Un método para el etiquetado paralelo de proteínas a microescala y un control preciso sobre el grado medio de etiquetado (aDoL)

Mar 22, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8961 (2023) Citar este artículo

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Un enfoque ampliamente utilizado para la conjugación de proteínas es a través de los residuos de lisina que reaccionan con NHS u otros ésteres activos. Sin embargo, es un desafío controlar con precisión el grado de marcaje (DoL) debido a la inestabilidad del éster activo y la variabilidad de las eficiencias de reacción. Aquí, proporcionamos un protocolo para un mejor control de aDoL utilizando reactivos de química de clic sin cobre existentes. Es una reacción de dos pasos con una purificación en el medio. Brevemente, las proteínas de interés se activaron primero con azida-NHS. Después de eliminar la azida-NHS que no ha reaccionado, la proteína-N3 se hace reaccionar con una cantidad limitada de etiqueta de clic complementaria. Nuestros estudios han demostrado que la etiqueta de clic reaccionará completamente con la proteína-N3 después de 24 horas de incubación y, por lo tanto, no requiere pasos de purificación adicionales. Como tal, el aDoL es igual a la relación molar de entrada de la etiqueta de clic y la proteína. Además, este enfoque ofrece una forma mucho más simple y económica de realizar el etiquetado paralelo a microescala. Una vez que una proteína se preactiva con N3-NHS, cualquier fluoróforo o molécula con la etiqueta de clic complementaria se puede unir a la proteína mezclando los dos ingredientes. Las cantidades de proteína usadas en la reacción de clic pueden ser cualquier cantidad deseada. En un ejemplo, marcamos un anticuerpo en paralelo con 9 fluoróforos diferentes utilizando un total de 0,5 mg de anticuerpo. En otro ejemplo, etiquetamos Ab con un valor de aDoL objetivo de 2 a 8. En un estudio de comparación de estabilidad, encontramos que el fluoróforo conjugado usando el protocolo de clic sugerido permaneció unido a la proteína por más tiempo que con el etiquetado de fluoróforo NHS estándar.

Las proteínas juegan un papel central en la biología y hacerlas visibles o detectables es esencial para que los investigadores estudien sus funciones e interacciones. En 2001, Sharpless publicó un artículo histórico que describía una estrategia simple para acoplar dos moléculas haciendo "clic"1. Más tarde, Meldal y Bertozzi desarrollaron aún más la química y la pusieron a disposición para una amplia aplicación2,3, por lo que 20 años después, sus trabajos fueron reconocidos y galardonados con el Premio Nobel de química. La química bioortogonal o química click, ha demostrado grandes ventajas para el direccionamiento, con alta especificidad, de proteínas individuales modificadas con sondas o etiquetas en sistemas complejos4,5,6,7,8,9,10. También ha habido otros avances significativos en los métodos de marcaje quimioselectivos y regioselectivos para lograr una sola etiqueta adherida a las proteínas nativas11,12. Para revisiones completas y libros sobre bioconjugación de proteínas, consulte13,14,15. También vale la pena mencionar que el residuo de cisteína es otro objetivo popular para la conjugación de proteínas específicas del sitio. La mayoría de las proteínas no contienen tioles libres nativos a los que se pueda dirigir, y la reducción de los enlaces disulfuro puede tener efectos nocivos en la estructura, por lo que la introducción de un solo residuo de cisteína a través de una mutación puntual es un enfoque preferido para tener una sola etiqueta adherida a una ubicación precisa de la proteína. . Independientemente de los enfoques mencionados anteriormente, el éster clásico de N-hidroxisuccinimida (NHS) y otros ésteres activos siguen siendo el grupo funcional preferido para unir fluoróforo, cromóforo, biotina y ADN a una proteína a través del residuo de lisina16,17. La abundancia de residuos de lisina en la mayoría de las proteínas facilita el etiquetado, y es una reacción de un solo paso más un paso de purificación. No obstante, debido a la inestabilidad (hidrólisis) del éster activo, la inconsistencia de la eficiencia de la reacción y la preocupación de que el etiquetado excesivo afecte la función de la proteína18, sigue siendo una tarea abrumadora.

