β fúngico

Mar 14, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 576 (2023) Citar este artículo

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La microbiota intestinal humana (HGM, por sus siglas en inglés) se compone de una red muy compleja de microorganismos que interactúan con el huésped, lo que afecta su salud y bienestar. El β-glucano se ha establecido como un polisacárido de la dieta que favorece el crecimiento de determinadas bacterias intestinales, incluidos los miembros de los géneros Bacteroides y Bifidobacterium, este último considerado como una bacteria beneficiosa o probiótica. Sin embargo, el mecanismo exacto que sustenta el metabolismo del β-glucano por parte de los comensales intestinales no se comprende por completo. Mostramos que la micoproteína representa una excelente fuente de β-glucano, que es consumido por ciertas especies de Bacteroides como degradadores primarios, como Bacteroides cellulosilyticus WH2. Esta última bacteria emplea dos enzimas extracelulares de acción endo, pertenecientes a las familias de glucósidos hidrolasas 30 y 157, para degradar el β-glucano derivado de micoproteínas, liberando así oligosacáridos en el medio de crecimiento. Estos oligosacáridos liberados pueden, a su vez, ser utilizados por otros microbios intestinales, como Bifidobacterium y Lactiplantibacillus, que actúan como degradadores secundarios. Utilizamos un enfoque de alimentación cruzada para rastrear cómo ambas especies pueden crecer en cocultivo.

La microbiota intestinal humana (HGM) es un ecosistema complejo de microbios, que supuestamente tienen un impacto beneficioso en la salud humana. Los carbohidratos de la dieta representan la principal fuente de energía para el cuerpo humano, aunque carecemos de las capacidades enzimáticas para degradar la mayoría de estos glicanos nosotros mismos1. Sin embargo, la HGM codifica un arsenal de enzimas activas de carbohidratos (CAZYmes) capaces de catabolizar dichos carbohidratos1. Los productos metabólicos finales de la fermentación de glicanos por parte de HGM son en su mayoría SCFA, como propionato, acetato y butirato, que tienen una variedad de efectos beneficiosos en el huésped humano. El desequilibrio en la composición de la comunidad microbiana intestinal, a veces denominado disbiosis, es una característica de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), el cáncer colorrectal, la obesidad, las infecciones por Clostridioides difficile y, potencialmente, una amplia gama de otras afecciones2,3,4.

Como se indicó anteriormente, el HGM es una red compleja de microbios que representan aproximadamente 10 billones de bacterias5. No obstante, solo dos filos son dominantes en esta intrincada comunidad bacteriana, es decir, Bacteroidota y Bacillota, complementados con representantes de varios filos menores, como Actinomycetota o Verrucomicrobiota. Se ha demostrado que varios miembros del género Bacteroides contienen grupos específicos de genes co-regulados que metabolizan un glucano específico y que se denominan loci de utilización de polisacáridos (singular: PUL, plural: PUL). Un PUL dado contiene los genes necesarios para detectar, transportar y degradar un glicano en particular6,7,8. Por ejemplo, el genoma de Bacteroides thetaiotaomicron (Ba. thetaiotaomicron VPI-5482, BT) alberga 96 PUL diferentes, según la base de datos CAZY9,10, mientras que otra especie de Bacteroides, Ba. ovatus ATCC8483 (Bacova), abarca 115 PUL diferentes. En general, una glucósido hidrolasa (GH) o polisacárido liasa (PL) asociada a la superficie celular inicia la degradación de polisacáridos extracelulares, lo que permite la liberación de los oligosacáridos resultantes en el medio de cultivo11,12,13,14,15,16,17.

Los miembros del género Bifidobacterium son particularmente abundantes en los lactantes amamantados a término, donde se cree que ejercen importantes efectos beneficiosos18,19,20,21. El predominio de estas bacterias en este nicho se atribuye, al menos en parte, a su capacidad para metabolizar (en particular) los oligosacáridos de la leche humana (HMO) como única fuente de carbono y energía22. Diferentes especies de bifidobacterias tienen preferencias particulares de consumo de HMO, por ejemplo, cepas de Bi. breve y Bi. longum son conocidos por internalizar y metabolizar la lacto-N-tetraosa23,24,25,26, mientras que Bi. catenulatum subesp. kashiwanohense puede utilizar 2-fucosilactosa como fuente de carbono19,27. La cepa prototípica Bi. Se ha demostrado que breve UCC2003 metaboliza varios HMO y otros poli/oligosacáridos de la dieta, ya sea solo23,28 o mediante la alimentación cruzada con otros miembros de la microbiota intestinal; ejemplos de dichos sustratos sacáridos son mucina29,30, arabinogalactano/galactano31,32 y sialilactosa20.

El β-glucano es un glicano complejo que se ha explorado como potencial prebiótico y que es particularmente abundante en las paredes celulares de cereales y hongos13,33,34,35,36. El β-glucano derivado de cereales, con un enlace mixto β-1,3/1,4 definido (Fig. 1A), se ha empleado para comprender los mecanismos moleculares por los cuales ciertas especies de Bacteroides pueden detectar, internalizar y degradar este polímero13,34,35,36. Por ejemplo, Bacova emplea un PUL con una glucósido hidrolasa 16 (GH16) asociada a la superficie celular y una GH3 periplásmica para catalizar la degradación de este β-glucano de cereal de enlace mixto34,35,36.

A Estructuras de hongos (micoproteína), levadura, laminarina, cebada y β-glucano de pustulano. B Crecimiento Bacteroides ovatus, DSM, WH2 y BT en micoproteína medido en un lector de placas. Todos los crecimientos se han producido en 3 repeticiones independientes diferentes (n = 3). C Número de proteínas expresadas por Baccell WH2 en el uso de β-glucano de Mycoprotein identificado por análisis de proteoma. La proteómica se ha producido en 3 réplicas independientes diferentes (n = 3). D Estructura de GUL en Baccell WH2 (GUL-1 y GUL-2) y BT actuando sobre micoproteínas, levaduras y pústulas.

Además, un Ba. uniformis ATCC8492 PUL, que participa en el metabolismo de los β-1,3-glucanos relacionados presentes en la levadura y la laminarina de glucano de algas (Fig. 1A), es responsable de la degradación inicial en la superficie celular por una glucósido hidrolasa 16 (GH16 ) y un GH158, y un GH313 periplásmico que actúa posteriormente. Además, Ba. uniformis cepa JCM13288 puede degradar laminarina, pustulano y porfirano β-glucanos, empleando dos PUL que codifican GH16, GH30, GH158 y GH3, y compartiendo oligosacáridos con otros miembros de la microbiota intestinal, lo que posiblemente apoya la homeostasis intestinal37.

Otro tipo de β-1,6-glucano, que se encuentra como glucano lineal en el liquen Lasallia pustulata y como glucano lineal pero entrecruzado con otros componentes de la pared celular en la levadura Saccharomyces cerevisiae o en el hongo almendra (Agaricus blazei), es utilizado por BT a través de un PUL que involucra solo un GH30_3 ubicado en la superficie y un GH317,33 periplásmico. Poco se sabe sobre la degradación del β-glucano fúngico, como el derivado de la micoproteína producida por Fusarium venenatum, un hongo empleado por Quorn® como ingrediente alimentario funcional38. La estructura química de este β-glucano consiste en un esqueleto lineal de β-1,3-glucano que lleva cadenas laterales de β-1,6-glucanos, lo que lo distingue del β-glucano de cereal o del β-glucano/laminarina de levadura. donde los enlaces de la cadena central o de la cadena lateral son diferentes, respectivamente13,34,39 (Fig. 1A).

Actualmente, solo hay unas pocas publicaciones que describen los beneficios para la salud provocados por Bacteroidota (de hecho, algunas especies se consideran patógenos oportunistas)40,41. Sin embargo, se puede argumentar que ciertas especies de Bacteroides representan degradadores primarios de glicanos que permiten la alimentación cruzada de carbohidratos con otros miembros beneficiosos de la microbiota, como las bifidobacterias (que no se sabe que puedan metabolizar el β-glucano directamente). Tales interacciones metabólicas ocurren entre BT y Bi. longum, y entre Ba. cellulosilyticus DSMZ14838 (Baccell DSMZ) y Bi. breve UCC2003 cuando se cultiva en proteína de arabinogalactano de alerce (AGP) como única fuente de carbono31,42,43. Se han establecido otras interacciones tróficas entre varias especies de Bacteroides y Bifidobacterium39,44,45,46,47,48, pero aún no se han definido para la micoproteína β-glucano.

