioxigenasas (como las de Sphingomonas sp. RW1 y Burkholderia sp. LB400), estas proteínas de la cepa PP1Y están dotadas con capacidad de escindir varios catecoles 3- y/o 4-sustituidos, lo que no ha sido descrito para otras enzimas ya caracterizadas en la literatura40,41. Por el contrario, la proteína PP26077 tiene una actividad muy baja sobre estos sustratos y, como era de esperar, parece tener una mayor afinidad por moléculas con un sustituyente perpendicular al anillo aromático, como en 2,3-DHBP.

En cuanto a la escisión de 4-OHE2, PP00124 resultó ser el mejor catalizador. El análisis HPLC-MS/MS destacó la bioconversión completa del sustrato después de 15 minutos de reacción. No se observó conversión de 2-OHE2, lo que sugiere una estrecha especificidad de la enzima para estructuras de anillos A sustituidos en 2,3. Se observó la escisión proximal del estradiol del anillo catecólico sustituido en 3 o 4 para formar 2-hidroximuconato semialdehído con la inserción de dos átomos de dioxígeno, como se esperaba para el mecanismo de reacción de los ERCD, mediante la generación de un producto de 323,187 m/z (287 + 36 = 323 m/z ión)34,38. Los resultados mostraron, sin embargo, la generación también de un compuesto de 305,176 m/z, probablemente derivado de ciclación intramolecular espontánea, con eliminación de una molécula de agua. En la Fig. 5 se muestra una representación de la estructura hipotética del producto de ciclación. Los dos productos parecían generarse al mismo tiempo y permanecer en equilibrio a lo largo del tiempo durante la reacción (Fig. 6). Se podría avanzar la hipótesis de que el producto de ciclación se genera a partir del producto de meta-escisión semialdehídica a través de un ataque nucleofílico y deshidratación y la formación de un anillo heterocíclico en la posición A (Fig. 5). Otros trabajos describieron la formación de un compuesto heterocíclico similar, el ácido de piridinestrona, a través de una reacción abiótica espontánea en presencia de un donante de nitrógeno en el medio24. Por lo tanto, la generación de un producto secundario similar, como el producto de ciclación, está en línea con los datos informados anteriormente. Aunque se necesitarían más análisis para la caracterización completa del mecanismo de reacción, nuestros datos sugirieron PP00124 de Novosphingobium sp. PP1Y para ser un biocatalizador eficiente para la biodegradación de 4-OHE2. Hasta donde sabemos, aquí describimos el aislamiento y la identificación en Novosphingobium sp. PP1Y del primer ERCD capaz de degradar directamente 4-OHE2 mediante metaescisión y probablemente implicado en la vía i) 4,5 seco. Aunque la biodegradación de 4-OHE2 se informó e identificó previamente como una posible vía de degradación natural en Rhodococcus sp. ED6 y Sphingomonas sp. ED8 por Kurisu et al.19, hasta donde sabemos, PP00124 de Novosphingobium sp. PP1Y es el primer ERCD caracterizado que escinde este sustrato. Por el contrario, varios trabajos recientes describen la caracterización de enzimas microbianas involucradas en las rutas de degradación ii), iv) y iv.i) (Fig. 1) que involucran la escisión del núcleo estrogénico de 4-OHE1. Sin embargo, en estos ejemplos una deshidrogenación inicial del anillo D en E2 y la conversión en E1 es siempre el primer paso (Fig. 1)24,26,27,28.