Aquí, describimos un método de etiquetado que garantiza aDoL específico utilizando reactivos químicos de clic sin cobre fácilmente disponibles. Los sitios de unión se dirigen estocásticamente a los residuos de lisina en la superficie de la proteína, y aDoL es el número promedio de etiquetas (fluoróforos) conjugadas con cada proteína. Es una reacción de dos pasos con un paso de purificación en el medio (que se muestra en la Fig. 1). Como primer paso, la proteína se activó con N3-NHS y el exceso de N3-NHS se eliminó después de la reacción. En el segundo paso, la proteína-N3 se mezcló con el fluoróforo-DBCO en una proporción molar equivalente a la aDoL deseada. Después de una incubación de 24 h, la proteína marcada está lista para usar.

Esquema para el etiquetado de clics con aDoL dirigido. El número entre paréntesis representa la relación molar en la reacción. El uso de un exceso molar de 15X de N3-NHS generalmente producirá ~ 5 N3- por proteína, siempre que la proteína tenga suficientes residuos de lisina. El grado promedio de marcaje (aDoL) se puede controlar con la relación molar de entrada de los reactivos en el segundo paso de reacción. La etiqueta puede ser DBCO u otras ciclooctinas complementarias a N3-.

El éxito del protocolo de etiquetado propuesto se basa en dos condiciones: (1) en el paso de activación, el número promedio de N3 adherido a la proteína debe ser mayor que el aDoL deseado, (2) el fluoróforo-DBCO agregado debe consumirse por completo en el segundo paso, haciendo así innecesaria la purificación adicional. El protocolo se probó en dos sistemas de proteínas, una proteína pequeña: apomioglobina (apoMb, 17 kDa) y un anticuerpo (150 kDa). Ambos fueron etiquetados con AZ488-DBCO, logrando aDoL de 2 a 4 para apoMb y aDoL de 2 a 8 para anticuerpo. Se utilizaron cromatografía y espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) para monitorear la reacción de marcaje, detectar fluoróforos sin reaccionar y caracterizar el brillo de los conjugados.

FCS mide la fluctuación de la señal de las moléculas fluorescentes a medida que se difunden libremente a través de un volumen de iluminación bien definido (~ 1 fL). Esta elegante técnica se introdujo hace más de 30 años19, pero no se usó con frecuencia hasta mediados de los 90, cuando se dispuso de computadoras más rápidas e instrumentos avanzados. Se puede encontrar una descripción completa de los principios básicos y las aplicaciones de FCS en otro lugar20. La curva de autocorrelación calculada proporciona información sobre la velocidad de difusión de las moléculas fluorescentes. Una molécula más pequeña (p. ej., un fluoróforo libre) tiene una velocidad de difusión más rápida en comparación con una proteína marcada con fluorescencia y, por lo tanto, se refleja en una curva de autocorrelación desplazada a la derecha durante la reacción de marcaje.

El éster NHS del ácido azidoacético (N3-NHS) y todos los fluoróforos-DBCO se adquirieron de Click Chemistry Tool (Scottsdale, AZ). Las columnas de desalinización por rotación AlexaFluor 488-SDP (AF488-SDP) y Zeba se adquirieron de Thermo-Fisher Scientific (Waltham, WA). Cy5-NHS se adquirieron de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). NGAL, anticuerpos anti-NGAL y anticuerpos anti-biotina utilizados en el estudio fueron producidos internamente por Abbott Laboratory21 (Abbott Park, IL). La apomioglobina se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anticuerpo de cabra anti-ratón: Dylight 649 se adquirió de Jackson ImmunoResearch Inc (Westgrove, PA). Chromlink Biotin se adquirió de Vector Laboratories (Newark, CA).

El Ab1 anti-NGAL a 2 mg/ml en tampón PBS se mezcló con un exceso molar ocho veces mayor de éster AF488-SDP. La reacción se llevó a cabo a 2-8 °C durante la noche. El exceso de AF488-SDP se eliminó pasando la muestra dos veces a través de columnas de desalinización giratorias Zeba.

Se disolvieron 1–2 mg de N3-NHS en DMSO hasta una concentración final de 10 mg/mL. La concentración de N3-NHS se determinó pesando o midiendo con precisión el producto hidrolizado, NHS, ε260 nm = 9700/M/cm22. Ambos métodos se utilizaron para determinar la concentración de N3-NHS. Las diferencias estaban dentro del 5%. En el paso de preactivación, se mezcló un amplio rango de exceso molar de N3-NHS (exceso de cuatro a cinco veces) con 2 mg/mL de anticuerpo o 1,2 mg/mL de apomioglobina para lograr varios IR Después de una incubación de dos horas a temperatura ambiente temperatura, el N3-NHS sin reaccionar se eliminó pasando las muestras dos veces a través de las columnas de desalinización giratorias Zeba. La unión de un grupo azido a la proteína no afecta el espectro de absorción de la proteína, por lo que la concentración de Ab-N3 o apoMb-N3 se determina con el coeficiente de extinción de Ab o apoMb (Ab: ε280 = 217 500/M/cm, apoMb : ε280 = 15.900/M/cm).