En el estudio actual, realizamos una caracterización molecular de la micoproteína y la degradación de β-glucano de levadura por Bacova, Ba. cellulosilyticus WH2 (Baccell WH2) y BT, destacando la arquitectura PUL de estos Bacteroides spp. Además, descubrimos interacciones de alimentación cruzada entre Bacteroides, como degradador principal, y ciertas especies de Bifidobacterium y Lactiplantibacillus, que actúan como degradadores secundarios de β-glucano fúngico derivado de micoproteínas.

Ciertos miembros del género Bacteroides se han establecido como fermentadores generalistas de enlace mixto (cebada) y levadura β-glucano13,34,35,36,37. Los genomas de estas especies de Bacteroides abarcan varios PUL (aquí denominados loci de utilización de glucano o GUL) para degradar este glucano complejo, empleando glucósido hidrolasas codificadas para este proceso metabólico. Para evaluar la capacidad de las especies de Bacteroides para usar β-glucano derivado de hongos, extrajimos este polisacárido de la micoproteína de Fusarium venenatum (ver "Materiales y métodos") y examinamos las 23 especies de Bacteroidetes asociadas al intestino más prominentes por su capacidad de crecer. en este glicano así como en el β-glucano derivado de levadura (Tabla S1). En las condiciones (anaeróbicas) utilizadas, Ba. xilanisolventes, Ba. intestinalis, Bacova, Ba. fragilis, Ba. finegoldii, Ba. vulgato, Ba. uniformis, BT (crecimiento parcial), Dysgonomonas gadei, D. mossii y dos cepas de Baccell (Baccell WH2 y Baccell DSMZ) metabolizaron el β-glucano derivado de la micoproteína. Además, Ba. vulgato, Ba. uniformis, Bacova, BT, Dysgonomonas gadei, D. mossii y ambas cepas de Baccell pudieron utilizar β-glucano de levadura. Se ha demostrado previamente que Bacova también crece en β-glucano derivado de cebada34,35, lo que demuestra la amplia capacidad de esta especie para fermentar β-glucanos de diferentes fuentes y estructuras químicas (Fig. 1A). La Figura 1B muestra el perfil de crecimiento de Baccell WH2, Baccell DSMZ, BT y Bacova en β-glucano de micoproteína (Fig. 1B). Además de estos experimentos de crecimiento, evaluamos el crecimiento de varias cepas de Bifidobacterium en β-glucano derivado de micoproteínas, lo que muestra claramente la falta de capacidad de estas cepas para usar esta fuente de carbono compleja (Fig. S1A).

Para caracterizar aún más el crecimiento de cepas de Bacteroides seleccionadas en β-glucanos particulares, realizamos análisis de proteómica en Baccell WH2 cuando se cultivan en glucosa (que actúa como referencia) o β-glucano fúngico derivado de micoproteínas como fuentes de carbono. Comparamos los datos de proteoma generados de esta bacteria cuando se cultiva en cualquiera de estas fuentes de carbono para identificar proteínas que exhiben una mayor expresión cuando la cepa se cultiva en el polímero complejo. Como se muestra en la Fig. 1C, este análisis reveló que todas las proteínas codificadas por dos GUL asignados (denominados aquí como GUL-1 y GUL-2 y que representan las etiquetas de locus BcellWH2_01929-BcellWH2_01932 y BcellWH2_02537-BcellWH2_02542, respectivamente, ver Fig. 1D) exhiben un aumento expresión cuando Baccell WH2 se cultivó en el metabolismo de β-glucano fúngico derivado de micoproteínas (en comparación con el crecimiento en glucosa). Se predijo que GUL-1 codificaría dos enzimas GH3 (BcellWH2_01926 y BcellWH2_01927) y un miembro GH157 (BcellWH2_01931), mientras que las proteínas codificadas por las etiquetas de locus BcellWH2_01928 y BcellWH2_01929 representan el par similar a SusC/D que se predijo que estaría involucrado en el sustrato (polisacárido) unión y reconocimiento en la superficie de la célula bacteriana (Fig. 1D). Además, se prevé que BcellWH2_01932 represente el sistema de detección del sistema híbrido de dos componentes (HTCS) que controla la regulación transcripcional de GUL-1. GUL-2 codifica una GH30_3 (BcellWH2_02537, una endo-β-1,6-glucanasa prevista según la base de datos CAZY), una GH2 (BcellWH2_02541) y una proteína sin función conocida (BcellWH2_02538). Además de estas proteínas, BcellWH2_02539 y BcellWH2_02540 representan el par SusC/D predicho en GUL2 (Fig. 1D). Para confirmar los datos proteómicos, cultivamos Baccell WH2 a exponencial medio y realizamos RT-qPCR en pares de SusC/D seleccionados identificados en los GUL descritos anteriormente (Fig. S1B). Además, también usamos este enfoque con BT y Bacova en los pares SusC/D identificados en función de los patrones de expresión diferencial cuando estas dos cepas se habían cultivado en beta-glucano de pustulan17,34,35 (Fig. S1B). Dado que observamos una expresión diferencial basada en RT-qPCR, parece que sus GUL correspondientes, que son sustancialmente diferentes de las de Baccell WH2 en términos de su estructura y contenido genético, también son responsables del crecimiento en el β-glucano fúngico. La Figura 1D y S1C muestran la arquitectura GUL de BT, Bacova y Baccell WH2, y las funciones predichas relacionadas con la regulación GUL, la degradación de β-glucano y la ingesta de oligosacáridos asociados. BT y Baccell WH2 emplean una arquitectura GUL diferente para la utilización de β-glucano fúngico (Fig. 1D), en comparación con Bacova, que según su perfil de expresión parece usar el mismo GUL para β-glucano fúngico y de cebada Figs. S1B y S1C.

Como se indicó anteriormente, BT, Baccell WH2 y Bacova pueden metabolizar el β-glucano fúngico. Según la qPCR realizada en BT que crece en un medio que contiene β-glucano fúngico o pustulano, esta bacteria parece emplear el mismo GUL para cualquiera de estas dos fuentes de carbono17 (BT3309-BT3314, Fig. 1D y S1B). De acuerdo con los datos de qPCR obtenidos cuando Bacova crece en un medio suplementado con cebada o β-glucano fúngico (Fig. S1B), se demostró que la bacteria emplea el mismo GUL para cualquiera de estas fuentes de carbono, lo que contrasta con lo que descubrimos para Baccell WH2, ya que esta bacteria parece emplear distintos GUL para deconstruir el β-glucano fúngico o de cebada (Fig. 1D y S1C)49.

Tras nuestra observación de que ciertas proteínas codificadas por GUL-1 y GUL-2 de Baccell WH2, y sus correspondientes genes presentes en GUL-1 y GUL-2, provocan una mayor expresión cuando crecen en β-glucano fúngico, queríamos confirmar su participación en este proceso metabólico. Para este propósito, expresamos de forma recombinante las enzimas que representan las actividades putativas de GH157, GH30_3 y GH3 (Baccell WH2_01926) de GUL1/GUL2 para diseccionar completamente el mecanismo de degradación de esta compleja fuente de carbono en la dieta. Para ello, incubamos las proteínas expresadas con β-glucano fúngico y revelamos los posibles productos de degradación mediante cromatografía HPLC. Más específicamente, la figura 2A muestra los cromatogramas de HPLC de BcellWH2_01931 y BcellWH2_02537 (que representan las actividades previstas de GH157 y GH30_3, respectivamente) que actúan sobre el β-glucano fúngico.

