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Jun 18, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 9322 (2022) Citar este artículo

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Los estudios de farmacocinética preclínica (PK) en modelos animales durante la fase de desarrollo de la formulación brindan evidencia preliminar y una imagen casi clara del comportamiento de PK del fármaco y/o sus formas de dosificación antes de los estudios clínicos en humanos y ayudan a adaptar la forma de dosificación de acuerdo con el comportamiento clínico esperado y requerido. El presente trabajo informa sobre el primer estudio farmacocinético preclínico de este tipo sobre formas de dosificación oral sólidas de liberación prolongada (ER) de venlafaxina (VEN) en conejos blancos de Nueva Zelanda. El VEN es un agente terapéutico altamente prescrito y uno de los más seguros y efectivos utilizados en el tratamiento de diferentes tipos de trastornos de depresión en todo el mundo. El método LC-MS/MS de monitorización de reacciones múltiples (MRM) desarrollado para este propósito demostró suficiente fiabilidad en la cuantificación simultánea de VEN y su metabolito equipotente O-desmetilvenlafaxina (ODV) en plasma de conejo. El método descrito utiliza extracción en fase sólida para la preparación de muestras seguida de un análisis LC-MS/MS ultrarrápido. La separación cromatográfica se logró isocráticamente con una fase móvil predominantemente polar empleando RPLC. El sistema LC/MS/MS de triple cuadrupolo operado en modo MRM utilizó una sonda ESI como fuente de iones en polaridad positiva. Los resultados de la validación se encuentran dentro de los límites permisibles de las recomendaciones de la FDA de EE. UU. y los criterios de aceptación para la validación de métodos bioanalíticos.

Las pruebas preclínicas para la liberación del fármaco en formas farmacéuticas sólidas orales de liberación prolongada (ER), que también incluyen comprimidos y cápsulas, comprenden estudios de disolución in vitro y farmacocinéticos (PK) in vivo en modelos animales adecuados. El modelo animal preferido debe tener la capacidad de albergar el tipo particular de formulación de ER bajo investigación preclínica1,2,3. Los datos obtenidos de los estudios farmacocinéticos preclínicos brindan evidencia preliminar sobre las tasas y los sitios de absorción del fármaco y un posible mecanismo de distribución, metabolismo y eliminación del fármaco. Estos datos farmacocinéticos preclínicos recopilados en modelos animales también ayudan a evaluar formulaciones prototipo de ER para respaldar el desarrollo y la selección de una forma de dosificación óptima para estudios clínicos de farmacocinética en humanos4,5.

La venlafaxina (VEN), (RS) 1-[2-(dimetilamino)-1-(4-metoxifenil)etil]ciclohexanol, que pertenece a la clase farmacológica de los inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina (IRSN), es un antidepresivo relativamente nuevo y estructuralmente novedoso. El fármaco6 fue introducido por Wyeth en 1993. No tiene relación química con los antidepresivos tricíclicos, tetracíclicos y otros7,8, y actualmente es un fármaco muy recetado y uno de los más eficaces con menos efectos secundarios no deseados utilizados en el tratamiento de los trastornos depresivos9. El VEN se administra por vía oral en formas de dosificación de liberación inmediata (IR) y ER10,11. La acción antidepresiva de VEN y su metabolito activo principal y equipotente, O-desmetilvenlafaxina (ODV)12 (Fig. 1) en humanos está relacionada con la potenciación de la actividad de los neurotransmisores en el sistema nervioso central. En el plasma humano, la ODV predomina sobre la VEN13 en la mayoría de las personas, excepto en los metabolizadores lentos, donde la VEN se ha encontrado en concentraciones más altas que la ODV14,15. Tanto VEN como ODV son potentes inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, y también inhiben débilmente la recaptación de dopamina16. Al ser la venlafaxina un racemato, las formas enantioméricas R-(-) y S-(+) están presentes en cantidades iguales y ambas contribuyen a su actividad antidepresiva. El enantiómero R de VEN es potente para inhibir la recaptación de serotonina y noradrenalina sinaptosómica, mientras que el enantiómero S es más selectivo para inhibir la recaptación de serotonina. Sin embargo, ambos enantiómeros de VEN son más potentes para inhibir la recaptación de serotonina en contraste con la noradrenalina17,18,19. Los enantiómeros de ODV también inhiben la recaptación de noradrenalina y serotonina, siendo el enantiómero R más potente20.

Representación de la estructura química de (a) venlafaxina y (b) O-desmetilvenlafaxina.

