Citokimera GIL

Mar 24, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 418 (2023) Citar este artículo

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Todas las citocinas de la familia de las interleucinas (IL-)6, excepto una, comparten la glicoproteína (gp) 130 como cadena receptora β común. Mientras que la interleucina (IL-)11 emite señales a través del receptor de IL-11 no señalizador (IL-11R) y los homodímeros gp130, el factor inhibidor de la leucemia (LIF) recluta heterodímeros del receptor gp130:LIF (LIFR). Usando IL-11 como marco, intercambiamos el sitio III de unión a gp130 de IL-11 con el sitio III de unión a LIFR de LIF. La citoquimera sintética GIL-11 resultante recluta eficazmente el complejo de señalización del receptor no natural que consta de gp130, IL-11R y LIFR, lo que da como resultado la transducción de señales y la proliferación de células Ba/F3 dependientes del factor. Además de LIF e IL-11, GIL-11 no activa complejos de receptores que consisten en gp130:LIFR o gp130:IL-11R, respectivamente. La GIL-11 humana muestra reactividad cruzada con ratones y ratones IL-6R-/- rescatados después de una hepatectomía parcial, lo que demuestra que la señalización de gp130:IL-11R:LIFR indujo eficazmente la regeneración del hígado. Con el desarrollo de la citokimera GIL-11, ideamos el ensamblaje funcional del complejo receptor de citoquinas no naturales de gp130:IL-11R:LIFR.

El progreso realizado en nuestra comprensión de la formación de complejos de receptores de citoquinas ha permitido la implementación de varios enfoques para ensamblar complejos de receptores de citoquinas no naturales mediante citoquinas de diseño. Estos incluyen sintequinas1, neoleuquinas2 y citoquinas quiméricas (citokimeras)3 pero también sistemas de citoquinas totalmente sintéticos4. Las sintecinas son fusiones de dos variantes negativas dominantes de citocinas en las que cada variante se une solo a una subunidad del receptor1. Las neoleucinas recapitulan algunos aspectos de las citocinas naturales, pero tienen un diseño general y una secuencia de aminoácidos completamente independientes2. Las citoquimeras se basan en el marco de una citoquina natural con al menos un sitio de reconocimiento del receptor intercambiado de una citoquina3 estrechamente relacionada, un concepto que aún se ha aplicado específicamente para las citoquinas de tipo IL-6, la interleucina (IL-)6 y el factor neurotrófico ciliar ( CNTF) en la citocina IC73.

Las citocinas de tipo IL-6 comprenden IL-6, IL-11, IL-27, IL-30, IL-31, factor inhibidor de la leucemia (LIF), oncostatina M (OSM), CNTF, cardiotrofina-1 (CT-1) , citoquinas similares a cardiotrofinas (CLC) y neuropoyetina5,6. Aparte de la IL-31, todas las citoquinas de tipo IL-6 inducen la transducción de señales a través del receptor común gp130 β7,8, que activa cascadas de señalización que incluyen las vías JAK/STAT, Ras/Map quinasa y fosfatidilinositol 3-quinasa8,9. Mientras que IL-6 e IL-11 emiten señales a través de homodímeros gp130, las otras citocinas emiten señales a través de heterodímeros gp130. Por ejemplo, CNTF y LIF reclutan el receptor gp130:LIF (LIFR)10,11,12. Además, las citocinas de tipo IL-6 IL-6, IL-11 y CNTF tienen que interactuar con receptores α específicos (IL-6R, IL-11R, CNTFR, respectivamente) para permitir la unión a los receptores β10,11,13. ,14,15.