Hemos adoptado dos métodos para determinar la relación de incorporación (IR) del N3- a la proteína. El Ab-N3 primero reaccionó con un exceso molar de Cy5-DBCO (cada etiqueta N3 debe tener un Cy5-DBCO adjunto), la muestra se inyectó en HPLC analítica para su análisis después de 24 h de incubación, se usó el espectro de absorción a los 8,8 min para determinar el IR La siguiente ecuación se utilizó para calcular aDoL de Cy5 a Ab ([Cy5] = A663/255 000/M/cm; [Ab] = (A280 − 0,05 × A663)/217 500/M/cm; aDoL = [Cy5] /[Ab]), que sería una buena estimación de la IR de Ab-N3. Las ApoMbs marcadas se analizaron mediante un espectrómetro de masas TripleTOF® 5600 (Sciex, Framingham, MA) acoplado a un Eksigent MicroLC 200 HPLC (Sciex, Framingham, MA). La distribución de múltiples estados cargados de las muestras de proteínas se desconvolucionó utilizando la función de reconstrucción disponible en el software Peakview de AB Sciex. El IR promedio se calcula mediante la fórmula: ∑(número de N3 unido a la proteína x intensidad máxima)/∑(intensidad máxima).

Todos los stocks de fluoróforo-DBCO se disolvieron en DMSO hasta una concentración final de 10 mg/mL, luego se diluyeron en tampón PBS hasta ~ 100 μM. Los 2 mg/mL de Ab-N3 (IR 7) se dividieron en alícuotas pequeñas (50 μL), cada una de las cuales se hizo reaccionar con 2x equivalentes molares de AZ405-DBCO, AZ430-DBCO, AZ488-DBCO, AZ546-DBCO, AZ568-DBCO, AZ594-DBCO o Cy5-DBCO. Los productos se analizaron en HPLC para determinar las eficiencias de reacción.

La cinética de reacción de la proteína-N3 y AZ488-DBCO se controló mediante cromatografía analítica utilizando Agilent Chemstation. Se inyectaron 50 μL de la mezcla en el SRT-C SEC 300 analítico (columna HPLC, Sepax) en varios momentos (5 min–24 h). Los cambios en el perfil de elución reflejan el progreso de la reacción. En el experimento, en el que se hicieron reaccionar 2 mg/ml de Ab-N3 con nueve fluoróforos-DBCO diferentes, las mezclas de reacción se inyectaron en la misma columna después de una incubación de 24 ± 1,5 h. Hubo 3 h de diferencia entre la primera y la última inyección de muestra. El detector se fijó en el máximo de absorción del fluoróforo correspondiente. Los perfiles de elución se usaron para detectar el fluoróforo-DBCO sin reaccionar.

Los experimentos FCS se realizaron utilizando un espectrómetro de correlación de fluorescencia (ALBA, ISS, Champaign, IL) integrado con un microscopio de fluorescencia invertido Nikon Eclipse TE300 (Nikon InsTech Co., Ltd., Kanagawa, Japón) y un láser Spectra-Physics Mai Tai Ti-Sapphire23 . El sistema se calibra con AlexaFluor 488 20 nM preparado analíticamente antes de cada uso. Todas las muestras se diluyeron a 50–100 nM en tampón HEPES 10 mM (pH 7,4, que contenía NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005 %) y se cargaron en una placa inferior de vidrio de 384 pocillos para la medición de FCS.

Los anticuerpos utilizados en el estudio son anticuerpos anti-NGAL y anticuerpos anti-biotina. Se usaron dos protocolos independientes para comparar la actividad de unión del anticuerpo. En un enfoque, se realizaron titulaciones en serie en anti-NGAL Ab 1 con tres IR diferentes (IR 7, 15 y 24) y Ab 1 sin marcar. Los Ab se diluyeron a 100 pM en tampón HEPES 10 mM. Cada Ab se tituló con una serie de soluciones NGAL-Cy5 diluidas 2x. Después de la incubación durante la noche, el anticuerpo o el complejo anticuerpo-NGAL-Cy5 fue capturado por micropartículas recubiertas de anticuerpo secundario (anti-IgG de ratón de cabra), los anticuerpos anti-NGAL utilizados en el estudio son anticuerpos de ratón. La señal de fluorescencia de NGAL-Cy5 capturada en las micropartículas se usó para comparar las actividades de unión de tres Ab-N3 con Ab no marcado.