Drug Metabolism Division, Wyeth-Ayerst Research, Princeton, New Jersey, informó los estudios preclínicos iniciales de farmacocinética y disposición metabólica de VEN (WY-45,030), incluidos sus enantiómeros y ODV (WY-45,233), en ratones, ratas, perros y monos rhesus, mientras que VEN y ODV todavía estaban en desarrollo. El análisis de plasma y orina obtenidos después de que los animales recibieron una solución acuosa pura de VEN y ODV, y no cualquier tipo de formulación de dosificación, por vía intravenosa (iv) y/o intragástrica (ig) se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). método con detección UV. Wyeth-Ayerst Research también informó un método de HPLC para la estimación simultánea de VEN y ODV en plasma de rata, perro y ratón18,21,22,23. En los últimos 30 años, luego de su aprobación para uso clínico, se han reportado en la literatura un número considerable de métodos bioanalíticos para la cuantificación de VEN y ODV en plasma y orina humana, pero no ocurre lo mismo con los modelos animales preclínicos. Después de una revisión exhaustiva de la literatura disponible hasta la fecha, se encontraron los siguientes métodos bioanalíticos para realizar estudios farmacocinéticos preclínicos de VEN y ODV en animales y casi todos informaron la administración de soluciones acuosas de VEN y ODV en su forma pura a través de una vía oral, iv o ruta ig. da Fonseca y Bonato informaron sobre un estudio de biotransformación enantioselectiva in vitro de VEN a sus metabolitos en preparaciones de microsomas hepáticos de ratas Wistar macho mediante separación por HPLC quiral con detección UV24. Zhang et al. desarrolló el método HPLC con detección espectrométrica de masas (LC-MS) para los estudios de pK de dispersiones sólidas de VEN en ratas Wistar macho25. La espectrometría de masas en tándem (MS/MS), que tiene una mayor especificidad y mejoras como una alta relación señal-ruido, precisión y reproducibilidad, junto con HPLC, se ha convertido en una herramienta adecuada y más efectiva para límites de detección extremadamente bajos y se aplica considerablemente a Estudios PK en la actualidad26. Muchos artículos han informado sobre métodos de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) de HPLC y cromatografía líquida de ultra alta resolución (UHPLC/UPLC) para la cuantificación de VEN y ODV en plasma de rata. Sha et al. (2009) y Ahmad et al. informaron métodos de extracción líquido-líquido (LLE) y extracción en fase sólida (SPE) basados ​​en LC-MS/MS, respectivamente, para la estimación simultánea de VEN y ODV en plasma de rata27,28. Aryal et al. ha utilizado con éxito un método LC-MS/MS para investigar los parámetros farmacocinéticos de VEN y ODV en plasma y dializado cerebral de ratones después de una administración iv e ig del fármaco29. En otro estudio, da Fonseca y Bonato informaron sobre el desarrollo de una técnica más selectiva y sensible como el método LC-MS/MS para evaluar la disposición cinética de VEN, ODV y N-desmetilvenlafaxina (NDV) en plasma de rata después de la administración oral de VEN30, ya que el límite de cuantificación alcanzado por el método HPLC-UV desarrollado previamente24 era apropiado solo para estudios de biotransformación in vitro. Zhang et al. utilizaron un método LC-MS/MS. para determinar la concentración de ésteres fenólicos de ODV, y, Liu et al. estimar profármacos sintéticos de ODV en plasma, cerebro e hipotálamo de ratas macho Wistar, junto con parámetros PK en perros beagle en ambos experimentos después de administrar las soluciones acuosas del fármaco por vía ig y oral a los animales31,32. La validación de un método UPLC-MS/ESI desarrollado para la determinación simultánea de VEN y ODV en plasma de rata y su uso en estudios FC en ratas Wistar macho, tras la administración de la solución de VEN por vía oral, ha sido realizada por Dubey et al.33. Pan et al. afirmó haber desarrollado un método UPLC-MS/MS totalmente validado para la estimación simultánea de metadona, fluoxetina, VEN y sus metabolitos en plasma de rata enriquecido para el estudio de interacción farmacológica y, además, lo aplicó a estudios PK34. Gu et al. y aplicado al estudio PK de VEN administrado por vía oral a ratas35. Chen et al. ha informado de un método UPLC-MS/MS para investigar el mecanismo subyacente del efecto de vonoprazan sobre VEN en microsomas hepáticos de rata junto con su impacto en el perfil farmacocinético de VEN y ODV en ratas macho Sprague-Dawley después de la administración oral de fármacos36. Song et al.37 informaron sobre un método espectrométrico de masas de cromatografía de gases (GC-MS) basado en SPE para la estimación de venlafaxina en plasma de rata y su aplicación para evaluar la interacción farmacocinética entre VEN y fluoxetina en ratas Sprague-Dawley. Un método espectrofluorométrico para la estimación de VEN en plasma de rata enriquecido informado por Shahnawaz et al. también se encuentra en la literatura38.

Nerkar y Gattani, en dos estudios separados, informaron un perfil farmacocinético comparativo de formulaciones de gel mucoadhesivo bucal, de solución oral y iv (a base de semilla de berro y linaza) que contenían VEN en conejos blancos de Nueva Zelanda utilizando un método HPLC-UV39,40. En otro estudio farmacocinético informado por Peng et al., se empleó un método de HPLC para la determinación de VEN en conejos después de inyectar una solución salina de VEN e hidrogel termosensible de VEN-quitosano por vía subcutánea41. Alí et al. también empleó un método HPLC-UV para estudios PK de solución oral que contiene VEN y compuestos de hidrogel de liberación sostenida en conejos42. Un método HPLC-UV desarrollado y validado en plasma de conejo por Sher et al. se ha aplicado al análisis farmacocinético de VEN en conejos albinos después de su administración oral43.