En el artículo histórico de 19993, Kallen et al. sugirió que los sitios de reconocimiento de receptores de citoquinas han evolucionado como módulos discontinuos que principalmente deberían poder intercambiarse libremente entre diferentes citoquinas. En general, las citocinas de tipo IL-6 tienen en el caso de LIF dos o en el caso de IL-11 o CNTF tres sitios de unión al receptor, el sitio I para el receptor α, el sitio II y el sitio III para los dos receptores β10,11. ,12. Mediante la transferencia del sitio de unión III de LIFR de CNTF16 al sitio de unión III de IL-6, se describió la primera citoquimera IC7 de este tipo hace más de 20 años3. La abreviatura IC7 se origina a partir de la séptima variante quimérica de interleucina/CNTF probada. El intercambio de módulos creó una citocina combinada con actividad dependiente de IL-6R en células que expresan gp130, IL-6R y LIFR, en lugar de depender de IL-6R y gp130 en el caso de IL-6 o de gp130, CNTFR y LIFR en el caso de CNTF3. Recientemente se demostró que IC7 mejora la tolerancia a la glucosa y la hiperglucemia, lo que previene el aumento de peso y la esteatosis hepática en ratones17. Además de IC7, también otras citoquinas de la familia de citoquinas IL-6 mostraron efectos protectores contra la obesidad y la insulina, incluidas IL-618, IL-2719 y CNTF20. Sin embargo, cualquier uso terapéutico de IL-6 está, sin embargo, fuera de discusión debido a sus pronunciados efectos proinflamatorios. La variante de CNTF Axokine fracasó debido al desarrollo temprano de anticuerpos neutralizantes de CNTF21. IC7 combinó lo mejor de ambos mundos y no mostró problemas de seguridad en primates no humanos17.

Aquí, desarrollamos la citokimera GIL-11 que se une al complejo receptor no natural que consiste en gp130:IL-11R:LIFR. Usamos IL-11 como columna vertebral para la transferencia del sitio III de LIF, lo que resultó en la citokimera GIL-11. El GIL-11 altamente activo combina las actividades de LIF22,23 e IL-1124 en una molécula. Cabe señalar que recientemente se ha cuestionado la contribución protectora de la IL-11 en las enfermedades hepáticas25,26, lo que hace que la aplicación terapéutica de la IL-11 sea indeseable. Para demostrar el potencial terapéutico de GIL-11, utilizamos ratones IL-6R-/- desafiados en hepatectomía parcial (PHX). Los ratones IL-6R-/- mostraron una alta tasa de mortalidad de hasta el 80 % frente al 10 % en ratones de tipo salvaje después de PHX27. Aquí, mostramos que GIL-11 rescató a los ratones de la muerte después de una hepatectomía parcial.

Las citocinas de tipo IL-6 comparten una estructura de haz de cuatro hélices común que consta de cuatro hélices alfa antiparalelas (A, B, C y D) conectadas por dos bucles cruzados largos (AB, CD) y un bucle corto. (BC) 28. IL-6, IL-11 y CNTF se unen a su receptor α a través del sitio de unión I que incluye residuos del bucle AB C-terminal y la hélice D C-terminal10,11,13,14,15. Los residuos de las hélices A y C de CNTF, LIF e IL-6 constituyen un sitio de unión a gp130 que se denomina sitio II10,11,12. En IL-6 e IL-11, un segundo sitio III de unión a gp130 consta de residuos de aminoácidos del bucle AB N-terminal, el bucle CD C-terminal y la hélice D N-terminal10,11. El sitio III en CNTF y LIF hace el contacto con LIFR, mientras que el sitio II está en contacto con gp13012. Para IL-11, el sitio II y el sitio III están en contacto con gp130, mientras que un tercer sitio (sitio I) recluta IL-11R11. En particular, la unión primaria de IL-11 a IL-11R es obligatoria para la unión secundaria a gp13011,29. El paradigma del sitio I, II, III para IL-11 y LIF se ilustra en las Fig. 1a, b.