En el segundo enfoque, cuatro anticuerpos anti-NGAL diferentes y un anticuerpo anti-biotina se marcaron con N3-NHS con diferentes IR que oscilaban entre 2 y 6. Todos los anticuerpos marcados y sus anticuerpos intactos correspondientes se diluyeron a 100 pM en tampón HEPES 10 mM. . 100 μL de cada muestra primero reaccionaron con 5 μL de micropartículas recubiertas de NGAL sólido al 0,1 % durante 30 min y luego 15 min de 50 μL 30 nM de anticuerpo anti-ratón de cabra F(ab')2-Dylight649. Las micropartículas se lavaron después de cada paso de reacción de unión y luego se tomaron imágenes en un microscopio de epifluorescencia Olympus (la configuración del instrumento y el análisis de imágenes se describieron previamente24,25). Las micropartículas recubiertas con biotina-NGAL se prepararon mezclando 10 μl de biotina-NGAL 15 μM con 1 ml de micropartículas sólidas de estreptavidina al 0,1 %. La biotina-NGAL no unida se eliminó por lavado de la solución de micropartículas antes de cada experimento usando un lavador de placas. Las micropartículas recubiertas de estreptavidina se prepararon acoplando 0,1 mg/ml de estreptavidina a partículas carboxilo paramagnéticas de 5 μm (Polymer Lab, Palo Alto, CA) mantenidas al 1 % (p/p) de sólidos en presencia de 0,15 mg/ml de EDAC (1-etil -3-(3-imetilaminpropil) carbodiimida, clorhidrato Se usaron micropartículas de estreptavidina sin el recubrimiento de biotina-NGAL como control negativo para garantizar que las señales medidas fueran una unión específica entre el anticuerpo y su antígeno correspondiente.

En este estudio se describieron múltiples condiciones de etiquetado y productos de etiquetado, se usaron las siguientes nomenclaturas para mayor claridad: proteína-15x-N3-2x-AZ488, lo que indica que la proteína reacciona primero con 15x equivalente molar de N3-NHS, y luego 2 × equivalente molar de AZ488-DBCO. El número de N3 unidos a la proteína se denomina relación de incorporación (IR). El número de fluoróforos finales unidos a la proteína se denomina grado medio de marcaje (aDoL). El producto intermedio se denomina Proteína-N3, el producto final con fluoróforos se denominará Conjugado.

En el primer ejemplo, el anticuerpo se activó con un exceso molar de 16x de N3-NHS, logrando un IR de 5,6. Luego se mezcló una proporción molar de 2:1 de AZ488-DBCO y Ab-16x-N3 para lograr un aDoL de 2. La mezcla de reacción (Ab-16x-N3, AZ488-DBCO) se inyectó en la columna HPLC analítica a varias veces para controlar el progreso de la reacción y se recogió el producto Ab-AZ488 para su posterior análisis. La Figura 2a muestra ejemplos de cromatogramas monitoreados a 493 nm a lo largo del tiempo. El conjugado Ab-16x-N3-2x-AZ488 eluye a los 8,8 min, mientras que el AZ488-DBCO libre eluye a los 16,5 min. Al comienzo de la reacción (5 min), solo había trazas del conjugado y la mayoría de los fluoróforos estaban en forma de AZ488-DBCO libre. A los 55 min, más del 50 % de los fluoróforos se unieron al anticuerpo y, a los 267 min, solo había trazas de AZ488-DBCO libre. A las 24 h, no se eluyó de la columna ningún AZ488-DBCO libre, lo que indica que todo el AZ488-DBCO se unió a Ab-N3, por lo que es seguro suponer que hemos logrado el objetivo de aDoL de 2. La figura 2b muestra la traza cinética del reacción extraída del valor del pico de elución a los 8,8 min. Luego se ajustó la traza cinética utilizando la ecuación. (2) derivado de la ecuación de velocidad integrada para la reacción de segundo orden (Ec. 1).

donde [A]0 y [B]0 son las concentraciones iniciales de N3-DBCO y AZ488-DBCO, respectivamente; t es el tiempo de reacción en segundos, x es la concentración de AZ488-DBCO unido a la proteína y K es la constante de velocidad de reacción. El K ajustado es 4,31 ± 0,13/M/s.