Después de revisar minuciosamente la bibliografía disponible, solo se encontraron dos informes de estudios farmacocinéticos preclínicos de un prototipo de formulación de dosis oral sólida de ER que contenía VEN realizados en cualquier modelo animal. El primero es de una tableta VEN ER reportada en Rowley et al. Patente estadounidense US 20050136109A1 de Wyeth. La patente menciona los estudios farmacocinéticos de los comprimidos de VEN ER realizados en perros Beagle; sin embargo, en la publicación de la patente no se menciona el método bioanalítico utilizado para la estimación de VEN y ODV a partir de plasma canino44. El otro es un estudio farmacocinético in vivo de comprimidos de matriz de quitosano-carbómero que contienen VEN realizado por Zhang et al. en perros Beagle empleando un método HPLC45.

El presente estudio, hasta donde sabemos, es el primer informe sobre estudios farmacocinéticos preclínicos de formulaciones de dosificación oral sólida de venlafaxina para RE en conejos blancos de Nueva Zelanda. El estudio incluye la evaluación de bioequivalencia (BE) de una tableta VEN ER de producción propia y el fármaco listado como referencia (RLD) de la FDA de EE. UU. Efexor XR 37,5 mg empleando un LC-MRM-MS de ultra alto rendimiento robusto, confiable y validado basado en SPE /Método MS para la cuantificación simultánea de VEN y ODV en plasma de conejo.

Los patrones de trabajo de clorhidrato de venlafaxina y O-desmetilvenlafaxina de 99,83 % y 99,82 % de pureza respectivamente se adquirieron de Vivan Life Sciences (India). Clorhidrato de venlafaxina-D6 marcado con deuterio (VEN-D6) de 99,46 % atómico de enriquecimiento D-isotrópico y 99,68 % de pureza e hidrato de succinato de rac-O-desmetilvenlafaxina-D6 (ODV-D6) de 99,92 % atómico de enriquecimiento d-isotrópico y 99,02 % de pureza también se adquirió de Vivan Life Sciences (India) y se utilizó como estándar interno (IS). El formato de amonio de grado reactivo y el acetonitrilo y metanol de grado HPLC se obtuvieron de Honeywell Specialty Chemicals (GmbH). El ácido ortofosfórico de grado reactivo y el licor de amoníaco se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (India). El ácido fórmico de grado reactivo se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemicals (India). Todas las soluciones acuosas y tampones se prepararon con agua ultrapura Milli-Q. Los cartuchos SPE (Bond Elut PLEXA, 30 mg/1 cc) se obtuvieron de Agilent (EE. UU.). Se adquirieron tubos de recogida de sangre que contenían heparina sódica, BD VACUTAINER, de Becton Dickinson (EE. UU.). Efexor XR 37,5 mg se adquirió de Pfizer Ireland Pharmaceuticals (Irlanda).

Las soluciones madre (1 mg mL−1) de VEN y ODV se prepararon disolviendo compuestos estándar pesados ​​con precisión en metanol. La solución de trabajo en el rango de 10–5000 ng mL−1 se preparó diluyendo la solución madre con un diluyente (50 % de metanol en agua, v:v). Las muestras de estándar de calibración (CS) y control de calidad (QC) se prepararon a partir de la solución de trabajo usando diluyente y plasma de conejo añadido (% de adición ~ 5%). La curva de calibración (CC) osciló entre aproximadamente 0,5 y 250,0 ng mL−1 para ambos analitos. Las muestras de control de calidad se prepararon en los niveles de concentración límite de cuantificación (LOQQC), bajo (LQC), medio (M1QC, MQC) y alto (HQC). La concentración nominal de las muestras de CS y QC preparadas en plasma de conejo se proporciona en la Tabla 1.

Para la preparación de muestras, se desarrolló el método SPE para la extracción de VEN y ODV de plasma de conejo. Las muestras congeladas se dejaron descongelar a temperatura ambiente antes de mezclarlas en vórtex para homogeneizar el contenido. A una alícuota de 80 µL de plasma de conejo en un tubo de polipropileno, 50 µL de dilución IS (que contiene ~ 25,0 ng mL−1 de VEN-D6 y ODV-D6) seguido de 400 µL de solución de pretratamiento (10 % de ácido ortofosfórico en el agua , v:v) y se agitó. Las muestras se transfirieron a cartuchos SPE (preacondicionados con 0,5 ml de metanol seguidos de 0,5 ml de agua Milli-Q y centrifugados a 2000 rcf durante un minuto después de cada adición) y centrifugados a la misma rcf que la del preacondicionamiento durante un minuto. Los cartuchos se lavaron con 1 ml de solución de lavado (5% licor de amoníaco en agua, v:v) y agua Milli-Q haciendo funcionar una centrífuga a 2000 rcf durante un minuto después de cada adición. Las muestras se eluyeron con 1 ml de metanol mediante centrifugación a 2000 rcf durante un minuto y se secaron con vapor de nitrógeno a 50 ± 4 °C y alrededor de 20 ± 5 psi. Los residuos secos de la muestra se reconstituyeron en 300 µL de fase móvil, se agitaron y se inyectó una alícuota de la muestra resultante en el sistema LC-MS/MS para su análisis.

