Cromatografía de par de iones

Mar 13, 2023

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La cromatografía de analitos cargados a menudo es un desafío, ya que no se retienen de manera efectiva en las columnas de fase inversa de uso común y eluyen en el volumen muerto. En columnas con fases estacionarias polares o acuosas, las formas de los picos pueden ser malas debido a una retención excesiva. Las columnas de intercambio iónico que utilizan fases estacionarias cargadas para separar iones de carga opuesta son costosas, adecuadas para una pequeña variedad de analitos y tienen una eficiencia de separación limitada. La cromatografía de pares de iones (IPC) es una alternativa adecuada para la cromatografía de especies iónicas o polares.

¿Qué es la cromatografía de pares iónicos?

¿En qué se diferencia la cromatografía de fase inversa de par iónico de otros tipos de cromatografía iónica?

- Mecanismo de retención

- Factores que afectan la retención

- Papel del efecto del par iónico

- Análisis ambiental

- Análisis farmacéutico y alimentario

- Análisis biológico

- Análisis de metales

Conclusión

IPC es un tipo de cromatografía iónica que se utiliza para separar analitos hidrófilos o cargados en columnas que utilizan fases estacionarias "neutras" o de fase inversa que no llevan cargas. Se trata de modificar la polaridad de los analitos cargados mediante su interacción con un reactivo de apareamiento de iones que se añade a la fase móvil. Estas moléculas de reactivo llevan cargas opuestas a las de los iones del analito con los que pueden formar enlaces electrostáticos. Los pares formados entre los analitos y los iones reactivos se comportan como restos hidrofóbicos neutros que se pueden separar en columnas C18 o C8. El IPC se utiliza para la separación de ácidos orgánicos polares, bases y iones de zwitter, así como de iones inorgánicos.

Los reactivos de emparejamiento de iones también se conocen como aditivos de emparejamiento de iones o hetaerons. Como estas moléculas tienen un grupo de cabeza polar y cadenas de hidrocarburo hidrofóbico, se asemejan a un jabón (Figura 1). En consecuencia, esta técnica se denominó "cromatografía de jabón" cuando Göran Schill la introdujo en 1973.1,2 También se la conoce como cromatografía de interacción iónica, ya que el ión reactivo interactúa con la fase estacionaria para regular la retención de iones presentes en la muestra. .

La cromatografía iónica (IC) se refiere ampliamente a la separación de iones e incluye tres mecanismos distintos, a saber, intercambio de iones, exclusión de iones y emparejamiento de iones. Cuando la separación se produce por interacción competitiva entre los iones del analito y los iones del eluyente para los sitios de carga opuesta en la fase estacionaria (Figura 2), el tipo de cromatografía se denomina cromatografía de intercambio iónico (IEX).

Una mezcla de analitos no disociados, parcialmente disociados y totalmente disociados se puede separar mediante cromatografía de exclusión iónica (IEC), que también utiliza fases estacionarias cargadas (Figura 3). La fase móvil se acumula en la superficie y dentro de los poros de la fase estacionaria dando lugar a la formación de una "fase ocluida". Los analitos neutros se retienen fuertemente en la fase ocluida y eluyen en último lugar de la columna. Los analitos parcialmente disociados que tienen una interacción ligeramente menor con la fase móvil adsorbida eluyen antes. Los analitos completamente disociados y cargados que son repelidos por los iones cargados de manera similar de la fase estacionaria, la "membrana de Donnan", eluyen primero, por completo en el volumen vacío de la columna.

La cromatografía de fase inversa de pares iónicos se lleva a cabo en columnas de "fase inversa" no polares mediante la adición de reactivos de par iónico a la fase móvil. Por ejemplo, el ácido trifluoroacético se usa para emparejarse con péptidos cargados positivamente, mientras que las trialquilaminas se usan para emparejarse con aniones como carboxilatos u oligonucleótidos.

La cromatografía iónica en fase móvil (MPIC) es un término que se utiliza a menudo en el contexto de la separación de pequeños iones inorgánicos mediante IPC, seguida de su detección mediante la medición de la conductividad suprimida. Esta técnica es adecuada para el análisis de moléculas con cargas localizadas.

Se inyectan unos pocos microlitros de solución de muestra en una columna de fase inversa. Cuando la fase móvil que contiene el reactivo de apareamiento de iones fluye a través de la columna, los iones del analito interactúan con los iones del reactivo con carga opuesta y forman complejos neutros que se pueden separar en una fase estacionaria no polar. La separación de los analitos está controlada por el reactivo de apareamiento de iones, los modificadores orgánicos y las sales añadidas a la fase móvil.

Los métodos espectroscópicos ultravioleta (UV) y de fluorescencia son las técnicas de detección más utilizadas para IPC. También se ha informado sobre el uso de otras técnicas como la espectrometría de masas (EM) y la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS)3. La medición de la conductividad es un método bien establecido para la detección de iones inorgánicos por IC, pero se usa con menos frecuencia para IPC.4

Se han propuesto diferentes modelos para explicar el mecanismo de separación observado en IPC.5 En el modelo de apareamiento de iones, también llamado modelo de partición, se considera que la interacción entre los iones del analito y los iones del reactivo de apareamiento ocurre en la fase móvil. Los iones del analito junto con los contraiones forman un resto no polar que puede adsorberse en la fase estacionaria hidrofóbica. El complejo de par de iones se eluye posteriormente aumentando la concentración de modificador orgánico en la fase móvil (Figura 5).

El modelo de intercambio iónico, también llamado modelo de adsorción, implica la adsorción de la cadena alquílica lipofílica de las moléculas del reactivo de apareamiento iónico en la fase estacionaria. Los grupos de cabeza polar libres de las moléculas adsorbidas actúan como un pseudo intercambiador de iones para los iones del analito con carga opuesta (Figura 6).