( a ) Cromatogramas de Ab-16 × -N3 que reaccionan con 2 × AZ488-DBCO en función del tiempo, monitoreados a 493 nm. Ab-16x-N3-2x-AZ488 conjugado eluye a los 8,8 min, AZ488-DBCO libre eluye a los 16,5 min. (b) Curvas cinéticas de reacción extraídas de los cromatogramas con un valor K ajustado de 4,31/M/s. ( c ) Espectros de absorción de los conjugados de varios tiempos de reacción medidos por el PDA en el instrumento HPLC. La leyenda muestra el tiempo de reacción. ( d ) Curvas de autocorrelación de AZ488-DBCO que reaccionan con Ab-N3 en función del tiempo. Las curvas se desplazan hacia la derecha a medida que se unen covalentemente más AZ488-DBCO a Ab-N3.

Confirmamos teórica y experimentalmente que la reacción de clic se completó al 100 % después de 24 h de incubación, siempre que la etiqueta DBCO y la etiqueta N3 estuvieran en una concentración mínima de 10 μM y 25 μM, respectivamente. Sin embargo, sí observamos cambios en la velocidad de reacción constante o reacción incompleta en el segundo paso según el tamaño de la carga útil y el DoL objetivo, lo que podría requerir una incubación más prolongada o un objetivo en un ADoL más bajo (consulte la sección Complementaria).

La figura 2c muestra los espectros de absorción de los conjugados (de varias longitudes de incubación) en el punto de elución de 8,8 min. El aumento del pico de 495 nm indica que más AZ488 se unieron al anticuerpo a lo largo del tiempo. La tabla insertada enumera el aDoL calculado a partir de cada espectro de absorción utilizando la ecuación que se describe a continuación. Después de 24 h de incubación, el conjugado alcanzó un aDoL de 1,8, que está cerca del valor objetivo de 2.

Paralelamente, también se usaron mediciones de FCS para seguir el progreso de la reacción. Las mezclas de reacción se midieron al microscopio sin ningún paso de purificación. La Figura 2d muestra las curvas de autocorrelación de la mezcla de reacción en varios tiempos de reacción. Las curvas de autocorrelación desplazadas a la derecha indican que se unen más AZ488-DBCO a la proteína a lo largo del tiempo. A las 24 h, la curva de autocorrelación de la mezcla de reacción no purificada se superpone con la del conjugado purificado por HPLC, lo que indica que todo el AZ488-DBCO había reaccionado con Ab-N3. Por lo tanto, hemos utilizado dos métodos independientes para confirmar la finalización del 100 % de la reacción de marcaje.

Se dividieron 0,5 mg de Ab-17×-N3 en 9 alícuotas y cada una reaccionó con 2× equivalentes molares de AZ405-DBCO, AZ430-DBCO, AZ488-DBCO, AZ546-DBCO, AZ568-DBCO, AZ594-DBCO y Cy5-DBCO . Todos los productos se cargaron en la columna de HPLC analítica después de ~ 24 h de incubación y se controlaron a la longitud de onda de absorción máxima de cada fluoróforo correspondiente. Solo se encontraron residuos sin reaccionar en las muestras AZ532-DBCO y AZ647-DBCO. El resto reaccionó completamente con la proteína (Fig. 3). No estábamos seguros de la causa de la reacción incompleta de AZ532-DBCO y AZ647-DBCO, pero se deben evitar esos dos compuestos. El propósito de este experimento fue demostrar que, después del paso de activación, la proteína-N3 se puede conjugar con fluoróforos, biotina u otras pequeñas cargas útiles con la etiqueta DBCO en paralelo a microescala sin necesidad adicional de purificación, pero se debe confirmar el 100 % de reactividad. del reactivo DBCO con etiqueta N3 durante la prueba inicial.

(a) Perfil de elución de HPLC (normalizado) de los conjugados (Ab-17X-N3-fluoróforo) después de ~ 24 h de incubación, cada uno monitoreado en la longitud de onda del fluoróforo correspondiente. (b) Espectros de absorción de los conjugados en el punto de elución de 8,8 min.

