Análisis de β

Dec 04, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9180 (2023) Citar este artículo

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El factor de crecimiento nervioso β (NGF) es una neurotrofina que desempeña un papel fundamental en el desarrollo fetal durante la gestación. ProNGF es la forma precursora de NGF con un perfil biológico distinto. Con el fin de investigar el papel de NGF y proNGF en hembras humanas preñadas, se desarrolló y calificó un ensayo de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de inmunoafinidad sensible y selectivo para medir simultáneamente los niveles de NGF total (tNGF; suma de maduro y proNGF) y proNGF. utilizando estrategias de cuantificación completa y relativa, respectivamente. El ensayo se utilizó para determinar los niveles séricos de tNGF y proNGF en los tres trimestres gestacionales del embarazo y en controles de mujeres no embarazadas. La media de tNGF ± SD fue de 44,6 ± 12,3, 42,6 ± 9,3, 65,4 ± 17,6 y 77,0 ± 17,8 pg/mL para los trimestres sin embarazo, primero, segundo y tercero, respectivamente, lo que demuestra que no hubo un aumento significativo en el tNGF circulante entre el control y el primer trimestre, y un aumento moderado pero significativo de 1,7 veces durante la gestación. Los niveles de proNGF durante el primer trimestre no cambiaron en comparación con el control. Sin embargo, a diferencia del tNGF, los niveles de proNGF durante la gestación permanecieron estables sin cambios significativos. Se espera que el desarrollo de este ensayo duplicado de inmunoafinidad sensible y novedoso para tNGF y proNGF permita aclarar aún más las funciones que desempeñan estas neurotrofinas en el embarazo humano, así como en otros modelos.

El factor de crecimiento nervioso β (NGF) y su precursor proNGF son neurotrofinas importantes que tienen diferentes funciones. El NGF promueve el crecimiento, el desarrollo y la diferenciación neuronal y, en general, es neuroprotector1, mientras que el proNGF tiene una funcionalidad aparentemente contradictoria2 y se ha encontrado que se sobreexpresa en los cánceres de tiroides en comparación con los normales3. Los informes publicados indican tanto el apoyo al crecimiento y supervivencia de las neuronas4,5, como la muerte neuronal6,7. proNGF es la forma dominante que existe en el cerebro, con poco o ningún NGF maduro presente8,9. Curiosamente, el papel de la relación entre proNGF y NGF maduro en las células neurales10,11 y, posteriormente, el papel de la expresión y señalización del receptor8,12,13 por parte de estas distintas proteínas parece ser un factor importante en las enfermedades neurodegenerativas14,15. Las dos proteínas existen en equilibrio, y la alteración de ese equilibrio puede hacer que funcionen antagónicamente entre sí16. Por ejemplo, la maduración defectuosa del NGF, que da como resultado una mayor proporción de proNGF a NGF maduro en el cerebro de las ratas, contribuye a la progresión temprana de la encefalopatía diabética inducida experimentalmente17. Además, una relación desequilibrada entre proNGF y NGF maduro parece ser un indicador temprano de complicaciones de la diabetes en general18. La regulación inadecuada o la disfunción del NGF también pueden estar implicadas en trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer19,20,21,22, la degeneración macular relacionada con la edad23,24,25,26, la lesión retiniana27 y la esclerosis múltiple28, y el NGF también se ha investigado por un papel terapéutico en la enfermedad neurodegenerativa glaucoma24. Desde su descubrimiento y aislamiento29,30, se reconoce que el NGF tiene efectos sobre el desarrollo de los sistemas nerviosos31,32,33 y juega un papel clave en la modulación nociceptiva del adulto34,35. Por lo tanto, el NGF ha sido ampliamente estudiado por su importancia terapéutica y se busca cada vez más como un objetivo terapéutico potencial en el dolor nociceptivo y la oncología36,37.