Para LC se utilizó un sistema Shimadzu Nexera X2 UHPLC que consta de dos bombas Nexera X2 LC-30AD, un muestreador automático Nexera X2 SIL-30AC MP, una unidad de desgasificación en línea DGU-20ASR y un horno de columna CTO-20AC Prominence HPLC. La separación cromatográfica se logró mediante elución isocrática de la fase móvil (60 % de metanol en tampón de formiato de amonio 2 mM (v:v) + 0,1 % de ácido fórmico L-1) a un caudal de 0,300 mL min-1 en un ACQUITY UPLC BEH C18 columna (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) con un tiempo de ejecución total de 3 min. Se utilizó un volumen de inyección de 5 µL para cada análisis. El tiempo de retención para los analitos y sus respectivos estándares internos marcados isotópicamente estables (SIL-IS) se proporciona en la Tabla 2. La temperatura del muestreador automático y del horno de columna se estableció en 10 ± 1,0 °C y 40 ± 1,0 °C, respectivamente. La composición de la solución de enjuague utilizada fue 90% de acetonitrilo en agua (v:v).

Las muestras eluidas de LC se analizaron posteriormente utilizando un sistema LC/MS/MS AB SCIEX de triple cuadrupolo (QqQ) API 4000 operado en modo de monitoreo de reacción múltiple (MRM). La fuente de iones utilizada fue TURBO ION SPRAY, una sonda de ionización por electrospray (ESI), en polaridad positiva. Dos transiciones MRM, Q1 (ion precursor) y Q3 (ion producto), con un tiempo de permanencia de 200 ms para la cuantificación e identificación simultáneas de los analitos (VEN y ODV) y su SIL-IS (VEN-D6 y ODV-D6) basado en el cálculo de la relación masa-carga (m/z) y se optimizaron los parámetros dependientes del compuesto.

Los datos de LC/MS/MS se procesaron usando el software ANALYST versión 1.6.3 de AB SCIEX. El CC se generó a través de una regresión lineal ponderada (X−1, X−2 y ninguno, donde X = concentración), y se obtuvieron valores para la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlación (R). La concentración de VEN y ODV se determinó trazando la relación del área del pico de analito/IS en función de CC. La media, la desviación estándar (SD), la precisión (%CV), la exactitud (% Nominal) se calcularon utilizando el software MS Excel.

El método desarrollado se validó de acuerdo con la Guía para la validación de métodos bioanalíticos de la industria de la FDA de EE. UU. 200146, la Guía de validación de métodos bioanalíticos de la FDA de EE. UU. para la industria 201847 y la Guía armonizada M10 de la FDA de EE. UU. para la validación de métodos bioanalíticos (2018)48. La validación se realizó con respecto a la linealidad de CC, sensibilidad en LOQ, selectividad, efecto de matriz, arrastre, precisión y exactitud (PA), recuperación y reanálisis de muestra incurrido (ISR) según las recomendaciones de la FDA y los criterios de aceptación para el bioanalítico. validación del método.

Se utilizó el método de compresión directa para producir tabletas de VEN ER de 140,0 mg de peso y una dureza de alrededor de 4–5 kPa utilizando una prensa de tabletas rotatoria con herramientas cóncavas redondas de 7,25 mm. Las pruebas de disolución in vitro se realizaron de acuerdo con el "Procedimiento de disolución" < 711 > de la USP 35 usando el método ӀӀ (paleta) del aparato de la USP a 50 rpm en 900 ml de medio de disolución a 37 °C. Las muestras de disolución tomadas se analizaron espectrofotométricamente a 225 nm utilizando una cubeta de 5 mm de paso óptico.

El método bioanalítico desarrollado se utilizó para la cuantificación simultánea de VEN y ODV en plasma de conejo y se aplicó para realizar un estudio farmacocinético preclínico en conejos blancos de Nueva Zelanda. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) del Departamento de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Cachemira [Ref. No. F (IAEC-Aprobación) KU/2017/09]. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las leyes indias pertinentes [Reglas de cría y experimentos con animales (control y supervisión) de 1998, Reglas de enmienda de 2001 y Reglas de enmienda de 2006] y las pautas de ARRIVE. Government Rabbit Farm, Wussan (Pattan), Cachemira, proporcionó cuatro parejas (macho/hembra) de conejos sanos, cada uno con un peso de 3 a 4 kg. Los conejos se dividieron en un grupo de referencia y un grupo de prueba. Cada uno de los 4 conejos del grupo de referencia recibió una cápsula de Efexor XR 37,5 mg por vía oral y, de la misma manera, los conejos del grupo de prueba recibieron una tableta de VEN ER de producción propia. Después de la administración, se recogieron 2 ml de sangre de la vena marginal de la oreja a las 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24 y 36 h en heparina sódica que contenía BD VACUTAINER. El plasma libre de células de sangre anticoagulada se obtuvo centrifugando las muestras de sangre a 3000 rcf y 17 °C durante 15 min según las Directrices de 2002 sobre el uso de anticoagulantes en investigaciones diagnósticas de laboratorio de la OMS49. Las muestras de plasma resultantes se congelaron a -40 °C hasta su posterior análisis.