Todos los experimentos de HPLC se produjeron en 3 réplicas independientes diferentes (n = 3). Evolución temporal de BcellWH2_01931 (GH157) con micoproteína β-glucano. B Evolución temporal de BcellWH2_01931 (GH157) con β-1,3-glucano lineal. C Evolución temporal de BcellWH2_02537 (GH30_3) en la micoproteína β-glucano. Evolución temporal de BcellWH2_02537 (GH30_3) con pustulano. E Curso temporal de BcellWH2_01931 (GH157) y BcellWH2_02537 (GH30_3) juntos en β-1,3-glucano lineal. F HPLC de BT3312 (GH30_3) en micoproteína β-glucano. G HPLC de BT3314 (GH3) en micoproteína β-glucano.

Los datos presentados en las Fig. 2A y 2B confirmaron que BcellWH2_01931 actúa sobre el β-glucano fúngico (Fig. 2A) y el β-1,3-glucano lineal de Euglena glacialis (Fig. 2B) liberando inicialmente penta y trisacáridos, que son convertido en disacáridos y glucosa tras una incubación más prolongada (16 h). Sin embargo, no encontramos ninguna actividad cuando la enzima se incubó con pustulano. La Tabla 1 enumera los parámetros cinéticos (kcat/Km) de esta proteína que actúa sobre cualquiera de los sustratos.

Para validar la predicción de que estas enzimas están involucradas en el metabolismo del β-glucano fúngico, realizamos un análisis de ubicación de proteínas mediante LipoP50, lo que indica que BcellWH2_01931 (GH157) y BcellWH2_02537 (GH30_3) están ubicados en la superficie celular de Baccell WH2. Además, de acuerdo con la base de datos CAZY, se anticipó que la enzima GH157 actuaría como una endo-β-1,3-glucanasa, mientras que se esperaba que la enzima GH30_3 poseyera actividad endo-β-1,6-glucanasa como se informó para otros miembros de esta familia CAZY17. Al igual que GH157, GH30_3 expresado y purificado de forma recombinante se incubó con β-glucano fúngico, β-1,3-glucano lineal y pustulano (β-1,6-glucano lineal), seguido de análisis por HPLC. Las Figuras 2C y 2D muestran los resultados de cromatografía asociados para este experimento de incubación, lo que confirma la actividad de β-1,6-glucanasa con β-glucano fúngico (Fig. 2C) y pustulano (Fig. 2D). Además, GH30_3 no mostró ninguna actividad contra el β-1,3-glucano lineal. La Tabla 1 muestra los parámetros catalíticos de esta proteína medidos mediante ensayos de DNSA con β-glucano fúngico y pustulano. BcellWH2_02537 mostró parámetros de actividad para el β-glucano de Fusarium venenatum similares a los obtenidos para el pustulano (kcat/Km de 2512 ± 28 y 1968 ± 17 mg ml−1 min−1) lo que sugiere que la enzima no requiere interacciones con el β- Esqueleto de (1,3)-glucano. Además, se demostró que BcellWH2_02537 solo exhibe actividad en oligosacáridos más grandes que la β-(1,6)-glucotriosa, lo que indica que, como en BT3312, la enzima tiene 3 subsitios en el sitio activo (nomenclatura establecida por Davies et al.)51.

Finalmente, para comprender completamente cómo Baccell WH2 metaboliza el β-glucano derivado de micoproteínas, expresamos de forma recombinante las enzimas GH3 y GH2 predichas (como se especifica en BcellWH2_01926 y BcellWH2_02541, respectivamente), lo que demuestra que ambos pueden actuar sobre los diferentes oligosacáridos producidos. por la acción de las enzimas GH157 y GH30_3. BcellWH2_01926 (GH3) fue capaz de degradar los β-1,6-glucooligosacáridos liberados por GH30_3, mientras que la enzima GH2 (BcellWH2_02541) demostró actuar sobre los β-1,3-glucooligosacáridos (glucobiosa y glucotriosa), liberando en ambos casos glucosa como el producto final, que confirma el mecanismo de exo-acción de estas enzimas (BcellWH2_01926 y BcellWH2_02541). La Tabla 1 también muestra los parámetros catalíticos de estas dos exoglucosidasas, lo que destaca que la actividad de la enzima GH2 es similar para la β-1,3-glucobiosa y la β-1,3-glucotriosa, lo que sugiere 2 subsitios en el sitio activo.

En el caso de BT, la arquitectura GUL es más simple que la observada para Baccell WH2 (Fig. 1D). Para la primera bacteria, solo se ha descrito previamente que GH30_3 (BT3312) y GH3 (BT3314) son activos en el β-glucano de pustulán17. Para evaluar la actividad catalítica de BT3312 sobre el β-glucano de Fusarium venenatum, realizamos ensayos enzimáticos con este polisacárido obteniendo niveles de actividad similares a los de BcellWH2_02537 (2874 ± 35 mg ml−1 min−1 para BT3312 y 2512 ± 28 mg ml−1 min−1 para BcellWH2_02537) (Tabla 1). Se demostró que la enzima BT3312 es activa en las cadenas laterales de β-glucano fúngico, liberando así β-1,6-oligosacáridos particulares, que a su vez pueden ser hidrolizados por BT3314 como una exoglucosidasa para liberar glucosa (Fig. 2F para BT3312, y Fig. 2G para BT3314). De la misma manera que las enzimas Baccell WH2, la Tabla 1 muestra los parámetros catalíticos para BT3312 y BT3314 en estos sustratos.

Para diseccionar las interacciones de las enzimas GH157 y GH30_3 codificadas por Baccell WH2 con el β-glucano fúngico, intentamos obtener cristales de las proteínas Baccell WH2. Desafortunadamente, a pesar de examinar múltiples condiciones, no pudimos obtener cristales adecuados. En cambio, obtuvimos la estructura de la proteína GH30_3 en comparación con la estructura cristalina resuelta para BT3312 utilizando el algoritmo Phyre2 como plataforma de búsqueda17,52. La Fig. S1D muestra que la estructura predicha es un barril (β/a)8 con el mecanismo de retención conservado donde dos ácidos glutámicos actúan como nucleófilo (E339 y E347 para BT3312 y BcellWH2_02537, respectivamente) y ácido/base (E238 y E247 para BT3312 y BcellWH2_02537, respectivamente). Como se indica en esta Figura, ambas proteínas muestran un alto nivel de similitud de secuencia (58,33 % idénticas) y exhiben el mismo perfil de actividad (Tabla 1). Esto indica que GH30_3 de Baccell WH2 contiene solo tres subsitios principales de manera similar a lo que se ha descrito para BT331217. Los aminoácidos involucrados en la unión y la catálisis se conservan en ambas proteínas (Fig. S1E).

Para investigar si Baccell WH2 y BT liberan oligosacáridos en su medio de cultivo cuando se cultivan en β-glucano fúngico, lo que tal vez permita el crecimiento de otras bacterias a través de actividades de alimentación cruzada, obtuvimos un medio de crecimiento libre de células después del cultivo de estas cepas hasta la exponencial media. y fase estacionaria (Fig. 3). A continuación, se evaluó mediante HPLC la presencia de oligosacáridos liberados en el medio por Baccell WH2 o BT (Fig. 3A, B). Cuando estas dos especies bacterianas usan micoproteínas como su única fuente de carbono (Fig. 3A), se demostró que liberan oligosacáridos en el medio, pero estos eran diferentes en cada caso (Fig. 3B), lo cual es consistente con su diferente arquitectura GUL y enzimas asociadas, confirmando así la distinta estrategia degradativa seguida por cada una de estas dos especies.

Un cromatograma de HPLC de los medios de crecimiento de Baccell WH2 en β-glucano fúngico. B Igual que el Panel A con BT. C Oligosacárido purificado de Baccell WH2 después de la columna de filtración en gel (GF). D Oligosacárido purificado de BT después de la columna GF. E LC/MS del sobrenadante de Baccell WH2 cultivado en β-glucano fúngico. F LC/MS del sobrenadante de BT cultivado en β-glucano fúngico. Todos los experimentos de HPLC y LC/MS se han realizado en 3 réplicas independientes diferentes (n = 3).