Las neurotrofinas también están involucradas en procesos relacionados con el embarazo. Se ha demostrado que tanto la expresión de NGF materno como fetal está elevada en los trimestres primero a tercero del embarazo, lo que implica un papel importante tanto en la implantación del óvulo como en el aumento de la vascularización materna en las últimas etapas del embarazo38,39. Se ha demostrado que la suplementación con NGF aumenta la vascularización del endometrio en ciertos mamíferos40, lo que podría explicar una compensación de la vascularización por el NGF elevado en la circulación placentaria en los partos con preeclampsia41, mientras que los niveles más bajos de NGF en plasma del cordón umbilical y placentario están asociados con partos prematuros42. Además, los niveles más bajos de NGF debido a un factor externo, como la adicción a los opioides, se asocian con resultados adversos del embarazo significativamente más altos, que incluyen anomalías cognitivas, muerte neonatal, problemas respiratorios y puntajes de Apgar más bajos43.

La proporción de proNGF a NGF maduro también puede desempeñar un papel similar al de los trastornos neurodegenerativos, como se describió anteriormente, pero probablemente sea responsable de la ruptura de los nervios simpáticos uterinos durante la gestación y de la reinervación de los nervios uterinos durante la recuperación posparto44,45, y la distribución desequilibrada de NGF en el tejido placentario está asociada con abortos espontáneos en humanos46. Se demostró que los niveles de NGF estaban elevados en los recién nacidos humanos en el día 4 en comparación con la sangre del cordón umbilical (después de una disminución inicial en el día 1), mientras que otras neurotrofinas disminuyeron significativamente47. Junto con las asociaciones positivas de interleucinas específicas con la resistencia y la secreción de insulina, el NGF fue mayor en las pacientes con diabetes gestacional y estuvo fuertemente relacionado con el metabolismo de la glucosa, la resistencia a la insulina y la función de las células β pancreáticas en mujeres chinas embarazadas en el segundo trimestre.

El trabajo anterior que utilizó el ensayo LCMS para NGF demostró un aumento grande y continuo en la expresión de NGF (hasta ~ 78x) durante la gestación en monos cynomolgus, sin diferencias en los niveles circulantes entre las poblaciones de control de machos y hembras no embarazadas48. Aunque se ha demostrado un gran aumento en los niveles circulantes de tNGF en monos cynomolgus48, este fenómeno no se ha informado en el embarazo humano, lo que parece apuntar a diferencias específicas de especie durante el embarazo. Si bien un equilibrio de los niveles sistémicos de NGF es importante para la progresión óptima del embarazo, la expresión del ARNm de NGF en el embarazo humano normal frente a pacientes con aborto espontáneo de trofoblastos aislados mostró un aumento de ~ 2 a 8 veces en este último. Este resultado fue consistente con el aborto espontáneo en modelos de ratones cuando se administró una dosis suprafisiológica de NGF al comienzo del embarazo46, y se ha demostrado que los niveles de NGF aumentan en ratones lactantes posgestacionales49. Curiosamente, los niveles de NGF en el útero de rata se reducen durante la mitad y el final del embarazo en comparación con los controles, lo que se correlaciona con la degeneración conocida del nervio miometrial45. De manera similar, la expresión de NGF está elevada en la diabetes mellitus y se demostró que es un factor protector en la neuropatía diabética y la vasculopatía50,51,52,53, pero también estaba elevada e implicada en la resistencia a la insulina en mujeres chinas con diabetes gestacional en el segundo trimestre54. Lobos et al., también demostraron que los niveles de proNGF aumentan durante la gestación posiblemente debido a un procesamiento deficiente de la forma pro a la forma madura44,45.

Colectivamente, los estudios antes mencionados han avanzado en el conocimiento de las diversas funciones de NGF y proNGF durante el embarazo. Sin embargo, el análisis de NGF y proNGF en general se realizó sin ensayos calificados y selectivos y los conjuntos de datos informados parecen tanto comparables como divergentes. Por lo tanto, sigue sin confirmarse si las diferencias notificadas en las concentraciones de NGF y proNGF y, por lo tanto, las conclusiones alcanzadas, al menos en algunos casos, pueden confundirse con las diferencias y la variabilidad de los ensayos16. Esto enfatiza la necesidad de caracterizar, mejorar y calificar potencialmente los ensayos de proNGF y NGF para ganar confianza en las conclusiones16.