Anteriormente, cuando se marcaban proteínas con AF488-SDP o AF488-NHS, siempre se detectaban fluoróforos libres en la solución conjugada después de almacenarla solo unos pocos días. Se ha sugerido que los fluoróforos se unieron de forma no covalente a la proteína durante la reacción de marcaje y luego se disociarían de la proteína lentamente con el tiempo, dando como resultado un fluoróforo libre presente en el conjugado de proteína purificada. Creemos que N3-NHS debería ser un problema menor en ese sentido. El Ab-AF488 conjugado (unido directamente a través del grupo funcional éster de SDP) y el Ab-17x-N3-2x-AZ488 se prepararon el mismo día y se midieron el día 1 y el día 100 usando el instrumento FCS. Después de 100 días a 2–8 °C, se detectó el 15 % de AF488 libre en el conjugado Ab-SDP-AF488, mientras que el conjugado marcado a través de la reacción SPAAC no detectó fluoróforos libres (ver S Fig. 5). Este experimento de comparación directa indicó que nuestro enfoque de etiquetado de clics puede producir un conjugado más estable, lo que puede explicarse porque el fluoróforo-DBCO no unido covalentemente (si lo hay) siempre puede reaccionar con la proteína-N3 con el tiempo).

Primero se hizo reaccionar el anticuerpo con un exceso molar de 17x, 34x y 51x de N3-NHS, y se logró un IR de 7, 15 y 24 respectivamente. Luego, la proteína N3 se hizo reaccionar con AZ488-DBCO en proporciones molares de 2, 4, 6 y 8. Después de una incubación de 24 h, las muestras se diluyeron para mediciones de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) sin purificación. Como se esperaba, AZ488-DBCO reaccionó al 100 % con Ab-17×-N3 (IR 7) en el objetivo de aDoL de 2 y 4, pero se detectaron trazas de AZ488-DBCO para Ab-17×-N3 (IR 7) en aDoL objetivo de 6 y 8. Por otro lado, Ab-34×-N3 (IR 15) podría acomodar hasta 6 AZ488 por molécula, y Ab-51×-N3 (IR 24) podría acomodar hasta 8 AZ488 por molécula ( ver S Fig. 4). Se realizó un protocolo de reacción similar en apoMb y se logró la aDoL específica como se esperaba (ver S Fig. 3). Este estudio sugiere que el IR de la proteína N3 debe ser el doble del aDoL objetivo para garantizar la finalización de la reacción de clic. Sin embargo, se sabe que el brillo de la fluorescencia de la proteína marcada no siempre es linealmente proporcional al número de fluoróforos adheridos a ella debido a la autoextinción, o a veces denominada extinción por concentración26,27. Observamos los fenómenos de autoextinción esperados de la proteína marcada con las mediciones de FCS. La figura 4 muestra que con un aDoL de 2, el brillo del conjugado es el doble que el de un solo fluoróforo AZ488-DBCO. Hay aumentos incrementales de brillo con mayor aDoL, pero no sigue la tendencia lineal. En aDoL de 8, el brillo del conjugado es simplemente 3 veces el brillo del fluoróforo AZ488. Teniendo en cuenta el impacto potencialmente negativo del etiquetado extensivo en la estructura y función de la proteína, y la ganancia mínima en brillo con una aDoL28 más alta, es importante enfatizar que la aDoL debe mantenerse baja. Suponiendo que el número de fluoróforos por anticuerpo sigue una distribución de Poisson18,29, incluso con una DoL de ~ 2, habrá ~ 18 % de la proteína con 3 marcadores y ~ 15 % de la proteína con 4 marcadores o más.

Brillo de fluorescencia de los conjugados calculado a partir de mediciones de FCS. Con un aDoL de 2, el brillo del conjugado es el doble del fluoróforo único AZ488-DBCO, hay un aumento incremental del brillo con un aDoL más alto, pero no sigue la tendencia lineal.

La etiqueta funcional, N3- no absorbe a 260 nm ni a 280 nm, por lo que la unión de N3- a la proteína no puede confirmarse mediante el espectro de absorción. Las proteínas con diferente IR tienen espectros de absorción muy similares (ver S Fig. 1). Hemos adoptado dos métodos para determinar la proporción de incorporación del N3- a la proteína. En un enfoque, la proteína-N3 reacciona con el exceso molar de Cy5-DBCO, cuando cada etiqueta N3 tiene un Cy5-DBCO adjunto, la aDoL de Cy5 a la proteína-N3 debe reflejar el IR de Ab-N3 y se puede determinar la aDoL por espectros de absorción. Este enfoque es más adecuado para proteínas más grandes (p. ej., Ab), que tiene un coeficiente de extinción más alto y espacio suficiente para acomodar los fluoróforos. La Tabla complementaria 1 enumeró el valor máximo y calculó aDoL de Ab-N3-DBCO-Cy5. Un enfoque alternativo es utilizar ESI-MS y resolver directamente el número de N3- por el aumento de masa de la proteína. Esto es más adecuado para proteínas de menor tamaño sin glicosilación (p. ej., ApoMb). Los espectros ESI-MS de apoMb-N3 se incluyen en la sección complementaria (S Fig. 2). La Tabla 1 enumera el IR de Ab-N3 y apoMb-N3, ambos métodos muestran que la eficiencia de la reacción cae en el rango de 25 a 47%. Excluyendo los casos con exceso de etiquetas, las eficiencias de reacción son de ~ 30 % con niveles de IR por debajo de 5.