Para investigar la naturaleza de estos oligosacáridos, realizamos LC/MS para determinar su masa. La figura 3C muestra el perfil de HPLC del oligosacárido principal purificado liberado por Baccell WH2 y la figura 3E el espectro de masas asociado de este oligosacárido que confirma que esta bacteria libera predominantemente un heptasacárido. Estos resultados concuerdan con la digestión enzimática in vitro del β-glucano fúngico porque cuando incubamos esta fuente de carbono fúngico con GH30_3 y GH157 juntos, los productos generados por ambas enzimas fueron glucosa, 1,6-β-glucobiosa 1,3- β-glucotetraosa y el heptasacárido presente en el medio de crecimiento generado por Baccell WH2 (Fig. 2E). La Figura 3F muestra los espectros de masas de los principales oligosacáridos liberados por BT en el medio de cultivo, confirmando la presencia de un disacárido como producto principal, correspondiente a la 1,6-β-glucobiosa como se indicó en el cromatograma de HPLC (Fig. 3D) .

Después de que confirmamos la liberación de oligosacáridos en el medio de crecimiento por parte de Bacteroides cuando se cultivan en micoproteína β-glucano, planteamos la hipótesis de que este fenómeno permitiría que otros comensales intestinales se alimenten de forma cruzada con dichos oligosacáridos liberados.

De hecho, la Fig. 4 muestra que las cepas de Bifidobacterium son capaces de crecer cuando se cultivan conjuntamente con Bacteroides en β-glucano fúngico. Examinamos el sobrenadante de la noche a la mañana de Baccell WH2 y BT cultivadas en β-glucano con varias cepas de Bifidobacterium y Lactobacillus disponibles que muestran que, en el caso del sobrenadante de Baccell WH2, Bi. breve UCC2003, Bi. longum subesp. largo NCIMB 8809 y Lb. plantarum WCFS1 no pueden usar β-glucano intacto como fuente de carbono, pero pueden utilizar el heptasacárido liberado por Baccell WH2 (Fig. 4A). Confirmamos la capacidad de estas cepas para usar el heptasacárido probando los medios de crecimiento antes y después del Bi. breve UCC2003, Bi. longum subesp. largo NCIMB 8809 y Lb. plantarum WCFS1 crecimiento. La Figura 4B confirma el uso del heptasacárido por parte de Bi. longum subesp. longum NCIMB 8809, con Bi. breve UCC2003 y Lb. plantarum WCFS1 que exhibe una capacidad más modesta para usar también el oligosacárido liberado. Después de 24 h de fermentación, Bi. longum subesp. longum NCIMB 8809 alcanzó una densidad óptica final de 0,8 cuando se utilizó el sobrenadante de Baccell WH2. Bi. breve y lb. plantarum pudieron utilizar estos oligosacáridos pero en menor grado, alcanzando una densidad óptica final de 0,6.

A Crecimiento de Bifidobacterium con sobrenadante fúngico de β-glucano de Baccell WH2. B Análisis HPLC de sobrenadantes antes y después del crecimiento de Bifidobacterium longum subsp. longum sobre sobrenadantes de Baccell WH2. C Crecimiento de Bifidobacterium con sobrenadante fúngico de β-glucano de BT. D Análisis por HPLC de sobrenadantes antes y después del crecimiento de Bifidobacterium longum subespecie longum en sobrenadante libre de células de BT cultivado en β-glucano fúngico. E Análisis por HPLC de sobrenadantes antes y después del crecimiento de Bi breve UCC2003 y L. plantarum en sobrenadantes sin células de BT cultivados en β-glucano fúngico. Todos los experimentos de crecimiento y HPLC se han producido en 3 réplicas independientes diferentes (n = 3).

Cuando se usó el sobrenadante de BT como fuente de carbono para el cribado de Bi. breve UCC2003, Bi. longum subesp. largo NCIMB 8809 y Lb. plantarum WCFS1, el disacárido que de otro modo se acumularía en el medio ahora no está presente, lo que indica que esta β-1,6-glucobiosa es utilizada por las cepas de bifidobacterias y Lactiplantibacillus para sostener su crecimiento (Fig. 4C, D). También se realizó el análisis del medio de crecimiento por HPLC para Bi. breve UCC2003 y Lb. plantarum WCFS1 confirmando su capacidad para usar la β-1,6-glucobiosa como fuente de carbono (Fig. 4E).

Para confirmar esta interacción de alimentación cruzada recién descubierta entre las especies de Bacteroides y Bifidobacterium, realizamos experimentos de alimentación cruzada en diferentes momentos en los que verificamos un cocultivo de ambas especies rastreando las unidades formadoras de colonias y la cuantificación de qPCR basada en 16 S rRNA de cada uno. especies durante el crecimiento (Figs. 5, 6). En este experimento de cocultivo, Baccell WH2 permitió Bi. longum subesp. longum NCIMB 8809 y Bi. breve UCC2003 crezca cuando ambas cepas se cultivan con el β-glucano fúngico intacto, como es obvio a partir de las evaluaciones de conteo viable (Fig. 5A para Bi. longum subsp. longum y 5 C para Bi. breve) y el porcentaje de ambas bacterias en el co -cultivo (Fig. 5B para Bi. longum subsp. longum y 5D para Bi. breve). La observación del crecimiento de Bifidobacterium en cocultivo con Baccell WH2 en presencia de β-glucano concordó con los hallazgos de fermentación en monocultivo, cuando se usó sobrenadante libre de células como fuente de carbono, como se muestra en la Fig. 4.

A Unidades formadoras de colonias de Baccell WH2 + Bi. longum subesp. largo B Porcentaje de Baccell WH2 + Bi. longum subesp. largo C Unidades formadoras de colonias de Baccell WH2 + Bi. Breve UCC2003. D Porcentaje de Baccell WH2 + Bi. breveUCC2003. Todos los experimentos de alimentación cruzada se produjeron en 3 repeticiones independientes diferentes (n = 3).

Unidades formadoras de colonias de BT + Bi. breveUCC2003. B Porcentaje de BT + Bi. breveUCC2003. C Unidades formadoras de colonias de BT + Bi. longum subesp. largo D Porcentaje de BT + Bi. longum subesp. largo Todos los experimentos de alimentación cruzada se produjeron en 3 repeticiones independientes diferentes (n = 3).

De manera similar, BT permitió el crecimiento de Bi. breve UCC2003 y Bi. longum subesp. longum NCIMB 8809 en cocultivo como puede observarse en las Figs. 6A y 6C (unidades formadoras de colonias) y 6B y 6D (porcentaje), respectivamente. Una vez más, confirmó la capacidad de Bacteroides para permitir redes específicas de alimentación cruzada con cepas de Bifidobacterium en el intestino cuando las primeras bacterias crecen en el β-glucano fúngico de la dieta.

Finalmente, para ampliar este estudio con otros miembros comensales de la microbiota intestinal humana, realizamos el experimento de cocultivo de Baccell WH2 y BT como degradador primario y Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 como degradador secundario para confirmar la capacidad de Baccel WH2 y BT para permitir el crecimiento. de este comensal. higos. S2A y S2B para Baccell WH2 y las Figs. S2C y S2D para BT también mostraron esta capacidad en cocultivo.

Como se dijo anteriormente, Bi. breve UCC2003 puede utilizar la glucobiosa liberada por Baccell WH2 cuando se cultiva en β-glucano. Realizamos un análisis bioinformático del genoma de la bacteria anterior para identificar glucósidos hidrolasas que permitirían a Bifidobacterium utilizar este oligosacárido. Identificamos un GH1 (Bbr_0109) que previamente había demostrado actuar sobre la celobiosa como sustrato53. Presumimos que esta proteína actuaría sobre gluco-oligosacáridos con diferentes enlaces como sustratos. Para probar nuestra hipótesis, expresamos la proteína de forma recombinante y realizamos ensayos enzimáticos con β-1,4, β-1,3 y β-1,6-glucobiosa como sustratos de la enzima. Bbr_0109 fue activo en β-1,4 y β-1,6-glucobiosa como esperábamos, y esta actividad se muestra por HPLC en las Figs. S3A y S3B, respectivamente. Además, pudimos caracterizar esta actividad y los parámetros cinéticos se calculan en la Tabla 1. Análisis bioinformático del Bi. longum subesp. longum no reveló ningún homólogo de Bbr_0109 u otras enzimas candidatas responsables de su capacidad para cruzarse con oligosacáridos derivados de β-glucano y, por lo tanto, se requiere más trabajo para desentrañar la ruta metabólica responsable de esta actividad.