En el modelo de interacción iónica, también llamado modelo electrostático, se cree que se forma una doble capa eléctrica cuando una columna se equilibra con la fase móvil que contiene un agente de apareamiento de iones. La cadena hidrocarbonada no polar de estos restos se une a la columna. Los grupos de cabeza polar forman una capa estacionaria de cargas, mientras que los contraiones del reactivo de apareamiento de iones en la fase móvil forman la capa con carga opuesta. Los iones del analito experimentan una atracción electrostática hacia las cargas estacionarias y pueden penetrar la doble capa. La interacción coulombiana entre una molécula de analito y la capa "cargada" conduce a una aparente disminución de la carga en la superficie de la fase estacionaria. En consecuencia, una molécula del agente de apareamiento de iones se adsorbe en la superficie de la fase estacionaria para restaurar la carga. En conjunto, esto puede considerarse como la adsorción de dos cargas opuestas, la del analito y la del agente de apareamiento de iones, en la fase estacionaria.

Figura 7: El modelo de interacción iónica para la separación IPC, que muestra la interacción dinámica entre el ion analito, los iones reactivos de emparejamiento iónico y la fase estacionaria. A) El reactivo de apareamiento de iones se une a la fase estacionaria. B) Los iones del analito penetran en la doble capa. C) Los iones del analito se unen al grupo de cabeza polar. D) Una nueva molécula de reactivo de apareamiento de iones se une a la fase estacionaria.

En IPC, se pueden modificar varios parámetros para lograr la separación deseada. Consideremos algunas de las variables que afectan la retención del analito.

Cuando se agregan electrolitos a un solvente, se disocian en sus iones constituyentes y están rodeados por las moléculas del solvente. Pero a medida que disminuye la polaridad del disolvente, disminuye la solvatación de los iones y, debido a la atracción electrostática, aumenta la interacción entre ellos. A medida que aumenta el tamaño de los iones, disminuye la densidad de carga, lo que también conduce a una menor solvatación y una mayor interacción con los iones de carga opuesta. Cuanto mayor es la carga de los iones, mayor es la fuerza de atracción culómbica entre los iones de carga opuesta.

Los reactivos de apareamiento de iones tienen largas cadenas de alquilo o grupos arilo y no están tan solvatados como los iones pequeños con altas densidades de carga. Como resultado, pueden atraer y emparejarse con iones de analito con carga opuesta. Además, cuando los reactivos de apareamiento de iones se adsorben en la fase estacionaria no polar, su solvatación se reduce aún más. Esto les permite formar pares de iones "estrechos" o "íntimos" con moléculas de analito. Estos pares de iones no tienen moléculas de disolvente entre los dos iones. Cuanto mayor sea la carga en el analito y los iones reactivos, más fuerte será el enlace entre ellos.

La elección del reactivo de emparejamiento de iones es quizás el parámetro más importante cuando se utiliza IPC. El tipo de reactivo, su concentración y compatibilidad con la fase móvil y el detector juegan un papel importante en la separación efectiva de los analitos. Se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones al seleccionar un reactivo de par de iones para la muestra que se está investigando.

Aunque la cromatografía de apareamiento de iones proporciona ciertas ventajas sobre otras técnicas como IEX y la cromatografía de fase normal, también tiene limitaciones (Tabla 1). Estos pros y contras deben ser cuidadosamente considerados antes de optar por este modo de separación.

Tabla 1: Fortalezas y limitaciones de IPC.

Fortalezas

Limitaciones

El análisis de una mezcla de compuestos polares, no polares e iónicos que son difíciles de separar mediante otras técnicas se puede lograr eligiendo un reactivo de emparejamiento de iones adecuado y ajustando su concentración.

Se necesitan largos tiempos de equilibrio para que el reactivo de emparejamiento de iones se adsorba en la superficie de la fase estacionaria.

La IPC se puede realizar en columnas C18 o C8 que suelen estar disponibles en la mayoría de los laboratorios

El análisis de gradiente puede ser difícil para IPC, ya que los cambios en la composición de la fase móvil podrían llevar a un equilibrio de la columna más largo.

Tanto los cationes como los aniones se pueden separar usando la misma columna

El reactivo de apareamiento de iones no debe absorber longitudes de onda en las que se lleva a cabo la detección de fluorescencia o UV. La presencia de reactivos absorbentes de luz en la fase móvil puede causar picos fantasma y picos negativos debido a la menor absorbancia del analito en comparación con la fase móvil que contiene el reactivo de apareamiento de iones.

Los reactivos de emparejamiento de iones ayudan a mejorar la retención, las formas de los picos y la resolución

Los agentes de emparejamiento de iones de uso común que tienen una volatilidad limitada tienen una compatibilidad limitada con los espectrómetros de masas. TFA, cuando se usa como modificador, provoca la supresión de la señal en los espectrómetros de masas

Se pueden obtener tiempos de ejecución y límites de detección más bajos en presencia de reactivos de emparejamiento de iones

Es posible que se deban usar columnas dedicadas cuando se trabaja con reactivos IPC

IPC se ha aplicado para el análisis de una amplia variedad de analitos, que van desde muestras ambientales, productos farmacéuticos y alimentos hasta muestras biológicas y metales.

Se han utilizado varios modos de cromatografía, como la cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) e IEX, y diferentes tipos de fases estacionarias, como la de intercambio iónico o la polar, para la separación de moléculas cargadas y polarizables. Sin embargo, IPC se sigue utilizando para su análisis debido a su simplicidad y personalización. Los parámetros que incluyen la elección del reactivo de apareamiento de iones, su concentración, los modificadores orgánicos y los aditivos de la fase móvil se pueden optimizar para lograr la separación deseada.

Referencias

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