Durante el desarrollo del método, se descubrió que la SPE era más selectiva para eliminar las interferencias como las sales disueltas (electrolitos) y las proteínas del plasma. La fiabilidad del método se comprobó a partir de los resultados del experimento de recuperación, que proporcionó una excelente reproducibilidad. El requerimiento de una alícuota de 80 µL de plasma de conejo también aseguró menos muestra desperdiciada. Se seleccionó un método de carga base no iónico y no polar para la extracción primaria de analitos con Log P > 1,5 y pKa de 6–10, y para este fin se utilizaron cartuchos de SPE que contenían sorbente polimérico de estireno divinilbenceno hidrofílico no polar. El acondicionamiento del sorbente se logró con metanol al 100 % seguido de equilibrio con agua al 100 %. El tratamiento ácido del plasma con ácido ortofosfórico ayudó en la precipitación de proteínas y preparó el plasma para la carga de extracción. Durante la carga, el gradiente de polaridad en la superficie del sorbente hidrófilo permitió la transferencia de fase de los analitos al núcleo de polímero más hidrófobo para su retención antes del lavado y la elución posterior. Los grandes componentes de la matriz endógena no alcanzaron el núcleo debido a su incapacidad para unirse a la superficie polimérica. El tratamiento de lavado con licor amoniacal eliminó las interferencias sin lixiviación de analitos. El extracto limpio con alta recuperación se obtuvo eluyendo la muestra de plasma con metanol al 100%.

El enfoque durante la LC fue obtener picos nítidos con alta resolución para los analitos bajo investigación y lograr una alta eficiencia junto con la máxima sensibilidad MS/MS. La separación cromatográfica se realizó isocráticamente utilizando LC de fase inversa (RPLC). De acuerdo con la ecuación de resolución fundamental para separaciones isocráticas, la resolución depende de la eficiencia de la columna, que en sí misma está influenciada por el tamaño de partícula de la fase estacionaria. Dado que las partículas más pequeñas (por debajo de 2 µm) proporcionan una resolución cromatográfica más alta, se seleccionó la columna UPLC BEH C18 para RPLC. La fase ligada estacionaria de esta columna contiene partículas híbridas de etil-siloxano/sílice (BEH) con puente de etileno de 1,7 µM altamente eficientes unidas con ligandos C18 trifuncionales hidrofóbicos que utilizan procesos patentados de protección final. La fase ligada tiene una densidad de ligandos de 3,1 µMol M−2 y una carga de carbono del 18 %. Dado que la retención en RPLC está relacionada principalmente con la hidrofobicidad del soluto, para separar la molécula más hidrofóbica, se debe usar el ligando menos hidrofóbico. Siendo VEN y ODV moléculas altamente hidrofílicas, los ligandos C18 trifuncionales fuertemente hidrofóbicos fueron capaces de proporcionar suficiente unión para la separación deseada. El ajuste adecuado de la polaridad de la fase móvil es tan importante como la selección de la columna no polar para la separación de moléculas de soluto en RPLC. El metanol, un solvente predominantemente polar, se optimizó como fase móvil y la capacidad amortiguadora adecuada de la fase móvil se mantuvo con formiato de amonio (pKa = 3,75 y rango amortiguador de 3,76 a 5,76). Dado que la velocidad de flujo de la fase móvil juega un papel importante en la resolución de moléculas pequeñas en separaciones de fase inversa, ajustarlo a 0,300 ml/min ayudó a obtener una alta resolución para los analitos.

Los dos objetivos principales que se tuvieron en cuenta al optimizar las condiciones de MS/MS fueron lograr una sensibilidad y selectividad adecuadas. Aunque la extracción de muestras, el desarrollo de la cromatografía y el ajuste inicial de MS tienen un efecto sobre la sensibilidad y la selectividad, la optimización de MS influye considerablemente en la sensibilidad del método. Durante el ajuste inicial de MS, el primer paso fue determinar la ionización de los analitos. Los parámetros de la fuente de ionización/gas (Tabla 3), como el flujo de gas y el voltaje de ionización, se ajustaron a los analitos creando condiciones de ionización óptimas para el analito y, posteriormente, la sensibilidad. Fue durante este ajuste inicial de MS que se determinó el modo de ionización positiva para llevar a cabo el análisis MS/MS. El modo de ionización y la polaridad de detección adecuados se seleccionaron en función de la polaridad del analito y las condiciones de funcionamiento del LC. La principal mejora que ofrece el uso de ESI es la formación de moléculas protonadas o desprotonadas con poca fragmentación, lo que es ideal para la selección de iones precursores, incluida la maximización de la sensibilidad.

La espectrometría de masas en tándem se basa principalmente en la selección de iones precursores (Q1), su fragmentación principalmente por disociación inducida por colisión (CID) y la medición m/z de los iones producto (Q3) formados. La detección de dos o tres transiciones MRM para cada analito, al principio, brinda la confianza de que se está monitoreando el analito correcto y esta selectividad ayuda en las etapas posteriores del desarrollo del método cuando se analizan muestras biológicas reales. Los parámetros de MS optimizados para cada compuesto se proporcionan en la Tabla 4. Los analitos se detectaron mediante MS/MS inducida por colisión empleando MRM y par de iones de transición de masa (transiciones de iones precursor-producto) para VEN, VEN-D6, ODV y ODV. -D6 se seleccionó como m/z 278,2 → 58,1, m/z 284,2 → 64,1, m/z 264,0 → 58,1 y m/z 270,0 → 64,1 respectivamente. Los espectros de masas MRM y la fragmentación de los analitos y SIL-IS se muestran en las Figs. 2, 3, 4 y 5.

Espectros de masas MRM y fragmentación de venlafaxina.

Espectros de masas MRM y fragmentación de venlafaxina-D6.

Espectros de masas MRM y fragmentación de O-desmetilvenlafaxina.

Espectros de masas MRM y fragmentación de O-desmetilvenlafaxina-D6.