Se usaron dos protocolos independientes para comparar la actividad de unión del anticuerpo tras la modificación -N3. En el primer enfoque, se realizaron curvas de titulación de unión en anti-NGAL Ab1 en IR de 0, 7, 15 y 24. Cada curva de unión tiene 10 puntos de datos. Todas las curvas de unión son superponibles, lo que indica que la modificación de N3 no afecta la función del anticuerpo (Fig. 5a). En el segundo enfoque, adoptamos un método más simple para evaluar más anticuerpos con diferentes IR (consulte la sección "Materiales y métodos"). Todas las concentraciones de reactivo (micropartículas recubiertas de NGAL, Ab-Dylight 649 anti-ratón de cabra) y las condiciones de reacción se mantuvieron iguales. La figura 5b muestra la señal de fluorescencia de los anticuerpos originales y marcados con N3 cuando se unen a su antígeno correspondiente. Los cinco anticuerpos tienen una afinidad diferente inherente hacia su antígeno objetivo, que se refleja en los variados niveles de señal para cada anticuerpo. Sin embargo, la variación de la señal del mismo anticuerpo marcado con diferente IR refleja el impacto de la modificación del marcado. La Figura 5c muestra la señal normalizada de Abs marcados a Ab intacto. Anti-NGAL Ab1 y Ab4 mostraron que la unión de N3 no tiene un impacto negativo en la función de las proteínas, mientras que anti-NGAL Ab2, Ab3 y anti-biotina Ab mostraron hasta un 30 % de pérdida de actividad de unión a IR más altos. Y hay una tendencia al aumento de la pérdida funcional con el aumento de IR. El experimento de control negativo (micropartículas recubiertas de estreptavidina) indicó que todos los anticuerpos se unen específicamente a NGAL o biotina, la señal de unión no específica a un nivel de Ab 100 pM es insignificante.

( a ) Titulación de unión de Ab1-N3 y su antígeno, NGAL-Cy5. Ab1 y Ab1-N3 sin marcar se mantuvieron a 100 pM, mientras que la concentración de NGAL-Cy5 varió de 10 pM a 5,5 nM. Los tres Ab-N3 tienen una actividad de unión similar a la del Ab nativo, lo que indica un impacto mínimo de la unión de N3 a Ab. (b) Señal de fluorescencia del anticuerpo capturado por el antígeno correspondiente. ( c ) Actividad de anticuerpos relativa de los anticuerpos marcados con N3 con respecto a su anticuerpo intacto correspondiente.

La técnica de etiquetado presentada aquí es sencilla y precisa. No tenemos conocimiento de ningún método de etiquetado existente que tenga las mismas características sin realizar quimioterapia o etiquetado selectivo del sitio. Como se mencionó en la introducción, el principal inconveniente de usar éster-fluoróforo activo para la conjugación de proteínas es la incapacidad de controlar con precisión aDoL debido a la inestabilidad del éster-fluoróforo activo y la impredecible eficiencia de la reacción. No todas las etiquetas de éster activas son iguales. Los colorantes fuertemente sulfonados, como los colorantes Alexa Fluor®, DyLight® e IRDye®, son particularmente higroscópicos, lo que empeora aún más la hidrólisis de los ésteres activos. En un incidente, detectamos 37 % de Alexa Fluor® 488-NHS hidrolizado en un vial recién abierto por LC-MS (ver S Fig. 5). El manual de fabricación también reconoció que el % de reactivo activo suele ser > 50 %, pero puede ser tan bajo como 30–40 %. Con un nivel desconocido de hidrólisis y el tamaño voluminoso de los fluoróforos, es difícil predecir la eficiencia de la reacción. Según nuestra experiencia, la eficiencia de etiquetado de AF488-NHS o AF488-SDP para proteínas puede variar del 5 al 50 %. Mientras que el N3-NHS es pequeño, el N3-NHS intacto y el N3-NHS hidrolizado tienen diferentes espectros de absorción, lo que podría usarse para comprobar la integridad del reactivo de marcaje22. Probamos varias proporciones de etiquetado de N3-NHS a apoMb y anticuerpo, las eficiencias de reacción fueron de ~ 30 % para ambas proteínas con el IR por debajo de 5. No esperamos una eficiencia de reacción del 30 % para cada proteína y cada lote de N3-NHS , pero muestra consistencia y reproducibilidad. Además, en caso de sobremarcado, cada unión adicional de N3 es de solo 83 Dalton, tendría menos impacto en la función de la proteína en comparación con un fluoróforo voluminoso.