Utilizando un enfoque previamente calificado de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de inmunoafinidad (IA-LC-MS/MS) para la cuantificación de tNGF en suero humano55,56,57, ampliamos el ensayo para incluir una cuantificación relativa de proNGF. Con este análisis que utiliza un ensayo de espectrometría de masas altamente selectivo y sensible, tenemos la intención de confirmar los niveles de tNGF durante la gestación humana e incorporar una medida cuantitativa relativa de la proteína precursora. La capacidad del ensayo para discernir proNGF permite evaluar los cambios en los niveles séricos de proNGF durante el embarazo. Usamos este enfoque para evaluar los niveles de tNGF y proNGF en el suero de mujeres embarazadas cerca del punto medio de cada trimestre en comparación con una cohorte de mujeres no embarazadas. Estos datos ahora se pueden usar para comprender mejor el papel de NGF y proNGF durante la gestación en el embarazo humano.

Era necesario un péptido sustituto para proNGF para dar una representación equimolar de la proteína proNGF; es decir, por cada mol de proNGF, se necesitaba generar 1 mol del péptido sustituto después del tratamiento con tripsina. Se seleccionó un péptido tríptico VLFSTQPPR derivado de la región propeptídica de proNGF en base a criterios específicos para cumplir los objetivos del ensayo como se describe aquí: principalmente la especificidad para el péptido proNGF en un dominio no presente en la forma madura de NGF; en segundo lugar, alta antigenicidad prevista que permite la generación de un anticuerpo antipéptido específico; finalmente, la capacidad de lograr una señal robusta en el espectrómetro de masas. El segundo péptido tríptico utilizado en este estudio fue IDTACVCVLSR, que se utilizó previamente en ensayos de LC-MS/MS para mediciones de NGF. Los criterios de selección para el péptido IDTACVCVLSR se han descrito previamente55. Este péptido se encuentra cerca del extremo C de las proteínas maduras NGF y proNGF y, por lo tanto, representa contribuciones de ambas formas de proteína en una medición combinada de tNGF.

Necesario para el desarrollo del ensayo, el anticuerpo de captura utilizado para este ensayo tendría que ser capaz de unirse tanto al NGF maduro como al proNGF. La unión del anticuerpo de captura policlonal a ambas proteínas se confirma mediante la detección específica de ambos péptidos sustitutos. Además, antes del estudio de calificación, el sondeo repetido de los sobrenadantes después del enriquecimiento de anticuerpos del suero humano confirmó que el anticuerpo de captura tiene una recuperación casi completa de ambas formas de proteína.

El método se calificó con tres lotes individuales llevados a cabo en días separados. El rango de cuantificación en suero humano para tNGF es de 10,0 a 640 pg/mL utilizando criterios de aceptación de precisión relativa de < 25 % (30 % en LLOQ). Se representaron ocho niveles de concentración estándar de calibración (incluido el punto 0) en las curvas finales con un mínimo de seis puntos distintos de cero requeridos. En la Fig. 1A se muestra una curva de calibración típica obtenida durante la calificación del ensayo. El rango de CV para todos los estándares de calibración fue de 4,80 a 16,6 % y un rango de RE de -5,20 a 12,4 %. Solo se eliminaron cuatro puntos de calibración individuales de las curvas de calibración a lo largo de las tres ejecuciones por lotes separadas. Fuera de la aceptación, se eliminaron los puntos individuales de la curva y se volvió a realizar la regresión del ajuste de la curva. La precisión y la exactitud relativa del tNGF se evaluaron en el mismo lote de suero durante todo el estudio de calificación, lo que arrojó una media interensayo de 30,0 pg/mL (QC2; nivel de tNGF endógeno), con la dilución doble de QC2 (QC1) teniendo un valor interensayo media de 12,8 pg/mL. Para los QC enriquecidos, es decir, QC3 y QC4, la media interensayo determinada para el nivel endógeno de NGF en QC2 se añadió a la concentración de NGF enriquecido para calcular la precisión relativa. Los datos de control de calidad individuales, intraensayos e interensayos y las estadísticas resumidas para tNGF se muestran en la Tabla 1.