El desarrollo del método bioanalítico basado en la espectrometría MRM-MS, junto con la precisión de cuantificación proporcionada por el uso de SIL-IS, mejoró la sensibilidad y la selectividad a través del control de la variabilidad en la cuantificación de los analitos, y también ayudó a monitorear simultáneamente las masas de la luz y iones precursores pesados. El MRM distingue los compuestos en función de la masa, eliminando así el requisito de separar cada uno de los componentes presentes en la muestra mediante el método cromatográfico utilizado. Por lo tanto, la espectrometría MRM-MS en la plataforma QqQ MS proporcionó la velocidad y la precisión para detectar múltiples transiciones (pares Q1/Q3), lo que permitió un análisis LC rápido y un tiempo de preparación de muestras reducido. Además, la cuantificación simultánea basada en MRM-MS de VEN y su metabolito activo permitió el desarrollo de un método bioanalítico de alto rendimiento capaz de inyectar ambas formas en la misma ejecución, armonizando así las variaciones de sensibilidad de ejecución a ejecución, específicas de la muestra. supresión de iones y desviaciones en el tiempo de retención. El uso de MRM con SIL-IS, que también se acredita como el estándar de oro de la cuantificación de MS, ofreció consistencia en la precisión y la reproducibilidad del método bioanalítico desarrollado. Se encontró que la reproducibilidad del método de espectrometría MRM-MS desarrollado era confiable, como se demostró a través de los resultados de la evaluación ISR. Los datos de ISR mostraron que el valor de cuantificación de VEN y ODV vuelto a analizar fue de ± 20 % de la media en el 93,35 % y el 86,96 % del número total de muestras de nuevo análisis, respectivamente.

Todas las muestras en blanco, CS y QC se prepararon en el plasma obtenido de los mismos conejos que las muestras del estudio. Se analizaron tres lotes de muestras de plasma enriquecido que contenían ocho niveles de CS distintos de cero, incluido un LOQ y que cubrían el rango de cuantificación, para determinar la linealidad de CC. Cada ejecución también incluyó 2 réplicas de cada LQC, M1QC, MQC y HQC. Se encontró que todos los niveles de CS distintos de cero eran ± 15% de las concentraciones nominales según los criterios de aceptación de la FDA. Se encontró que la relación concentración-respuesta se ajustaba al modelo de regresión más simple y mostraba el carácter lineal de CC. Los parámetros de CC promedio para cada analito se presentan en la Tabla 5.

El nivel de CS distinto de cero más bajo en el CC define el LOQ. Los criterios de aceptación de la FDA requieren que el LOQ sea ≥ 5 veces la respuesta del analito del nivel cero de CS (en blanco), con una precisión de ± 20 % de la concentración nominal y reproducible con una precisión de ± 20 % (% CV). La sensibilidad en LOQ se realizó como parte de la evaluación de PA para el rango de CC y se determinó ejecutando el LOQQC (Fig. 6) en 6 repeticiones en tres lotes de PA dentro del día. Los resultados proporcionados en la Tabla 6 muestran que el LOQ se determinó cuantitativamente dentro de los criterios aceptables de precisión y exactitud.

Cromatograma representativo de LOQQC de (a) venlafaxina y (b) O-desmetilvenlafaxina.

Las pautas de la FDA solicitan llevar a cabo selectividad durante la validación para disminuir o evitar la interferencia de los posibles componentes endógenos de la matriz que interfieren y verificar que la sustancia que se mide es el analito previsto. La selectividad se demostró mediante el análisis de 10 muestras en blanco de plasma de conejo (doble blanco) y la respuesta del área del pico en los tiempos de retención de los analitos (VEN y ODV) y los IS (VEN-D6 y ODV-D6) tanto en la matriz en blanco como en el LOQ extraído. se midió (Fig. 7). El método de extracción utilizado fue el mismo que se menciona en la preparación de la muestra "Preparación de la muestra". El % del área de la matriz en blanco para la respuesta media del área del pico del analito en el LOQ extraído para VEN y ODV fue de 1,25 a 4,22 % y de 1,07 a 9,22 %, respectivamente. Para ambos IS, VEN-D6 y ODV-D6, el % de área de la matriz en blanco para la respuesta media del área del pico de IS en el LOQ extraído fue de 0,00 a 0,02 %. Los resultados estuvieron dentro de los criterios de aceptación de la FDA y mostraron que los blancos estaban libres de interferencias con el analito (< 20 % de respuesta del área del pico del analito en blanco en comparación con las muestras LOQ extraídas) y la respuesta IS en blanco no superó el 5 % de la promedio de respuestas IS de CSs y QCs.

Cromatograma representativo del doble blanco de (a) venlafaxina y (b) O-desmetilvenlafaxina.