Finalmente, en este trabajo, los experimentos de bioconversión de células completas destacaron algunas ventajas interesantes en el uso de células completas recombinantes, sobre bacterias nativas, como biocatalizadores. Varios trabajos reportaron la biodegradación de estrógenos usando diferentes cepas ambientales o consorcios35. Aunque este enfoque podría ser muy beneficioso para fines de biorremediación, aquí destacamos las ventajas de usar cepas recombinantes para mejorar la biodegradación de compuestos específicos. De hecho, las células enteras de E. coli en las que se indujo la expresión recombinante de PP00124 fueron capaces de degradar eficazmente 4-OHE2 con alta eficiencia y en poco tiempo, lo que sugiere que el protocolo de bioconversión de células enteras podría preverse como un enfoque eficaz para evitar los pasos de purificación de proteínas que consumen tiempo y dinero. Además, se podría formular la hipótesis de un enfoque similar para la degradación de diferentes compuestos recalcitrantes que todavía se metabolizan mal a partir de cepas y consorcios ambientales de tipo salvaje.

Los cultivos bacterianos, las purificaciones de plásmidos y las transformaciones se realizaron de acuerdo con Sambrook et al.42. La concentración de proteínas se midió con el ensayo de proteínas Bio-Rad usando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. La electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) se llevó a cabo usando técnicas estándar y se tiñó con azul brillante de Coomassie G-250. Los patrones de 4-OHE2 y 2-OHE2 se adquirieron de Cayman Chemicals. Se siguió el crecimiento bacteriano midiendo la densidad óptica a 600 nm, OD/mL, denominada OD600. Se preparó medio rico en LB (medio de Luria Bertani) como se describe en Sambrook et al.42.

El plásmido pET22b(+) que contiene las orfs que codifican las proteínas PP28735, PP26077, PP00124 y PP00193 se utilizó para transformar células competentes de E. coli BL21(DE3) según Sambrook et al.42. Las colonias se inocularon en un tubo Falcon estéril de 50 ml que contenía 12,5 ml de medio LB suplementado con 100 µg/ml de ampicilina (amp). Los cultivos se incubaron a 37 °C en agitación constante hasta ~ 0,7 OD600. El preinóculo se diluyó 1:50 en 500 mL de LB/amp y se incubó con agitación constante a 37 °C hasta una DO600 de 0,6–0,7. La expresión se indujo añadiendo Fe(SO4)2(NH4)2 0,1 mM e IPTG entre 0,025 y 0,4 mM. El crecimiento continuó a 28 ° C o 37 ° C durante 2 o 4 h adicionales (Figura complementaria S2). Luego, las células se recolectaron por centrifugación (5524 × g durante 15 min a 4 °C) y los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C hasta que se necesitaron. La pasta celular obtenida de experimentos de expresión a gran escala se suspendió primero en tampón de lisis (Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, etanol al 10 %, glicerol al 30 %, DTT 5 mM y Fe(SO4)2(NH4)2 0,1 mM) a una concentración final de 50–100 OD600, y luego interrumpida por sonicación (20 veces para un ciclo de 15″ encendido y 55″ apagado, en hielo). Las fracciones solubles e insolubles de los cultivos inducidos se separaron mediante centrifugación a 22.100 × g durante 30 min a 4 °C y el sobrenadante se recogió y filtró a través de una membrana Millipore de PVDF de 0,45 μm.

Las proteínas PP26077, PP00124 y PP00193 se purificaron por lotes en resina de intercambio aniónico Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotech). Las muestras se incubaron 1 h con la resina en agitación constante a 4 °C, y las proteínas no unidas se eliminaron mediante centrifugación y tres lavados posteriores en tampón de lisis. La elución se realizó mediante un método por etapas en tampón de lisis que contenía NaCl 0,2, 0,4, 0,6 y 0,8 M. La resina se incubó 3 veces con cada solución durante 10 min bajo agitación constante a 4 °C. Las fracciones se recogieron por centrifugación y se almacenaron a -80 °C en atmósfera de nitrógeno. La pureza de las muestras se evaluó mediante SDS-PAGE. La presencia de ERCD recombinantes activos se detectó realizando el ensayo enzimático en 2,3-DHBP, como se describe a continuación. Además, todas las manipulaciones se realizaron bajo un flujo constante de nitrógeno para evitar una oxidación excesiva del hierro.