Después de confirmar la capacidad de Bacteroides para permitir específicamente el crecimiento de Bifidobacterium cuando la bacteria anterior se cultiva en β-glucano, realizamos un análisis metabolómico de los medios de cultivo para evaluar la producción de ácidos grasos de cadena corta (SCFA)/lactato/succinato por Bacteroides y Bifidobacterium en mono y cocultivos. La Tabla 2 enumera los niveles detectados de acetato, butirato, propionato y lactato por estas fermentaciones. Se demostró que Baccell WH2 produce succinato (78 mM) y acetato (12 mM) como los principales SCFA producidos en monocultivo. Como control, Bi. longum subesp. longum NCIMB 8809 no logró producir cantidades significativas de SCFA debido a su incapacidad para usar la micoproteína β-glucano intacta. Por el contrario, en el cocultivo, el acetato fue el SCFA de mayor concentración (115 mM) seguido del succinato (99 mM) como consecuencia de la subsp. longum NCIMB 8809 crecimiento. Finalmente, también se produjeron formiato (16 mM) y lactato (21 mM) en cocultivo debido a la capacidad de Bifidobacterium para producir estos metabolitos.

Se ha demostrado previamente que el β-glucano actúa como un carbohidrato prebiótico con varios resultados beneficiosos informados para la salud humana54,55,56,57. Recientemente, Dejean et al. (2020) demostraron la capacidad de las cepas de Bacteroides para utilizar β-(1,3)-glucanos, como los derivados de levadura o laminarina de algas13. Estos autores demostraron que Bacteroides uniformis ATCC 8492 emplea un locus de utilización de polisacáridos específico para la deconstrucción de estos β-(1,3)-glucanos. Este locus genético codifica una enzima de la familia de glucósido hidrolasa 158 (GH158) asociada a la superficie celular y una GH16 para iniciar la despolimerización del polisacárido para liberar oligosacáridos que son incorporados por el par similar a SusC/D en el periplasma donde se encuentra una GH3 (β-glucosidasa). ) continúa con el proceso de degradación convirtiendo todos los oligosacáridos en monómeros de glucosa, que luego ingresan al catabolismo glucolítico central. También en 2020, Singh et al.37 demostraron la capacidad de Bacteroides uniformis JCM 13288 para degradar β-(1,3)-glucanos con un mecanismo enzimático similar al de la cepa de Bacteroides uniformis antes mencionada. Sin embargo, estos últimos autores revelaron una actividad adicional de GH30 capaz de degradar las cadenas laterales de β-(1,6)-glucano de la molécula liberando β-1,6-glucobiosa. Además, demostraron que los oligosacáridos liberados por este Ba. uniformis puede ser utilizada por otros miembros de la microbiota intestinal, que no crecieron o crecieron pobremente con laminarina.

En el caso del β-glucano de cebada, Tamura et al.34,35,36 demostraron que Bacova y Baccell WH2 utilizan una enzima GH16 asociada a la superficie (Bovatus_03149 y BcellWH2_04354) para iniciar el proceso de degradación. Además, los mismos autores demostraron que hay dos enzimas GH3 presentes en el periplasma de Bacova (Bovatus_03146 ​​y Bovatus_03153) y una en el de Baccell WH2 (BcellWH2_4356) para completar el metabolismo del β-glucano de cebada.

En el trabajo descrito aquí, revelamos una vía alternativa seguida por Baccell WH2 para degradar los β-glucanos fúngicos de la dieta, como el polisacárido derivado de Fusarium venenatum, el ingrediente principal empleado en los productos Quorn®, donde la estructura química consiste en un β-glucano lineal Esqueleto de -(1,3)-glucano con β-(1,6)-glucano como cadenas laterales (Fig. 1A). Para este metabolismo, Baccell WH2 emplea dos GUL para degradar este glicano complejo, como lo revela la proteómica y lo confirma la transcriptómica (Fig. 1C y S1B, respectivamente). Dentro de estos GUL, Baccell WH2 codifica un nuevo GH157 y un GH30_3, ambos previstos para estar ubicados en la superficie celular, para iniciar la degradación del glicano complejo. También se demostró que estos GUL codifican glucósido hidrolasas adicionales necesarias para degradar completamente los gluco-oligosacáridos liberados por las proteínas de la superficie de la membrana externa e incorporados en el periplasma por los pares similares a SusC/D. Estas proteínas periplásmicas representan β-glucosidasas típicas que pertenecen a las familias GH 3 y 2. Finalmente, este GUL codifica una proteína con una función desconocida (BcellWH2_02538), con una ubicación predicha en la superficie de Baccell WH2. Esta proteína se encuentra en una ubicación perfecta para ser una proteína de unión a glicanos de superficie (SGBP), que se ha demostrado que ayuda al par similar a SusC/D en la unión de oligosacáridos en la superficie celular bacteriana35,36,58. La razón de la presencia de tres β-glucosidasas diferentes (dos GH3 y una GH2) codificadas por estos GUL para atacar el β-glucano fúngico sigue siendo especulativa para nosotros. Postulamos que Baccell WH2 podría actuar sobre varios tipos de β-glucanos, no solo fuentes fúngicas, con diferentes estructuras químicas. Por esa razón, utilizan distintas β-glucosidasas para hidrolizar diferentes enlaces en estos gluco-oligosacáridos. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que algunas de estas β-glucosidasas sean redundantes y la bacteria esté evolucionando para eliminar algunos de estos genes de su genoma bajo la alta presión de selección impuesta por el entorno intestinal.

Finalmente, mostramos que Baccell WH2 y BT pueden compartir oligosacáridos con otros miembros de la microbiota intestinal, incluidas las especies comensales Bifidobacterium y Lactiplantibacillus. A este respecto, se demostró que Baccell WH2 permite interacciones de alimentación cruzada con Bi. longum subesp. largo, Bi. breve UCC2003 y Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 (Fig. 5 y S2). Además, se demostró que BT promueve la alimentación cruzada específica con Bi. longum subesp. largo, Bi. breve UCC2003 y Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 (Fig. 6 y S2), lo que permite el crecimiento de ambas bacterias en cocultivo. Dado que los oligosacáridos liberados por BT y Baccell WH son diferentes (es decir, glucoheptasacárido y glucobiosa), seleccionará interacciones específicas en el intestino. Bi. breve UCC2003 codifica un GH1 (Bbr_0109) para degradar la glucobiosa liberada por BT. Esta GH1 es muy específica para la glucobiosa, siendo activa sobre la β-(1,3)glucobiosa, la β-(1,4)glucobiosa y la β-(1,6)glucobiosa (Tabla 1). Sin embargo, la incapacidad de actuar sobre la glucotriosa u otros oligosacáridos más largos puede explicar la capacidad parcial de Bi. breve para utilizar el heptasacárido liberado por Baccell WH2 y, como consecuencia, su incapacidad para crecer en el sobrenadante de Baccell WH2. Estas interacciones específicas en la alimentación cruzada entre miembros de Bacteroides y Bifidobacterium se han demostrado para otros polisacáridos como arabinogalactan31, arabinoxylan48 o inulin59.

En términos de β-glucano, se ha informado poco sobre las interacciones de alimentación cruzada por parte de los miembros de la microbiota intestinal. Como dijimos anteriormente, Singh et al.37 demostraron la capacidad de Ba. uniformis JCM 13288 para compartir gluco-oligosacáridos con Blautia producta JCM1471, Ruminococcus faecis JCM15917 y Bifidobacterium teenageris JCM 1275 cuando crecen en laminarina como única fuente de carbono. Además, Centanni et al.60 demostraron interacciones entre Bacteroides ovatus, Subdoligranulum variabile y Hungatella hathewayi usando β-glucano de cebada como fuente de carbono. Demostraron que Ba. ovatus liberó 3-O-β-celobiosil-D-glucosa y 3-O-β-celotriosil-D-glucosa en el medio como productos finales y estos oligómeros permitieron el crecimiento de las otras dos bacterias con preferencia por 3-O-β- cellotriosyl-d-glucose en el caso de Hungatella hathewayi. Sin embargo, hasta donde sabemos, nuestro estudio revela por primera vez interacciones moleculares detalladas entre diferentes miembros de Bacteroides spp. y otros comensales humanos (Bifidobacterium y Lactiplantibacillus) cuando se usa β-glucano fúngico.