Las recomendaciones de la FDA requieren que las muestras de matriz se analicen para determinar el efecto de matriz, de modo que la precisión, la selectividad y la sensibilidad no se vean comprometidas durante la aplicación de un método LC-MS y LC-MS/MS. El efecto de matriz se observa como el cambio en la respuesta de un analito normalmente debido a la presencia de un componente desconocido que interfiere en la matriz de la muestra. El efecto de matriz, medido cuantitativamente en términos de factor de matriz (MF), se estimó como la proporción de la respuesta del pico del analito obtenida a nivel de LQC y HQC (Figs. 8, 9) en presencia (extraído y enriquecido después de la extracción) y ausencia de iones de matriz (solución estándar pura). Además, el IS-normalizado-MF o Absoluto-MF se calculó como la relación entre el MF de un analito y el MF de un IS. Dado que el uso de SIL-IS reduce la variabilidad efectiva de MF normalizado IS, no es necesario determinar MF o MF normalizado IS en 6 lotes de muestras de matriz independientes50. Se encontró que la variabilidad en los MF, según lo determinado por el % CV (Tabla 7), se encontraba dentro de los criterios de aceptación de la guía armonizada ICH de la FDA (menos del 15 %).

Cromatogramas representativos de venlafaxina a nivel (a) LQC (enriquecido), (b) LQC (solución estándar pura), (c) HQC (enriquecido) y (d) HQC (solución estándar pura).

Cromatogramas representativos de O-desmetilvenlafaxina a nivel (a) LQC (enriquecido), (b) LQC (solución estándar pura), (c) HQC (enriquecido) y (d) HQC (solución estándar pura).

En un método analítico, el arrastre entre las muestras puede ocurrir debido a la entrada de un analito en una muestra de la anterior. Las pautas de la FDA exigen que el remanente no supere el 20 % del LOQ e instan a eliminar cualquier remanente, así como a monitorear su impacto, si lo hay, en la cuantificación de las muestras del estudio. El arrastre se controló inyectando 3 muestras de matriz en blanco (doble blanco) posteriormente después de los niveles altos de CS (HQC). El % del área de 3 muestras de matriz en blanco para la respuesta promedio del área del pico del analito en el LOQ extraído para VEN y ODV fue 5,17 %, 3,11 %, 2,43 % y 2,72 %, 2,26 % y 5,98 %, respectivamente. De manera similar, para VEN-D6 y ODV-D6, el % de área de la matriz en blanco para la respuesta promedio del área del pico de IS en el LOQ extraído se mantuvo en el rango de 0,00 a 0,02 %. Los resultados muestran un arrastre insignificante sin mejora en la respuesta del área del pico en los tiempos de retención de los analitos y los IS, lo que garantiza que el arrastre no afectó la PA del método desarrollado (Fig. 10).

Cromatogramas de transferencia representativos de (a) venlafaxina HQC, (b) doble blanco de venlafaxina posterior, (c) O-desmetilvenlafaxina HQC y (d) doble blanco de O-desmetilvenlafaxina posterior.

La validación del método a través del pesaje PA es esencial según las pautas de la FDA para establecer la calificación del método para el análisis de las muestras del estudio e implica la evaluación de 4 niveles de control de calidad (LOQQC, LQC, MQC y HQC) en todo el rango de cuantificación. La PA entre lotes (entre días) y dentro de lote (intradía) se determinó ejecutando réplicas de control de calidad de VEN y ODV contra CC en días diferentes (n = 18) y el mismo día (n = 6) respectivamente. Se usaron CS y QC recién preparados para cada serie. Se realizaron un mínimo de 3 corridas de PA independientes junto con un CC incluido en cada corrida. Con base en el desempeño de los QC en todas las ejecuciones de PA entre lotes y dentro del lote, es evidente a partir de los resultados proporcionados en la Tabla 8 que el PA del método está dentro de los criterios de aceptación de la FDA (precisión y exactitud: ± 15% de las concentraciones nominales de QC excepto ± 20% en LOQQC).

La eficiencia y la reproducibilidad del proceso de extracción utilizado durante el desarrollo del método se establecen mediante la optimización de la recuperación del analito y el IS. Aunque las pautas de la FDA establecen que la recuperación no necesita ser del 100%, mantienen que el grado de recuperación es consistente y reproducible. La recuperación se realizó comparando el área del pico del analito (recuentos) de 6 réplicas de cada una de las muestras de control de calidad extraídas en LQC, MQC y HQC con los correspondientes extractos de los espacios en blanco enriquecidos con el analito después de la extracción (lo que representa una recuperación aproximada del 100 %). La recuperación de IS se estimó de manera similar utilizando 18 réplicas de muestras de IS extraídas. Los resultados del experimento de recuperación que se muestran en la Tabla 9 confirman la consistencia y la reproducibilidad de la SPE utilizada en el desarrollo del método para la estimación simultánea de VEN, ODV y sus IS.

Se utilizó un enfoque de calidad por diseño (QbD) para seleccionar diferentes polímeros de control de liberación para desarrollar una formulación de tableta ER de VEN. La formulación optimizada producida, utilizando un diseño de experimentos de mezcla óptima (DOE), para la evaluación farmacocinética preclínica contenía 13,1 %, 19,25 % y 36,4 % de carbopol 971P, Blanose 7HXF y Avicel 112, respectivamente. Los niveles apropiados de Ligamed MF-2-V y Aerosil 200 también se ajustaron para producir una formulación robusta. El diseño de la mezcla óptima ayuda a personalizar el objetivo para cumplir con los requisitos específicos51, que en este caso fue hacer coincidir la liberación del fármaco in vitro con la del RLD.