La proteína PP28735 se purificó mediante cromatografía en columna Q Sepharose FF. La elución de la proteína se llevó a cabo mediante un gradiente lineal de NaCl de 0 a 0,5 M en tampón de lisis a un caudal de 15 ml/h. La presencia de la ERCD recombinante activa se detectó realizando el ensayo enzimático en 2,3-DHBP. Las fracciones relevantes se analizaron mediante SDS-PAGE, se agruparon, se purgaron con nitrógeno y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

El contenido de hierro total se determinó colorimétricamente por complejación con Ferene S43 (3-(2-piridil)-5,6-bis[2-(5-furilsulfónico ácido)]-1,2,4-triazina, sal disódica), un agente quelante específico del Fe (II), que da lugar a la formación de un complejo coloreado cuya absorción se mide a una longitud de onda de 593 nm (ε593nm = 34,32 mM−1 cm−1). Para determinar la cantidad total de Fe [Fe (II) + Fe (III)], el ensayo se realizó también en presencia de vitamina C (concentración final 6 mM) para reducir Fe (III) a Fe (II). La cantidad de Fe (III) se calculó restando la cantidad de Fe (II) (medida en ausencia de vitamina C) de la cantidad total de Fe (medida en presencia de vitamina C). Las curvas de calibración para Fe (II) y Fe (III) se obtuvieron analizando cantidades conocidas (5–20 nmol) de Fe(NH4)2(SO4)2 y FeCl3, respectivamente. Dado que el paso cromatográfico requería la presencia de Fe (II) y DTT en el tampón de elución, fue necesario eliminar estos reactivos. Para ello, se realizó una cromatografía de exclusión molecular a baja presión en una columna preempaquetada PD-10 de Pharmacia (tamaño de columna: 0,8 cm × 5 cm con un volumen total de resina igual a 9,1 mL). La elución se llevó a cabo a temperatura ambiente en tampón Tris/HCl 50 mM pH 7,5, glicerol al 10%, NaCl 0,2 M.

La actividad de los ERCD se determinó a 25 °C midiendo su actividad específica (SA) usando CAT, 3-MC, 4-MC y 2,3-DHBP. Las soluciones madre de sustratos se prepararon 100 mM en agua para CAT, 3MC, 4MC y en dimetilformaldehído (DMF) para 2,3-DHBP. Su concentración se midió espectrofotométricamente en HCl 10 mM. Las muestras se analizaron a 25 °C en un volumen total de 1 ml de Tris/HCl 50 mM pH 7,5 que contenía sustrato a una concentración final de 1 mM. Las reacciones se iniciaron agregando cantidades variables de células recombinantes completas (0,03 a 0,3 OD600), fracciones solubles de lisados ​​celulares (0,03 a 0,3 OD600) o proteínas purificadas (1–50 µg) y se monitorearon espectrofotométricamente a lo largo del tiempo durante 3 minutos después de la formación de los correspondientes semialdehídos cis-mucónicos. La absorbancia se registró en el λmax de cada producto de sustrato (Tabla complementaria S2) cada 5 s. El λmax y los coeficientes de extinción (ε) utilizados para calcular la cantidad de cada producto obtenido se informaron en la Tabla complementaria S2. Una unidad de enzima se definió como la cantidad de enzima que libera un µmol de semialdehído cis-mucónico por minuto a 25 °C.

Las soluciones madre de sustratos se prepararon 100 mM en etanol. Su concentración se midió espectrofotométricamente en HCl 10 mM registrando la absorbancia en su λmax correspondiente a 276 nm y 286 nm para 4-OHE2 y 2-OHE2, respectivamente. Se usaron ε de 3-MC y 4-MC (Tabla complementaria S2) para 4-OHE2 y 2-OHE2, respectivamente. Los ensayos de actividad se llevaron a cabo en tampón Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, a 25 °C, con cantidades variables de células recombinantes completas que contenían ERCD (0,03 a 0,3 OD600), fracciones solubles de lisados ​​celulares o proteínas purificadas (1–50 µg , 30–400 mU2,3-DHBP), en presencia de 100 µM y 200 µM de 4-OHE2 y 2-OHE2, respectivamente, que representan sus límites de solubilidad en tampones acuosos.