Finalmente, hemos demostrado la capacidad de Baccell y B. breve UCC2003 para producir diferentes SCFA en monocultivo y cocultivo como resultado de la fermentación de β-glucano. Baccell produce acetato y succinato como metabolitos principales cuando crece en monocultivo en β-glucano, mientras que se demostró que el cocultivo con B. breve UCC2003 da como resultado la producción no solo de acetato y succinato, sino también de lactato y formiato, este último a partir de la fermentación de Bifidobacterium. . Esta producción está en concordancia con otros procesos fermentativos donde Bacteroides produce acetato como principal SCFA31. Muñoz et al. han informado sobre la producción de niveles más bajos de succinato (60 mM) para la fermentación de AGP que para β-glucano (78 mM, Tabla 2) cuando Baccell se cultivó en monocultivos. Sin embargo, se observa el efecto opuesto para la producción de acetato, ya que se demostró que Baccell produce acetato 24 mM y 12 mM cuando se cultiva en AGP o β-glucano, respectivamente31. Sin embargo, la producción de SCFA parece ser mayor para todos los metabolitos cuando se cocultivó Baccell con B. breve UCC2003 en presencia de β-glucano (115, 99, 21 y 16 mM para acetato, succinato, lactato y formiato, respectivamente). cuando se compara con el cocultivo en presencia de AGP (94, 68, 6 y 6,9 mM para acetato, succinato, lactato y formiato, respectivamente)31.

Todos los datos presentados en este trabajo nos permitieron obtener un modelo general para la degradación del β-glucano fúngico en Baccell WH2 y su interacción con las bifidobacterias como degradadores secundarios (Fig. S3C).

En conclusión, este artículo muestra la capacidad de diferentes miembros de las cepas de Bacteroides del intestino humano para usar el β-glucano fúngico en la dieta. Hemos demostrado que Bacteroides emplea dos GUL principales para degradar este glicano complejo con nuevas actividades enzimáticas y familias descubiertas en esos GUL y que comparten oligosacáridos y Bi. longum subesp. largo y Bi. breve UCC2003 de forma selectiva donde poder utilizarlos. Finalmente, hemos mostrado la enzima específica (Bbr_0109, GH1) codificada en Bi. breve UCC2003 responsable de la degradación del oligosacárido liberado por BT. Por lo tanto, el estudio proporciona evidencia de que los genes de utilización de β-glucano fúngico están presentes no solo en Bacteroides sino también en bacterias Gram-positivas. Diversos GUL de β-glucanos identificados en este estudio pueden allanar el camino para el desarrollo de alimentos funcionales diseñados para mejorar la salud humana a través de una terapia de intervención nutricional adecuada.

El β-glucano de levadura y cebada analizado en este estudio se adquirió de Megazyme (Dublín, Irlanda). D-galactosa y D-glucosa se adquirieron de Sigma (Reino Unido). El medio de crecimiento Luria-Bertani (LB) se adquirió de Formedium (Norfolk, Reino Unido), el agar clostridial reforzado de Oxoid Ltd. (Basingstoke, Inglaterra) y Brain Heart Infusion de Sigma (Reino Unido). Todos los reactivos fueron de grado analítico.

El material de la pared celular de Fusarium venenatum se extrajo y las diferentes partes de glicano se purificaron de acuerdo con un método descrito previamente61. Brevemente, el material de la pared celular se extrajo alcalinamente con NaOH al 3% durante 75 h obteniendo dos fracciones: fracción 1 soluble en bases y fracción 2, insoluble en bases. Se demostró que la fracción 1 contenía manoproteínas y β-1,6-1,3-glucano y las fracciones contenían este β-1,6-1,3-glucano asociado con quitina. La fracción 1 se neutralizó con ácido acético glacial y se centrifugó a 15.000 × g durante 30 min y el sobrenadante se sometió a diálisis durante 24 h. Después de la diálisis, la mezcla se liofilizó antes de su uso (Fig. S4A, B).

Licenciado en Letras. ovatus ATCC8483 (Bovatus), Ba. thetaiotaomicron VPI-5482 (BT), Ba. cellulosilyticus DSMZ14838 (Baccell DSM) y Ba. cellulosilyticus WH2 (Baccell WH2) son capaces de crecer en todas las fuentes de carbono de interés en este estudio y, por lo tanto, se cultivaron directamente en 3 ml de Minimal Media (MM) que contenía 1 % (peso/vol) de carbohidratos, como se describió anteriormente48.

Bacteroides sp. se precultivaron en MM + Glucosa, se sedimentaron, lavaron, resuspendieron dos veces en MM sin ninguna fuente de carbono y se inocularon a un A600 de ~0,3 en 4 ml de MM que contenía 1% (peso/vol) de carbohidratos. Los cultivos bacterianos se recolectaron por triplicado (en la fase logarítmica media [A600, ~0,6] después de 5 h de incubación para Bovatus, BT, Baccell DSM y Baccell WH2, se colocaron en RNA protect (Qiagen) para la estabilización inmediata del ARN y luego se almacenaron a –20 °C, se extrajo el ARN y se purificó con el minikit RNeasy (Qiagen), se evaluó la pureza del ARN mediante espectrofotometría y se utilizó un µg de ARN para la transcripción inversa y la síntesis del ADNc (SuperScript VILO master mix; Invitrogen). Se realizaron PCR cuantitativas (20 µl de volumen final) usando cebadores específicos con un kit SensiFast SYBR Lo-ROX (Bioline) en un sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast (Applied Biosystems) (Tabla S2) Los datos se normalizaron a la transcripción de ARNr 16 S los niveles y los cambios en los niveles de expresión se calcularon como cambio en veces en comparación con los niveles para cultivos de MM que contenían glucosa.

Baccell WH2 se cultivó de la misma manera que antes con β-glucano al 1% como polisacárido complejo y glucosa como control de monosacárido. Los cultivos bacterianos se recolectaron por triplicado después del crecimiento en MM+Glc o MM+β-glucano. Las células se recogieron por centrifugación (3500 g, 15 min, 4 °C) y se lavaron tres veces con PBS pH 7,4. Los sedimentos celulares se resuspendieron posteriormente en tampón de urea 8 M en bicarbonato de trietilamonio 50 mM, que contenía tris (2-carboxietil) fosfina 5 mM. Las células se lisaron mediante sonicación utilizando un homogeneizador ultrasónico (Hielscher). Posteriormente, las proteínas se alquilaron durante 30 min a temperatura ambiente usando yodoacetamida 10 mM en la oscuridad. La concentración de proteínas se determinó utilizando un ensayo de proteínas de Bradford (Thermo Fisher Scientific). Las muestras de proteínas, que contenían 50 μg de proteína total, se diluyeron cinco veces con bicarbonato de trietilamonio 50 mM y la digestión de proteínas se realizó a 37 °C durante 18 h con agitación a 300 rpm. Se utilizó una proporción de proteína a tripsina de 50:1. Se detuvo la digestión con tripsina y se desalinizaron los péptidos como se ha descrito anteriormente.