(A) Curva de calibración representativa para tNGF. (B) tNGF en muestras de embarazo (1) control, (2) 1.er trimestre, (3) 2.º trimestre, (4) 3.er trimestre. (C) proNGF (1) control, (2) 1.er trimestre, (3) 2.º trimestre, (4) 3.er trimestre.

Para los QC enriquecidos, es decir, QC3 y QC4, la media interensayo determinada para el nivel endógeno de tNGF en QC2 se añadió a la concentración de NGF enriquecido para calcular la precisión relativa. Los datos de control de calidad individuales y entre ensayos y las estadísticas resumidas para tNGF se muestran en la Tabla 1.

La precisión y la exactitud relativa de proNGF se demostraron en los mismos tres lotes utilizados para la calificación de tNGF en tres días separados en cinco niveles diferentes. Los valores que se muestran en la Tabla 2 son las relaciones de área de pico (PAR) de la señal de péptido ligero a péptido pesado. El porcentaje de error relativo (RE %), como una medida de la precisión relativa, se calculó utilizando los valores promedio de PAR determinados experimentalmente para los QC altos y bajos (proQCL y proQCH) y comparando la respuesta PAR experimental con la teórica extrapolada para los QC mezclados (proQCM1 , proQCM2 y proQCM3). La media interensayo, el % de CV y ​​el % de RE para los QC de calificación de proNGF fueron proQCL 0,0699, 18,4 % (sin RE); proQCM1: 0,115, 25,6 %, 19,1 %; proQCM2: 0,131, 22,4%, 7,09%; proQCM3 0,156, 15%, 4,69%; proQCH: 0,175, 18,2% (No RE) respectivamente. El rango de CV entre ensayos de proNGF fue de 15,0 a 25,6 %, con un rango de RE de 4,69 a 19,1 %.

Observamos una diferencia de 2,6, 2,5 y 2,0 veces en las señales entre proQCH y proQCL para las ejecuciones de calificación 1, 2 y 3 respectivamente, lo que da una diferencia promedio de 2,37 veces durante la calificación (Fig. 2).

La PAR media de proNGF L:H (proporción de área de pico ligera:pesada) para todos los QC de proNGF generados al mezclar proQCL con proQCH mostró un aumento de 2,37 veces en la PAR de proNGF L:H de proQCL a proQCH.

Durante el análisis de las muestras, todos los valores de tNGF para QC y desconocidos se analizaron en paralelo en dos placas de 96 pocillos con una curva de calibración de cuatro réplicas, y las muestras de QC se dividieron entre las dos placas. Los errores relativos se calcularon usando el nivel endógeno medido para QC2 en la fecha del análisis, agregado a la cantidad de NGF enriquecido (Tabla S1). Los QC de proNGF pasaron los criterios de aceptación basados ​​en el CV y ​​el error relativo de la concentración nominal determinada por el nivel de proNGF medido para proQCL y proQCH en la fecha del análisis, utilizando la media de proQCH y proQCL con el esquema de mezcla apropiado para calcular la concentración teórica. relación para proQCM2 (Tabla S2).

Los valores de tNGF y proNGF en la cohorte se agrupan por trimestre, así como el control no embarazada (Fig. 3). Los datos muestran aumentos significativos en los niveles circulantes de tNGF desde el grupo de control hasta el segundo y tercer trimestre, y ningún aumento significativo en los niveles circulantes de proNGF en esos mismos grupos. No se encontraron covariables significativamente asociadas con tNGF. Obtuvimos información sobre la edad de los 103 pacientes y se realizó un análisis asociado a la edad en ambos péptidos. Entre 103 pacientes con datos de tNGF, la correlación de rango entre la edad de los sujetos individuales y el tNGF es -0,153 con un valor de p de 0,126. La correlación de rango entre la edad de los sujetos individuales y proNGF es 0,124 con un valor de p de 0,220. En un modelo de regresión lineal, ajustando por trimestre, no existe una asociación significativa entre tNGF y la edad con un valor de p de 0,079; o entre proNGF y la edad con un valor de p de 0,173 (Figura S1). Los cromatogramas de iones representativos para tNGF y proNGF de control seleccionado no embarazada, sujetos del primer, segundo y tercer trimestre se muestran en la Fig. 1B, C respectivamente. Los valores individuales para la cohorte de embarazo humano para tNGF y proNGF se pueden encontrar en la información complementaria (Tabla S3 y Tabla S4, respectivamente).

