usando monolito

Jun 14, 2023

Figura 1:Cromatograma del análisis de una reacción IVT utilizando una columna de cromatografía monolítica CIMac PrimaS.

La transcripción in vitro (IVT) es un paso crítico en la producción de ARN mensajero (ARNm). En un seminario web de marzo de 2022, Rok Sekirnik (jefe de desarrollo de procesos para aplicaciones de ARNm y ADN plasmídico (pDNA) en BIA Separations, parte de Sartorius) explicó que optimizar las concentraciones de los reactivos utilizados durante la IVT ayuda a maximizar la cantidad de ARNm que se produce. Los desarrolladores de fármacos tienen una gran necesidad de métodos analíticos que puedan medir IVT en tiempo real. Sekirnik mostró cómo las columnas de cromatografía monolítica CIMac PrimaS permiten el análisis en línea de IVT, incluido el control de la concentración de nucleósidos trifosfatos (NTP), reactivos de protección y plásmidos.

La presentación Sekirnik anotó que una molécula de ARNm de 4000 nucleótidos como la que se presenta en las vacunas de ARNm contra el SARS-CoV-2 es ~1,3 MDa, aproximadamente 10 veces más grande que un anticuerpo IgG estándar. El ARN mensajero también lleva una carga negativa y se vuelve hidrofóbico cuando se expone a altas concentraciones de sal. Para permitir la traducción de proteínas, debe tener una tapa 5 'y una cola poliadenilada (poli-A). Las colas de poli-A se pueden codificar en la plantilla de ADN utilizada para la transcripción o agregarse enzimáticamente después de IVT. De manera similar, se pueden agregar tapones 5 'durante o después de IVT.

Teniendo en cuenta tales propiedades, los desarrolladores de fármacos necesitan métodos analíticos que puedan medir el rendimiento del ARNm y la eficiencia de limitación en tiempo real. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es útil para tales evaluaciones, pero los analistas deben seleccionar un medio de separación que proporcione una química de unión adecuada, un área de superficie suficientemente grande para el ARNm y capacidad para análisis rápidos. En medios a base de perlas que contienen partículas porosas, la difusión limita la transferencia de masa, lo que requiere largos tiempos de análisis y limita el potencial para la evaluación en línea. Las perlas también generan un flujo a contracorriente, lo que produce un esfuerzo cortante que disminuye la recuperación.

Las columnas monolíticas CIMac PrimaS se basan en el transporte de masa por convección a través de una fase estacionaria de polimetacrilato. La separación se basa en interacciones multimodales de intercambio de aniones y enlaces de hidrógeno. El flujo laminar a través de la columna minimiza el esfuerzo cortante. En comparación con las partículas porosas, los microcanales proporcionan una superficie mucho mayor para la unión del ARNm. Debido a que los canales carecen de poros sin salida, su capacidad de unión y resolución siguen siendo las mismas en todos los caudales.

Esa función permite a los analistas procesar muestras lo suficientemente rápido como para evaluar IVT en tiempo real sin disminuir la resolución. Sekirnik señaló que un ensayo puede separar y cuantificar ARNm, ADNp, reactivos de protección y NTP distintos (Figura 1). Los resultados se generan en menos de tres minutos.

Dichas capacidades permiten monitorear y controlar la cinética de producción de ARNm, incluida la eficiencia de protección de 5 '. Sekirnik explicó que si se usa una exonucleasa que degrada selectivamente el ARNm sin protección, entonces se puede analizar una muestra para determinar la concentración de ARNm, tratarla enzimáticamente y analizarla nuevamente para cuantificar las moléculas no digeridas. La comparación de los valores de concentración de antes y después del tratamiento revelará la eficiencia de limitación de una reacción IVT. Los analistas pueden ajustar los regímenes de alimentación y las concentraciones de reactivos en consecuencia para optimizar la protección y el rendimiento del ARNm.

Sekirnik demostró esa posibilidad utilizando datos de un proceso IVT de lote alimentado. Sartorius inició IVT con una proporción de 1:4 de trifosfato de guanosina (GTP) a análogo de cap antirreverso (ARCA). Una hora después de iniciado el proceso, la eficiencia de tapado fue alta (80 %), pero el rendimiento fue bajo. Luego, el equipo utilizó una estrategia de alimentación para ajustar los niveles de NTP a lo largo de la reacción mientras mantenía la relación GTP:ARCA. Dichos cambios aumentaron el rendimiento seis veces (a 11,7 mg/mL) sin disminuir la eficiencia de protección (80 %) ni la calidad del producto.

Con un flujo de trabajo de este tipo, los analistas pueden obtener información rápidamente sobre la eficiencia y el rendimiento de la limitación. El software PATfix de Sartorius incluye secuencias y herramientas analíticas precargadas para facilitar la supervisión del proceso. La empresa también ofrece columnas monolíticas con otras químicas de enlace para proporcionar múltiples herramientas para la fabricación de ARNm y el análisis de procesos.

Preguntas y respuestas ¿Se pueden utilizar las columnas CIMac PrimaS en sistemas HPLC con bombas cuaternarias? Las columnas analíticas CIMac se pueden utilizar con sistemas HPLC; Se prefieren las bombas cuaternarias.

¿Pueden las columnas caracterizar la poliadenilación de ARNm?Las columnas CIMac Oligo dT se pueden utilizar para cuantificar el contenido de ARNm poliadenilado.

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