Los experimentos de curso de tiempo de conversión de 4-OHE2 (100 µM) y 2-OHE2 (200 µM) se llevaron a cabo en el espectrofotómetro Varian Cary 100 UV-Vis. Las reacciones se iniciaron agregando los ERCD purificados (1–50 µg) y la formación de los productos se controló a pH 7,5 mediante el programa Scanning Kinetics en un rango de longitud de onda de 230 a 500 nm. La conversión de 4-OHE2 (λmax 285 nm) a semialdehído (λmax 298 nm) fue seguida por el registro de los espectros de absorción durante 4–8 min, a 25 °C. Al final de la escisión con 4OHE2, para convertir el semialdehído en la forma dianiónica amarilla (λmax 417 nm, a pH alcalino), se añadió NaOH (concentración final 100 mM) y se registró el espectro.

Además, para simplificar la identificación del sustrato 4-OHE2 y su producto mediante análisis HPLC, se añadió ácido fórmico al 1% a la reacción que contenía el semialdehído obtenido después de 10 min de incubación como se ha descrito anteriormente y se registró el espectro. Se encontraron valores de λmax de 280 y 305 nm para 4-OHE2 y su semialdehído, respectivamente, a pH ácido.

Para permitir la determinación de la actividad específica y las constantes cinéticas y cuantificar la producción de semialdehído por los ERCD a pH 7,5 (durante el tiempo de incubación de la reacción) y a pH 12 (al final de la reacción), el ε para el producto semialdehído 4-OHE2 a pH 7,5 y pH 12 se determinaron experimentalmente. En resumen, la conversión total de diferentes concentraciones de sustrato de estradiol (20 µM, 40 µM, 60 µM, 80 µM y 100 µM) se llevó a cabo utilizando 400 mU2,3DHBP de ERCD PP00124 en tampón Tris/HCl 50 mM, pH 7,5. Los espectros se registraron mediante el programa Scanning Kinetics como se describe anteriormente y se determinaron los coeficientes de extinción (ε298 nm a pH 7,5 = 9,1 mM−1 cm−1; ε417 nm a pH 12 = 21,78 mM−1 cm−1) en el longitudes de onda máximas. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que libera un µmol de semialdehído por minuto a 25 °C.

Los parámetros cinéticos se obtuvieron en tampón Tris/HCl 50 mM pH 7,5 utilizando entre 1 y 50 µg de proteínas purificadas y CAT, 3-MC, 4-MC y 2,3-DHBP como sustratos en el rango de 0,5 µM–16 mM. Se utilizó 4-OHE2 en concentraciones finales que oscilaban entre 0,5 y 100 µM (límite de solubilidad en agua). Las reacciones se monitorearon durante 3 min a 25 °C a 375 nm (CAT; ε375nm = 33 mM−1 cm−1), 388 nm (3-MC; ε388nm = 13,8 mM−1 cm−1), 382 nm (4- MC; ε382nm = 28,1 mM−1 cm−1), 434 nm (2,3-DHBP; ε434nm = 13,2 mM−1 cm−1) y 298 nm (4-OHE2; ε298nm = 9,1 mM−1 cm−1) . Los coeficientes de extinción utilizados se enumeraron en la Tabla complementaria S2. Todos los parámetros cinéticos se determinaron mediante una curva de regresión no lineal utilizando GraphPad Prism 7.