(A) niveles de tNGF y (B) proNGF en cohortes sin embarazo y con embarazo desglosadas por trimestre. Debajo de cada gráfico se muestran la media y la desviación estándar (DE) de cada grupo, así como el valor de p en comparación con el grupo de control (no embarazadas). Las líneas indican la media de cada grupo.

En este informe describimos tanto la medición cuantitativa de tNGF en suero humano utilizando IA-LC-MS/MS55 de una cohorte de mujeres embarazadas y no embarazadas, así como la novedosa cuantificación relativa de proNGF utilizando la misma metodología en un ensayo dúplex. formato. La adaptación del ensayo a un formato dúplex permitió la medición de ambas proteínas en una sola ejecución, ya que el ensayo IA-LC-MS/MS requiere solo un único reactivo de anticuerpo de captura. Los niveles basales de tNGF en suero medidos en el suero de control fueron comparables a los niveles encontrados previamente a través de IA-LC-MS/MS55 y, aunque se están utilizando ensayos de unión de ligandos de mayor sensibilidad para NGF, se mantuvieron medibles con una sensibilidad diez veces mayor que algunos publicados anteriormente. Estudios ELISA58.

Aquí demostramos que los niveles medios de tNGF no cambian significativamente entre el control no embarazada y el primer trimestre. Sin embargo, los niveles aumentaron del primer trimestre al segundo, y de nuevo aunque más modestamente del segundo al tercero (1,5 veces y 1,1 veces respectivamente) pero con significación estadística basada en el valor de p (Fig. 3). El aumento general medio desde el último trimestre del embarazo en comparación con el grupo de control de no embarazadas fue de 1,7 veces y fue significativo, según los valores de p. Este aumento fue mayor que la variabilidad observada establecida durante la calificación del ensayo. Estudios previos han mostrado cambios pequeños, no significativos, en los niveles circulantes de NGF maduro durante la gestación humana59,60 y aunque los datos contenidos en este estudio muestran un aumento pequeño pero significativo en el tNGF durante la gestación, en general está de acuerdo con los valores publicados previamente48, 59.

Según los valores de p, los niveles de proNGF no cambiaron significativamente durante el transcurso de la gestación. Se ha demostrado que los niveles circulantes de proNGF (o derivados escindidos) se pueden medir mediante ELISA y varían según las condiciones de la enfermedad, aunque falta la caracterización bioanalítica del ensayo61. Previamente, se ha demostrado que los niveles de proNGF aumentan durante la gestación en los tejidos del útero murino; sin embargo, como se observó con la variación entre especies en los niveles de NGF, puede ser difícil comparar los niveles de proNGF en términos de valores circulantes absolutos entre especies45. Los niveles de proNGF ciertamente no aumentaron en el embarazo humano como se ha observado en ratas45, lo que destaca la posible diferencia general en el papel de proNGF en el embarazo entre especies. Sin embargo, esto también destaca la necesidad de utilizar ensayos cuidadosamente calificados para afirmar que los cambios observados en los niveles maduros de NGF o proNGF no se confunden con problemas bioanalíticos.

Aquí establecemos un método LC-MS/MS sensible y selectivo para la detección de tNGF y proNGF que se pueden medir simultáneamente, lo que brinda especificidad a la medición de estas neurotrofinas en sus diversas funciones como biomarcadores en la gestación, el desarrollo del sistema nervioso y la enfermedad. estados en comparación con las tecnologías actualmente utilizadas.