Los péptidos se disolvieron en acetonitrilo al 2 % que contenía ácido trifluoroacético al 0,1 % y cada muestra se analizó de forma independiente en un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific), conectado a un sistema UltiMate 3000 RSLCnano (Thermo Fisher Scientific). Los péptidos se inyectaron en una columna trampa Acclaim PepMap 100 C18 LC (100 μm DI × 20 mm, 3 μm, 100 Å) seguido de separación en una columna EASY-Spray nanoLC C18 (75 DI μm × 500 mm, 2 μm, 100 Å) a un caudal de 300 nlmin−1. El disolvente A era agua que contenía un 0,1 % de ácido fórmico y el disolvente B era un 80 % de acetonitrilo que contenía un 0,1 % de ácido fórmico. El gradiente utilizado para el análisis de muestras rasuradas en la superficie fue el siguiente: el solvente B se mantuvo al 3 % durante 6 min, seguido de un aumento del 3 al 35 % de B en 43 min, del 35 al 90 % de B en 0,5 min, se mantuvo en B al 90 % durante 5,4 min, seguido de una disminución al 3 % en 0,1 min y equilibrio al 3 % durante 10 min. El gradiente utilizado para el análisis de las muestras de proteoma fue el siguiente: el disolvente B se mantuvo al 3 % durante 6 min, seguido de un aumento del 3 al 35 % de B en 218 min, del 35 al 90 % de B en 0,5 min, se mantuvo al 90 % B durante 5 min, seguido de una disminución al 3 % en 0,5 min y equilibrio al 3 % durante 10 min. El Orbitrap Fusion Lumos se operó en modo dependiente de datos de iones positivos utilizando una versión modificada del método de análisis de iones en paralelo ordenado por carga (CHOPIN) recientemente descrito para el uso sincronizado de la trampa de iones y los analizadores de masa Orbitrap. El método CHOPIN se deriva del 'método universal' desarrollado por Thermo-Fisher, para ampliar las capacidades de paralelización del analizador de masas. El barrido de iones precursores (barrido completo) se realizó en el Orbitrap en el rango de 400–1600 m/z con una resolución de 120 000 a 200 m/z, un objetivo de control automático de ganancia (AGC) de 4 × 105 y una inyección de iones tiempo de 50 ms. Los espectros de MS/MS de iones precursores doblemente cargados se adquirieron en la trampa de iones lineal (IT) utilizando el modo de exploración rápida después de la fragmentación por disociación inducida por colisión (CID). Se utilizó una energía de colisión CID del 32%, el objetivo AGC se fijó en 2 × 103 y se permitió un tiempo de inyección de 300 ms. Los iones precursores con estado de carga 3–7 y con una intensidad <5 × 105 también se programaron para análisis por CID/IT, como se describe anteriormente. Sin embargo, se adquirieron iones precursores con estado de carga 3–7 y con una intensidad >5 × 105 en el Orbitrap (FT) con una resolución de 30 000 a 200 m/z después de disociación por colisión de alta energía (HCD). Se utilizó una energía de colisión HCD del 30 %, el objetivo de AGC se fijó en 1 × 104 y se permitió un tiempo de inyección de 40 ms. El número de eventos de MS/MS entre escaneos completos se determinó sobre la marcha para mantener un ciclo de trabajo fijo de 3 s. La exclusión dinámica de iones dentro de una ventana de ± 10 ppm m/z se implementó utilizando una duración de exclusión de 35 s. Se utilizó un voltaje de electrospray de 2,0 kV y una temperatura capilar de 275 °C, sin cubierta ni flujo de gas auxiliar.

Todos los espectros de MS/MS se analizaron utilizando MaxQuant 1.5.1.739 y se buscaron en una base de datos de Bacteroides cellulosilyticus MGS:158 (que contiene 4369 entradas). Las secuencias de proteínas se descargaron de Uniprot el 10 de mayo de 2020. La generación de listas de picos se realizó dentro de MaxQuant y las búsquedas se realizaron utilizando parámetros predeterminados y el motor de búsqueda integrado de Andromeda. La especificidad de la enzima se fijó para considerar péptidos completamente trípticos, y se permitieron dos escisiones perdidas. Se permitieron como modificaciones variables la oxidación de metionina, la acetilación N-terminal y la desamidación de asparagina y glutamina. En MaxQuant se empleó una tasa de descubrimiento falso de proteínas y péptidos de menos del 1 %. Las proteínas se identificaron con confianza cuando contenían al menos dos péptidos trípticos únicos. Las proteínas que contenían péptidos similares y que no podían diferenciarse basándose únicamente en el análisis MS/MS se agruparon para satisfacer los principios de parsimonia. Los impactos inversos y los contaminantes se eliminaron antes del análisis posterior. Se utilizó Skyline 4.1.0.11796 para la extracción de cromatogramas de iones. El enriquecimiento de la ontología génica se realizó con PANTHER42 y la predicción de la localización de proteínas subcelulares se realizó con LocateP v243.

Los genes asociados con los PUL descritos en Baccell WH2 [BccellWH2_01926 (GH3), BccellWH2_01931 (GH157), BaccellWH2_02537 (GH30_3)] y las proteínas en BT [BT3312 (GH30_3) y BT3314 (GH3)] se amplificaron a partir de Baccell WH2 y BT respectivamente. usando su ADN genómico como molde y clonado en pET28a (Novagen) usando sitios de restricción NheI y XhoI para la producción y purificación de su producto codificado facilitado por la incorporación con una etiqueta His6 N-terminal (Tabla 2S). Para ello se utilizaron células de E. coli TOP10 (ThermoFisher Scientific). La construcción recombinante se secuenció (Eurofins Genomics) para verificar su integridad genética y luego se usó para transformar células de expresión de E. coli BL21 (DE3) (Thermo-Fisher Scientific). Las células se cultivaron en medio Luria-Bertani (LB) que contenía 50 mg/ml de antibiótico de kanamicina hasta la fase logarítmica media (A600nm de ~0,6). La expresión de la proteína se indujo mediante la adición de β-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) 0,1 mM a las células, seguido de crecimiento durante la noche a 16 °C. Al día siguiente, las células se recogieron por centrifugación (4000 × g) y se resuspendieron en el tampón Talon (Tris/HCl 20 mM pH 8,0 más NaCl 100 mM). Las células resuspendidas se rompieron y centrifugaron (16 000 × g) durante 20 min a 4 °C, después de lo cual las proteínas recombinantes se purificaron a partir del extracto libre de células resultante mediante cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (IMAC) usando TalonTM, una matriz a base de cobalto. En el proceso, el extracto libre de células (CFE) se cargó en una columna que contenía la resina Talon y luego se lavó con un tampón Talon. Se realizó otro lavado con tampón Talon que contenía imidazol 10 mM seguido de elución de la proteína recombinante con imidazol 100 mM. A continuación, las proteínas purificadas se intercambiaron en un tampón de elección mediante diálisis estándar.

Todos los ensayos enzimáticos, a menos que se indique lo contrario, se llevaron a cabo en un tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0, que contenía NaCl 150 mM y se realizaron por triplicado. Los ensayos se llevaron a cabo a 37 °C empleando 1 µM de cada GH [BccellWH2_01926 (GH3), BccellWH2_01931 (GH157), BccellWH2_02537 (GH30_3), BcellWH2_02541 (GH2), BT3312 (GH30_3) y BT3314 (GH3)] en presencia de 150 µM β-glucano. Se tomaron alícuotas durante un transcurso de tiempo de 16 h, y las muestras y los productos se evaluaron mediante TLC y cromatografía de intercambio aniónico de alta presión (HPAEC) con detección amperométrica pulsada (PAD). Los azúcares (mono y oligosacáridos cortos) se separaron en una columna de protección y analítica Carbopac PA1 en un programa isocrático de hidróxido de sodio 100 mM durante 40 min y luego con un gradiente lineal del 100 % de acetato de sodio 500 mM durante 60 min. Los azúcares se detectaron utilizando la forma de onda cuádruple estándar de carbohidratos para la detección electroquímica en un electrodo de trabajo de oro con un electrodo de referencia de pH Ag/AgCl.

En el caso de GH30_3 y GH157, la hidrólisis de polisacáridos se cuantificó mediante un ensayo de azúcares reductores DNSA (ácido dinitrosalicílico)48. Los ensayos se realizaron en un volumen final de 1 ml al pH óptimo y 37 °C durante 10 min. Las reacciones se terminaron mediante la adición de un volumen igual (1 ml) de reactivo DNSA. El color se reveló calentando a 80 °C durante 20 min antes de leer A540. Se usó glucosa (25 a 150 µM) para generar una curva estándar para la cuantificación. Para determinar los parámetros de Michaelis-Menten, se utilizaron diferentes concentraciones de soluciones de polisacáridos en el rango de 0,025 a 3 mg ml−1 con la concentración adecuada de enzima durante 10 min, y se cuantificó el número de extremos reductores liberados como se describe anteriormente. Los valores se trazaron mediante regresión lineal dando kcat/Km como la pendiente de la línea.