La conversión enzimática de 4-OHE2 y 2-OHE2 se realizó utilizando la enzima PP00124. Las reacciones se llevaron a cabo como se describe en el párrafo anterior. Brevemente, el ensayo se llevó a cabo en 1 ml de tampón Tris/HCl 50 mM pH 7,5 a 25 °C, en presencia de 4-OHE2 y 2-OHE2 100 µM y 200 µM, respectivamente. Se recogió una alícuota (0,5 ml) de las mezclas de reacción antes de añadir la enzima y se añadió una concentración final del 1 % de ácido fórmico. Las muestras se diluyeron 100 veces, se centrifugaron a 22 100 × g durante 5 min y se procesaron en HPLC como control negativo (reacciones en blanco). Luego, se añadió lisado celular PP00124 a las muestras para iniciar las reacciones. La formación del producto se siguió espectrofotométricamente durante un tiempo total de 15 min, entre 230 y 500 nm, registrando espectros cada 5 s. Posteriormente, las reacciones se detuvieron mediante la adición de ácido fórmico al 1%. Los espectros de semialdehídos se registraron a pH ácido y las muestras se diluyeron 100 veces, se centrifugaron a 22 100 × g durante 5 min y se analizaron por HPLC.

Se utilizó un HPLC de bomba binaria Waters 1525 con un detector de matriz de fotodiodos (Waters 2996) equipado con una columna de ultraesfera C18 (Beckman Coulter 4,6 mm × 25 cm). Se inyectaron doscientos microlitros de cada muestra. Se realizó una elución en gradiente lineal a un caudal de 1 mL/min, utilizando una fase móvil compuesta por ácido fórmico al 0,1% en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0,1% en metanol (disolvente B). La elución de 4-OHE2, 2-OHE2 y los productos correspondientes se llevó a cabo utilizando el siguiente gradiente: elución isocrática al 10 % de disolvente B durante 3 min, del 10 al 50 % de disolvente B en 3 min, del 50 al 75 % de disolvente B en 15 min, del 75 al 90 % de disolvente B en 1 min, elución isocrática al 90 % de disolvente B durante 1 min, del 90 al 10 % de disolvente B en 1 min, elución isocrática al 10 % de disolvente B durante 3 min. Los espectros del disolvente de elución se registraron con el detector de matriz de fotodiodos entre 230 y 400 nm. Se generaron cromatogramas monitoreando la absorbancia a 280 nm, ya que tanto los sustratos como el producto muestran absorción a esa longitud de onda.

Finalmente, también se recolectaron alícuotas de las mezclas de reacción en blanco y de punto final para el análisis LC-MS/MS. Las alícuotas se centrifugaron a 22.100 × g durante 30 s. Se recogieron los sobrenadantes y se añadió ácido fórmico a una concentración final del 1 % para detener la reacción; Luego, las muestras se almacenaron a -20 ° C durante la noche. Luego se realizó una extracción líquido-líquido con acetato de etilo para purificar 4-OHE2 y los productos de reacción. Se añadieron cinco volúmenes de acetato de etilo a las muestras y se agitaron durante 20 s. Las muestras se centrifugaron a 22.100 × g durante 10 min y se recogió la fase orgánica. A continuación, la fase acuosa se sometió a una segunda extracción líquido-líquido con el mismo protocolo. Todas las fases orgánicas se secaron al vacío y se suspendieron en 60 μL de MeOH al 50 % para el análisis LC-MS/MS.