El factor de crecimiento nervioso β humano recombinante liofilizado (rhβ-NGF) (n.º de catálogo 256-GF-100; R&D Systems, Minneapolis, MN) se preparó en albúmina sérica bovina al 0,2 % (n.º de catálogo Millipore-Sigma, Burlington, MA) en 10 Solución salina tamponada con fosfato mM, pH 7,4. Se agruparon lotes de suero humano de BioIVT (Various; Westbury, NY). Los péptidos marcados con isótopos estables NGF-H2N-AWRFIRIDTACVCV[+7 Da]L[+6 Da]SRKAVRRA-OH (New England Peptides, Gardner, MA) y proNGF—H2N-LRSPRVLFSTQPPR[+10 Da]EAADT-OH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) se cuantificaron mediante análisis de aminoácidos, se almacenaron a 5 nmol/ml a -80 °C y se usaron para generar la solución madre de péptido estándar interno a concentraciones de 6,67 y 1,67 pmol/µl, respectivamente, y luego se diluyeron a 0,90 y 0,23 fmol/µL respectivamente. El anticuerpo anti-β-NGF policlonal de cabra (n.º de catálogo AF-256 R&D Systems, Minneapolis, MN) se biotiniló usando EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce Protein Research Products/Thermo Scientific; Rockford, IL) en PBS. El anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad de ligando contra el péptido derivado de NGF tríptico IDTACVCVLSR se obtuvo de New England Peptide (Gardner, MA), y el anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad de ligando contra el péptido derivado de proNGF tríptico VLFSTQPPR se obtuvo de ThermoFisher Scientific (Waltham , MA). Las columnas de anticuerpos antipéptido se prepararon como se indicó anteriormente con los anticuerpos (aproximadamente 1,0 mg por péptido) conjugados con proteína G (Poros-G Applied Biosystems, Bedford, MA) usando pimelimidato de dimetilo (Pierce Protein Research Products/Thermo Scientific; Rockford, IL) para entrecruzamiento. La matriz sustituta (solución de leche al 1 %) se preparó disolviendo 0,5 g de leche en polvo en 50 ml de agua Milli-Q estéril y luego se diluyó a soluciones de trabajo en la matriz sustituta.

Se preparó una matriz sustituta en agua Milli-Q estéril. Se usó suero humano como QC para NGF y proNGF QC bajo. Previamente analizados, se usaron lotes agrupados de suero humano de BioIVT como proNGF QC high así como en el esquema de mezcla de proNGF QC descrito anteriormente.

Se añadió una alícuota de 200 μl de suero, calibradores o muestra de control de calidad (QC) a una placa de pocillos profundos Eppendorf LoBind, después de la dilución con 650 μl de BSA al 0,5 % en PBS 10 mM. Se añadieron 10 μL de anticuerpo anti-NGF biotinilado a cada muestra y la placa se selló y agitó a 4°C durante la noche (550 rpm). Se resuspendieron las Dynabeads Streptavidin MyOne C1 y se lavaron una vez con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se añadieron 25 μL de perlas C1 a cada muestra y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 45 min con agitación (1000 rpm). Luego, las muestras se colocaron en el Hamilton Star para el procesamiento de perlas. La muestra y las perlas resuspendidas se transfirieron a una placa de recolección Protein Lobind de 0,5 ml en transferencias de 5 × 300 µl (incluido el lavado/transferencia final). Durante cada transferencia, las muestras se dejaron reposar en un soporte magnético durante 4 min y el sobrenadante se aspiró hasta desecharlo. Se realizaron dos lavados secuenciales con 300 µl de CHAPS al 0,1 % en PBS y un lavado final con 300 µl de PBS 10 mM; las muestras se dejaron reposar en un soporte magnético durante 4 min y el sobrenadante se aspiró hasta desecharlo. Las proteínas se eluyeron con 140 µL de HCl 30 mM en ACN al 5 % en agua, se mezclaron durante 5 min, se dejaron reposar en un soporte magnético durante 5 min y el sobrenadante se transfirió a la placa de recolección final y se neutralizó con 35 µL de TRIS 1 M, pH 8,3. Se agregaron diez µL de solución de trabajo de patrón interno a cada pocillo. El trabajo final incluyó agregar 15 µl de solución reductora de TCEP 75 mM (preparada fresca antes de la adición) e incubar a 60 °C durante aproximadamente 45 min. La placa se dejó enfriar a TA durante aproximadamente 10 min; y se añadieron 15 µl de IAA 150 mM a cada pocillo de muestra y se incubaron en la oscuridad a TA durante aproximadamente 35 min. Finalmente, la digestión de la muestra se llevó a cabo con 10 µL de solución LysC/Tripsina 100 µg/mL a 37 °C durante la noche.