En el caso de GH3s y GH2, el ensayo enzimático se midió en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 340 nm midiendo la liberación de glucosa mediante el kit de ensayo couple de Megazyme (Dublín, Irlanda) para la cuantificación de la liberación de glucosa.

Antes del cocultivo, Baccell WH2 y BT se cultivaron en infusión de cerebro y corazón (BHI, Sigma Aldrich, Reino Unido) y se lavaron dos veces en PBS. Se cultivaron monocultivos de cepas de bifidobacterias en medio Clostridium reforzado (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) y se lavaron en PBS antes de usarlos para inocular medio mínimo (MM) que contenía 1 % de micoproteína β-glucano11. Los cocultivos se cultivaron en medio mínimo inoculado que contenía 1% de micoproteína β-glucano y los experimentos se realizaron por triplicado. Se tomaron muestras de 0,5 ml a intervalos regulares durante el crecimiento, que se diluyeron en serie y se sembraron en BHI con agar y hematina porcina para la determinación de las CFU totales por mililitro de cultivo (Baccell WH2 y BT) y en medio Clostridium reforzado con cisteína al 0,05 %. (para cepas de bifidobacterias de tipo salvaje) y con 100 µg/ml de eritromicina. Lactiplantibacillus plantarum WCSF4 se cultivó de forma rutinaria en medio MRS (Melford, Reino Unido) suplementado con 10 μg/ml de vancomicina. Cada monocultivo de Bacteroides, Bifidobacterium o Lactiplantibacillus también se sembró en placas para la determinación de CFU por mililitro a intervalos durante el cultivo.

Las alícuotas tomadas de mono y cocultivos se analizaron mediante qPCR para cuantificar la proporción de cada especie bacteriana durante el cultivo que amplifica el gen 16 S rRNA para cada bacteria en la muestra. Usamos cebadores específicos (1 µM) para cada bacteria para esta qPCR y se muestra en la Tabla 2S.

Los azúcares (tipo mixto de oligosacáridos del medio de crecimiento) se separaron en una columna de protección y analítica Carbopac PA200 en un programa isocrático de hidróxido de sodio 100 mM durante 40 min y luego con un gradiente lineal del 100 % de acetato de sodio 500 mM durante un período de 60 min. . Los azúcares se detectaron utilizando la forma de onda cuádruple estándar de carbohidratos para la detección electroquímica en un electrodo de trabajo de oro con un electrodo de referencia de pH Ag/AgCl.

La estructura tridimensional de GH157 (BcellWH2_01931) se modeló utilizando el software AlphaFold2 colab. Agradecemos al equipo de AlphaFold por desarrollar un modelo excelente y abrir el software https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/ principal/AlphaFold2.ipynb#scrollTo=UGUBLzB3C6WN). El modelo Bccell WH2_02537 (GH30_3) se obtuvo usando el servidor Phyre252. Las estructuras se visualizaron utilizando Pymol (el sistema gráfico molecular PyMOL, versión 2.0 Schrodinger, LLC).

Se usó análisis HPLC para evaluar la producción de SCFA mediante (alimentación cruzada) Baccell WH2 y Bi. Breve UCC2003. Los sobrenadantes del medio de crecimiento de la fase estacionaria (cocultivos) se esterilizaron (filtro 0,45 μM, columna Costart Spin-X) y se inyectaron en un sistema UltiMate® BioRS Thermo HPLC (Thermo Fisher Scientific) con un sistema detector de índice de refracción. Este sistema se utilizó para identificar y calcular la producción de acetato, lactato y butirato como resultado de la fermentación de carbohidratos. Las concentraciones se calcularon en base a estándares conocidos. El medio no fermentado que contenía LW-AG sirvió como control. Se usó una columna de HPLC Accucore™ C18 y se mantuvo a 65 °C. La elución se realizó durante 25 min utilizando una solución de H2SO4 10 mM a un caudal constante de 0,6 ml min−1.

La muestra que contenía los oligosacáridos generados a partir del sobrenadante de Baccell WH2 y BT cultivados en β-glucano se diluyó 1:10 (v/v) con tampón B (85 % de acetonitrilo/15 % de formiato de amonio 50 mM en agua, pH 4,7) y Se analizaron 0,5 μl mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas mediante elución de una columna capilar ZIC-HILIC (SeQuant, 3,5 μm, 200 Å, 150 × 0,3 mm, Merck). La columna se conectó a un sistema HPLC NanoAcquity (Waters) y se calentó a 35 °C con un gradiente de elución como sigue: 100 % de tampón B durante 5 min, seguido de un gradiente a 25 % de tampón B/75 % de tampón A (50 mM formiato de amonio en agua, pH 4,7) durante 40 min. El caudal fue de 50 μl min−1 y se equilibraron 10 volúmenes de columna de tampón B entre inyecciones. Los datos de MS se recopilaron utilizando un espectrómetro de masas Bruker Impact II QT operado en modo de iones positivos, 50–2000 m/z, con voltaje capilar y ajustes de temperatura de 2800 V y 200 °C respectivamente, junto con un flujo de gas de secado y una presión de nebulizador de 6 l min−1 y 0,4 bar. Los datos de MS se analizaron utilizando el software Compass DataAnalysis (Bruker).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos proteómicos se depositan en PeptideAtlas (identificador PASS04831, datos sin procesar para blanco, glucosa y micoproteína β-glucano como fuentes de carbono). Todos los datos generados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementarios). Todos los datos de origen subyacentes a los gráficos y tablas se pueden encontrar en Datos complementarios 1. Los geles SDS originales están disponibles en la Fig. S5. Más datos sin procesar están disponibles a pedido.

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JM-M. recibe el apoyo de una beca de doctorado financiada en parte por Marlow Foods Ltd. Este trabajo se ha realizado independientemente de Marlow Foods y los autores no tienen ningún interés financiero ni de otro tipo en el resultado del trabajo. JM-M. recibió apoyo financiero de una subvención interna de la Universidad de Northumbria. Dv-S. es miembro de APC Microbiome Ireland, que recibe apoyo financiero de Science Foundation Ireland (SFI/12/RC/2273 − P1 y SFI/12/RC/2273 − P2) como parte del Plan Nacional de Desarrollo del Gobierno de Irlanda.

Laboratorio de Enzimología Microbiana, Departamento de Ciencias Aplicadas, Universidad de Northumbria, Newcastle Upon Tyne, NE1 8ST, Tyne & Wear, Inglaterra, Reino Unido

Pedro Fernandez-Julia, Gary W. Black, William Cheung & Jose Munoz-Munoz

Escuela de Microbiología y APC Microbiome Ireland, University College Cork, Cork, Irlanda

Douwe Van Sinderen

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PF-J. enzimas recombinantes clonadas, expresadas y purificadas; realizó y analizó la cinética de hidrólisis de polisacáridos, oligosacáridos y sustratos cromogénicos; productos de hidrólisis determinados en la HPLC; realizó curvas de crecimiento de todas las bacterias anaerobias; llevó a cabo experimentos de alimentación cruzada; y escribió el artículo. WC realizó y analizó los datos de proteómica y escribió la sección de proteómica en el manuscrito. GB, DVS y JM-M. diseñó y dirigió la investigación y coescribió el artículo con aportes de todos los autores.

Correspondencia a José Muñoz-Muñoz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores de manejo principal: Tobias Goris. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Fernández-Julia, P., Black, GW, Cheung, W. et al. Actividades de alimentación cruzada facilitadas por β-glucano fúngico entre especies de Bacteroides y Bifidobacterium. Comun Biol 6, 576 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04970-4

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Recibido: 19 diciembre 2022

Aceptado: 23 de mayo de 2023

Publicado: 30 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04970-4

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