Se indujo la expresión recombinante de la proteína PP00124 como se describió previamente. También se cultivaron como control negativo cultivos de doscientos cincuenta mililitros de E. coli BL21(DE3) transformada con plásmido vacío pET22b(+). Después de 2 h de inducción, las células se recogieron por centrifugación y se suspendieron a 5 DO600 en medio mínimo (fosfato de potasio 50 mM, pH 7,0) suplementado con glucosa al 0,4 % y Fe(NH4)2(SO4)2 1 mM. Finalmente, se añadió 4-OHE2 100 μM al medio y las células se incubaron a 37 °C con agitación constante. Se recogieron alícuotas de 500 μl en los siguientes momentos: 0, 1, 2, 3,5, 5, 7,5, 10, 15, 30, 60 y 120 min. Las alícuotas se centrifugaron a 22.100 × g durante 30 s. Se recogieron los sobrenadantes y se añadió ácido fórmico a una concentración final del 1 % para detener la reacción; Luego, las muestras se almacenaron a -20 ° C durante la noche. Luego se realizó una extracción líquido-líquido con acetato de etilo para purificar la 4-OHE2 y los productos de reacción obtenidos, siguiendo el mismo procedimiento descrito en el párrafo anterior; Se añadieron cinco volúmenes de acetato de etilo a las muestras y se agitaron durante 20 s. Las muestras se centrifugaron a 22.100 × g durante 10 min y se recogió la fase orgánica. A continuación, la fase acuosa se sometió a una segunda extracción líquido-líquido con el mismo protocolo. Todas las fases orgánicas se secaron al vacío y se suspendieron en 60 μL de MeOH al 50 % para el análisis LC-MS/MS.

Los análisis cuali-cuantitativos de LC-MS/MS de las mezclas de reacción de diferentes experimentos de bioconversión se realizaron en un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap ESI (Thermo-Fisher Scientific) junto con un sistema Accela UHPLC (Thermo-Fisher Scientific). La separación cromatográfica se realizó en una columna Kinetex C18 (150 × 2 mm, 2,6 μm) (Phenomenex) utilizando ácido fórmico acuoso al 0,1 % (A) y metanol (B) como fases móviles, un gradiente lineal de 5 a 30 % de B en 10 min y un caudal de 200 μL/min. Los espectros de masa completa (MS1) se adquirieron en modo de iones negativos de alta resolución, en el rango m/z de 125 a 500. Los espectros de MS/MS se adquirieron para el ion más intenso detectado en los espectros de MS1 (modo de exploración dependiente), en -trampa de fragmentación.

La abundancia relativa de 4-OHE2 y de los productos de reacción se estimó generando un cromatograma de iones extraídos para cada compuesto (m/z 287,2 para 4-OHE2, para 323,2 para el producto de metaescisión de 4-OHE2 y 305,2 para el producto de ciclación de 4-OHE2 (hipotético) .

Para cada compuesto, se supuso que el área de pico más alta registrada era el 100 % del área. El % de área en los otros puntos de tiempo se calculó en comparación con el área del pico más alto. Las abundancias relativas obtenidas en los diferentes puntos de tiempo se graficaron en función del tiempo.

Las muestras se analizaron por triplicado y los datos se informaron como la media de las áreas medidas.

Las secuencias de proteínas ERCD están disponibles en la base de datos UniProt. Los números de acceso son los siguientes: F6IHX1, F6ID78, F6IHP2 y F6IHN4 para las proteínas PP28735, PP26077, PP00124 y PP00193, respectivamente.

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Descargar referencias

Departamento de Medicina, Cirugía y Odontología "Scuola Medica Salernitana", Universidad de Salerno, Salerno, Italia

Francesca Mensitieri, Fabrizio Dal Piaz, Bruno Charlier y Viviana Izzo

Departamento de Biología, Universidad Federico II de Nápoles, Campus Universitario de Monte Sant'Angelo, Via Cinthia 4, Nápoles, Italia

Andrea Bosso, Eugenio Notomista y Valeria Cafaro

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FM y VC conceptualizaron el trabajo e hicieron la mayor parte del trabajo experimental. FDP y BC realizaron análisis de HPLC y HPLC-MS/MS. AB realizó análisis de proteínas. VC, EN, VI y FDP revisaron los experimentos y contribuyeron a la interpretación de datos críticos y revisaron el trabajo. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Valeria Cafaro.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Mensitieri, F., Bosso, A., Dal Piaz, F. et al. Bioconversión de 4-hidroxiestradiol por dioxigenasas de escisión de anillo extradiol de Novosphingobium sp. PP1Y. Informe científico 13, 1835 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28908-2

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Recibido: 07 julio 2022

Aceptado: 27 de enero de 2023

Publicado: 01 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28908-2

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