Se inyectaron 85 µl en un sistema de HPLC que contenía una columna de anticuerpos antipéptido para enriquecer los péptidos trípticos de interés antes de la cromatografía de nanoflujo de fase inversa compuesta por Ultimate 3000 (ThermoFisher Scientific) con los siguientes módulos: Muestreador automático controlado por temperatura WPS-3000RS equipado con un Bucle de muestra de 250 µL; bomba binaria de separación rápida HPG-3400RS (microbomba); Sistema NCS-3500RS Nano LC (bomba de carga y bomba Nano); horno de columna TCC-3200RS (columna de anticuerpos); Horno de columna NCS 3500 RSC que encierra la válvula 2, 3 y la columna trampa (cartucho precolumna Thermo µ N/P 164649) equipado con un Acclaim PepMap100 C18, 5 µm, 100 Å 300 µm d.i. × 5 mm (60 °C). El LC se conectó a un triple cuadrupolo Thermo Quantiva con una fuente de ionización Thermo Fisher Easy Spray. La columna analítica es Thermo Easy Spray PepMap C18, 75 µm × 15 cm (p/n ES800) (60 °C). Las transiciones MRM monitoreadas en el ensayo LC-MS/MS para ambas proteínas se pueden encontrar en la Tabla S5.

El ensayo se calibró con estándares a 0, 10, 20, 40, 80, 160, 320 y 640 pg/ml de NGF en leche al 1 % (n = 2). Las concentraciones de NGF en las muestras de control de calidad o los desconocidos se volvieron a calcular en TraceFinder 4.1 General Quan utilizando un análisis de regresión lineal (ponderado: 1/ × 2) aplicado a la curva de calibración. La precisión y la exactitud del análisis de tNGF se probaron en 3 días diferentes en cuatro niveles y con seis repeticiones utilizando QC1 (0,5 × endógeno), QC2 (niveles de tNGF endógeno, sin añadir), QC3 (endógeno + 45 pg/ml de NGF) y QC4 (endógeno + 450 pg/mL NGF). Se realizó una evaluación de la estabilidad durante 1 ciclo de congelación y descongelación para QC3 y QC4 a -70 °C (n = 6); ya temperatura ambiente durante 4 h a niveles de QC3 y QC4 (n = 6).

Para la evaluación analítica de la corrida de cohortes de embarazo; se distribuyeron cuatro réplicas de cada estándar de calibración en las dos placas de 96 pocillos y las muestras de control de calidad a niveles de QC2; QC3 y QC4 se dividieron entre ambas placas con un n de 8 para cada nivel (n de 4 en cada placa).

Se utilizó un enfoque de cuantificación relativa para proNGF que no incluía el uso de un estándar de calibración. En su lugar, se ideó un esquema de mezcla adicional para medir lotes de suero humano que eran altos (proQCH) y bajos (proQCL) para proNGF. El suero Millipore-Sigma se usó para proQCL y el proQCH se hizo combinando lotes de suero BioIVT que se determinó por separado que tenían niveles altos de proNGF. Los tres niveles medios de QC se hicieron mezclando proQCL y proQCH en diferentes proporciones: proQCM1: 75% proQCL y 25% proQCH; proQCM2 50% proQCL y 50% proQCH; proQCM3 25% proQCL y 75% proQCH. La medición de proNGF se llevó a cabo estableciendo la relación entre el área de señal del péptido ligero y la del péptido pesado (marcado con isótopos estables).