La comparación del perfil de disolución entre la tableta ER optimizada y RLD en tampón de acetato de pH 4,5, tampón de acetato de pH 5,5 y tampón de fosfato de pH 6,8 se llevó a cabo según la Guía de la FDA de EE. UU. para la industria, estudios de biodisponibilidad y bioequivalencia para medicamentos administrados por vía oral: general Consideraciones (2002)52 utilizando el factor de similitud (f2) mediante un enfoque independiente del modelo53. Los valores del factor de similitud f2 en diferentes medios de disolución se proporcionan en la Tabla 10. Los datos de disolución de la tableta ER optimizada y RLD calificaron la prueba de similitud de la curva f2 (prueba vs referencia) con un valor f2 obtenido entre 50 y 100, lo que aseguró la consistencia y equivalencia in vitro de las dos curvas de perfil de disolución.

El método LC-MS/MS validado se aplicó de manera eficiente para la cuantificación en tándem de VEN y ODV en plasma de conejo después de la administración oral de la tableta ER optimizada y RLD como se describe en el apartado 2.9. La evaluación PK resumida en la Tabla 11 se llevó a cabo mediante un análisis no compartimental (NCA) utilizando WinNonlin 8.1 y los cálculos estadísticos adicionales se realizaron en SAS 9.4. Se encontró que la evaluación de BE usando la comparación de biodisponibilidad de parámetros farmacocinéticos clave entre el producto de referencia y el de prueba era similar. La garantía estadística de similitud bioequivalente proporcionada en la Tabla 12 se calculó mediante el análisis de varianza de los parámetros PK transformados logarítmicamente (Cmax, AUClast y AUCINF_obs) del producto de referencia y de prueba. Las gráficas de concentración plasmática media versus tiempo de VEN y ODV se muestran en la Fig. 11. Las concentraciones plasmáticas de VEN y ODV permanecieron en el rango de cuantificación estándar y por encima del LOQ (0,5 ng mL−1) durante todo el período de muestreo (36 h). Los cromatogramas representativos de VEN y ODV Cmax de referencia y productos de prueba se dan en la Fig. 12.

Gráficas de concentración plasmática media versus tiempo después de una dosis oral única de la tableta ER de prueba y Efexor XR 37.5 mg en conejos blancos de Nueva Zelanda.

Cromatogramas representativos de (a) Prueba de Cmax de venlafaxina, (b) Ref. de Cmax de venlafaxina, (c) Prueba de Cmax de O-desmetilvenlafaxina y (d) Ref. de Cmax de O-desmetilvenlafaxina.

Los datos farmacocinéticos preclínicos obtenidos de estudios pequeños, con un número limitado de animales y muestras de plasma, durante la fase de desarrollo de la formulación pueden ofrecer información farmacocinética crítica de un fármaco y su forma de dosificación para lograr el comportamiento farmacocinético clínico requerido. En este trabajo, informamos estudios preclínicos de evaluación de BE de dos formulaciones de ER de VEN, Efexor XR, y una tableta de VEN ER de producción propia, en conejos blancos de Nueva Zelanda. Para este propósito, se desarrolló y validó efectivamente un método bioanalítico LC-MRM-MS/MS basado en SPE confiable y rápido para la cuantificación en tándem de VEN y ODV, de acuerdo con los límites permisibles de las recomendaciones y los criterios de aceptación de la FDA.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Los autores agradecen a Sun Pharmaceuticals Industries Limited India (Clinical Pharmacology & Pharmacokinetics), por permitirnos llevar a cabo este trabajo en su centro de investigación y desarrollo en Gurugram, Haryana. Los autores también agradecen al Prof. FA Masoodi y al Dr. Adil Gani por permitirnos realizar experimentos de dosificación en animales en el Departamento de Ciencias y Tecnología de los Alimentos de la Universidad de Cachemira, Hazratbal, Srinagar, Cachemira.

Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Cachemira, Hazratbal, Srinagar, 190006, India

Abdul Aala Fazli, Syed Naiem Raza, Taha Umair Wani y Nisar Ahmad Khan

Sun Pharmaceuticals Industries Limited (Centro de I+D), Gurugram, Haryana, 122021, India

Bala Krishna Panigrahy, Shavej Ahmad y Arshad Khuroo

Viatris Inc (Investigación de desarrollo de formulaciones), Jigani, Bangalore, 560105, India

vander kumar

Instituto Universitario de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Chandigarh, Mohali, Punjab, 140413, India

Bilal Ahmad Zarger

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Este trabajo es parte del proyecto de investigación de desarrollo de formulación (FDR) originalmente concebido por AAF y NAKAAF y SA preparó el diseño de desarrollo de formulación y AAF ejecutó el trabajo experimental. AAF y BKP diseñaron el plan de trabajo LC-MS/MS y lo llevaron a cabo bajo la supervisión de AKBAZ llevó a cabo la evaluación técnica de los datos LC-MS/MS obtenidos. AAF, SNR y TUW realizaron estudios en animales. AAF y VK evaluaron los datos en animales para estudios farmacocinéticos. AAF, SNR y NAK revisaron este manuscrito.

Correspondencia a Nisar Ahmad Khan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Fazli, AA, Panigrahy, BK, Kumar, V. et al. Monitorización de reacciones múltiples (MRM) Cuantificación LC-MS/MS de venlafaxina y su metabolito O-desmetilado para un estudio farmacocinético preclínico en conejos. Informe científico 12, 9322 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13389-6

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Recibido: 04 Diciembre 2021

Aceptado: 04 abril 2022

Publicado: 04 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13389-6

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