La utilidad de este método se demostró aún más mediante el marcaje paralelo de 9 fluoróforos diferentes a la misma proteína-N3 en un enfoque de modo por lotes. Después del paso de activación, la proteína N3 se puede conjugar con fluoróforos, biotina u otras pequeñas cargas útiles con la etiqueta DBCO en paralelo a microescala sin necesidad adicional de purificación. En un artículo publicado recientemente30, el autor trató de evaluar el efecto de la biotinilación de anticuerpos en un inmunoensayo utilizando varias longitudes de enlazador y varias aDoL en tres anticuerpos. En total, se realizaron 150 condiciones de marcaje, lo que requiere 150 purificaciones independientes. Si se hubiera utilizado nuestro enfoque, los tres anticuerpos se activarían primero con N3-NHS, luego de la purificación, cada anticuerpo podría dividirse en 50 alícuotas y reaccionar con varias proporciones de los 5 enlazadores, y el producto resultante podría usarse directamente. sin mayor purificación. El número total de purificaciones se habría reducido de 150 a 3.

Como se muestra en la sección "Resultado", el rendimiento de los beneficios disminuye con una mayor aDoL para el etiquetado de fluoróforo debido a la extinción automática de la fluorescencia y al posible impacto en la función de la proteína. Probamos cinco anticuerpos diferentes con diferentes I.R y comparamos el impacto de N3 en la función de la proteína. Como era de esperar, algunos anticuerpos mantuvieron su actividad de unión mientras que otros perdieron el 30 % de su capacidad de unión a su antígeno a mayores I.R. Aunque algunas proteínas pueden acomodar más de 20 etiquetas N3, pero cada proteína es diferente, es importante confirmar la propiedad de la proteína después de cualquier modificación. Recomendamos introducir 3–5 -N3 adjuntos a cada proteína, que es suficiente para acomodar 2 fluoróforos DBCO en el paso de reacción final. También es posible utilizar TCEP para reducir el grupo azido que no ha reaccionado en la proteína de nuevo a amina después de reaccionar con DBCO; sin embargo, es importante confirmar que TCEP no rompió el enlace disulfuro de la proteína.

En general, hemos realizado extensos estudios para demostrar que nuestro enfoque proporciona una forma sencilla de marcar proteínas en paralelo en cantidades bajas con aDoL bien controlada.

Los datos están disponibles del autor correspondiente a petición razonable.

Grado medio de marcaje

Relación de incorporación

Espectroscopia de correlación de fluorescencia

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Descargar referencias

El trabajo fue apoyado por Abbott Laboratories. Los autores agradecen a Sergey Tetin por su perspicaz discusión. Agradecemos a nuestro colega Rich Haack por caracterizar los fluoróforos DBCO y AF488-NHS mediante LC-MS. Agradecemos a nuestro colega Patrick J. Macdonald por los comentarios que mejoraron enormemente el manuscrito. Agradecemos a Ray Zhao por preparar imágenes de figuras en alta resolución.

Investigación y tecnología aplicadas, División de diagnósticos de Abbott, AP-20, Abbott Laboratories, 100 Abbott Park Road, Abbott Park, IL, 60064-6016, EE. UU.

Qiaoqiao Ruan y Cheng Zhao

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QR diseñó y realizó la mayoría de los experimentos descritos en el manuscrito. QR escribió el manuscrito. CZ realizó algunos de los experimentos y participó en la redacción del manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Qiaoqiao Ruan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Ruan, Q., Zhao, C. Un método para el etiquetado paralelo de proteínas a microescala y un control preciso sobre el grado medio de etiquetado (aDoL). Informe científico 13, 8961 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

Descargar cita

Recibido: 30 enero 2023

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 02 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

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