Hubo cuatro cohortes en este estudio, incluidas mujeres embarazadas que proporcionaron muestras en tres trimestres (Grupo I: primer trimestre, semanas 1 a 13, n = 24; Grupo II: segundo trimestre, semanas 14 a 26, n = 28; Grupo III: tercer trimestre trimestre, semanas 27–40, n = 22) con muestras tomadas cerca del punto medio de cada trimestre y las muestras de control (Grupo IV: no embarazadas, n = 29). La cohorte de no embarazadas de control se eligió para que coincidiera lo más posible con las cohortes de embarazadas. Las integrantes de las cohortes de embarazo son de etnia caucásica, mayores de 18 años, con embarazo confirmado por prueba de HCG y/o ecografía. Las muestras provienen de una cohorte separada de mujeres en cada etapa del embarazo. Los sujetos fueron excluidos si tenían antecedentes de uso de drogas ilícitas, infecciones actuales, incluido el VIH, zika, enfermedades de transmisión sexual transmitidas por la sangre, anemia de células falciformes o cualquier otra enfermedad conocida que pudiera afectar fisiológicamente al estudio. También se excluyeron infecciones previas de hepatitis B/C, VIH-1, VIH-2, sífilis y tuberculosis. La información sobre el resultado del embarazo, como parto vivo, embarazo único o gemelos, no estuvo disponible. El suero fue recolectado por Cureline, Inc. (Brisbane, CA, EE. UU.) con la aprobación ética obtenida de la Junta de Revisión Institucional de WCG (WCG IRB Reference No.: 20140236; Cureline Study No. 1144700). Este IRB cumple plenamente con las buenas prácticas clínicas definidas en las reglamentaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de EE. UU., las reglamentaciones del Departamento de Salud y Servicios Humanos (HHS) de EE. UU. y las pautas de la conferencia internacional sobre armonización (ICH). Los participantes dieron su consentimiento informado por escrito de que sus muestras pueden usarse en investigación biomédica. Todos los métodos analíticos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y mejores prácticas pertinentes de Pfizer.

Se determinó previamente que las concentraciones de tNGF en sujetos sanos en suero tenían un coeficiente de variación de alrededor del 30 %55. Por lo tanto, este estudio fue diseñado y potenciado para detectar una diferencia del 25 al 30 % en la concentración de tNGF entre dos grupos: requiere un tamaño de muestra de alrededor de 20 a 25 por grupo con una potencia del 80 %. Se realizaron análisis estadísticos para comparar el segundo y tercer trimestre con el primero, así como las tendencias lineales tanto en los semestres como en los cuatro grupos. Se aplicó la transformación logarítmica al tNGF para estabilizar su variabilidad entre grupos antes del análisis estadístico. El efecto del embarazo se analizó en un modelo de análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Las posibles covariables se examinaron y ajustaron si estaban significativamente asociadas con tNGF o proNGF. Las comparaciones entre diferentes trimestres y mujeres no embarazadas, así como la tendencia lineal entre trimestres, se probaron utilizando contrastes bajo el modelo ANOVA. No se requirieron ajustes para comparaciones múltiples y la significación estadística se logró cuando los valores de p fueron inferiores a 0,05 (ver Fig. 3). Todos los análisis se realizaron en R 3.5.0.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Esta investigación fue patrocinada por Pfizer Inc. Cureline Inc., proporcionó la cohorte de muestras de embarazo para su análisis.

Pfizer Inc., 1 Burtt Road, Andover, MA, 01810, EE. UU.

Jason Walsh, Joe Palandra y Hendrik Neubert

Pfizer Inc., 1 Portland St, Cambridge, MA, 02139, EE. UU.

Eduardo Goihberg

Pfizer Inc., 10777 Science Center Drive, San Diego, CA, 92121, EE. UU.

Shibing Deng

Pfizer Inc., 445 Eastern Point Road, Groton, CT, 06340, EE. UU.

Susana Hurst

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Diseño y concepto del estudio: JW, JP, HN, SH Ensayo realizado y otras investigaciones: JW, JP, EG Análisis e interpretación de datos: JW, JP, HN, SH, SD Redacción del manuscrito: Todos los autores. Revisión y revisión del contenido del manuscrito: Todos los autores.

Correspondencia a Jason Walsh.

Los autores declaran los siguientes intereses financieros en competencia: Todos los autores son, o en el momento en que se realizaron estos estudios, eran empleados de Pfizer Inc.

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Walsh, J., Palandra, J., Goihberg, E. et al. Análisis del factor de crecimiento del nervio β y su precursor durante el embarazo humano mediante espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de inmunoafinidad. Informe científico 13, 9180 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34695-7

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Recibido: 14 diciembre 2022

Aceptado: 05 mayo 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34695-7

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