una ilustración esquemática de las posibilidades del complejo receptor IL-11:IL-11R:gp130 tetramérico y hexamérico. IL-11 se une inicialmente a IL-11R a través del sitio I. gp130 se recluta en este complejo a través de interacciones importantes entre el sitio III de IL-11 y D1 (similar a Ig) de gp130 y el sitio II de IL-11 y D2/D3 ( módulo de unión a citoquinas (CBM)) de gp130. b ilustración esquemática del complejo trimérico LIF:gp130:LIFR. LIF se une a través del sitio III a D3/D4 de LIFR ya través del sitio II a D2/D3 de gp130. c ilustración esquemática del complejo tetramérico GIL-11:IL-11R:gp130:LIFR. GIL-11 se une a través del sitio III a D3/D4 de LIFR, a través del sitio II a D2/D3 de gp130 ya través del sitio I a D2/D3 de IL-11R. d ilustración esquemática (izquierda) y modelo de relleno de espacio (derecha) del tetramérico GIL-11:IL-11R:LIFR:gp130 (PDB 6O4P;11 2Q7N;83 1P9M10). GIL-11 se une a través del sitio I a IL-11R, a través del sitio II a gp130 y a través del sitio III a LIFR. e Modelo de banda/relleno de espacio transparente combinado de GIL-11, rojo: IL-11, verde: región intercambiada por LIF. f Alineación de secuencia esquemática basada en la estructura de hIL-11 (PDB 6O4O11), hLIF (PDB 1PVH33) y el GIL-11 resultante. Los residuos del sitio IIIa, b, c están resaltados en cuadros verdes y rojos.

Es de destacar que IL-6 e IL-11 pueden formar complejos de receptores tetraméricos y hexámeros, que consisten en una citoquina, un receptor α y dos gp130 o dos citoquinas, dos receptores α y dos gp13010,30 (Fig. 1a). Aunque el complejo de receptor tetramérico es principalmente biológicamente activo31, las estructuras de los complejos de receptor mostraron solo ensamblajes hexámeros10,11. Sin embargo, LIF emite señales exclusivamente a través de un complejo de receptor trimérico que consta de LIF acoplado con una gp130 a través del sitio II y un LIFR a través del sitio III12,32 (Fig. 1b). Cabe destacar que LIF no requiere un receptor α para unirse a su combinación de receptores β de gp130 y LIFR12. Sin embargo, la unión de LIF a LIFR se ve facilitada por un sitio de unión III ubicado de forma idéntica en IL-11 a gp130 (Fig. 1b)12. Presumimos que el intercambio basado en la estructura del sitio de unión III dividido de la IL-11 humana con el sitio III de la LIF humana convertirá la citoquina quimérica resultante en un aglutinante de la composición del receptor de citoquinas no natural gp130:IL-11R:LIFR, una clase de citoquinas que llamamos citokimera GIL-11. Dado que la unión al receptor β de LIF es independiente del receptor α 12, no estábamos decididos si el reclutamiento de gp130: LIFR de la citoquina quimérica GIL-11 será dependiente de IL-11R (Fig. 1c, d). La inspección estructural del sitio III en IL-11 y LIF guió el diseño de la citokimera GIL-11 con el marco de IL-11 y un intercambio del sitio III de LIF11,33. IL-11 consta de 199 aminoácidos, identificamos el sitio III dividido de los aminoácidos 58–72 para IIIa, 111–128 para IIIb y 162–179 para IIIc. LIF tiene 202 aminoácidos con el sitio III dividido ubicado entre los aminoácidos 64 a 88 para IIIa, 119 a 138 para IIIb y 172 a 189 para IIIc (Fig. 1d-f, Fig. 1A complementaria). Decidimos transferir el sitio de unión completo de LIF a IL-11, aunque esto dio como resultado una citoquimera GIL-11 algo más larga con 211 aminoácidos que la IL-11 original. El modelado molecular sugirió que la transferencia de todos los tramos de aminoácidos del sitio III no debería interferir con la arquitectura general y el plegamiento de la citokimera GIL-11 (Fig. 1d, e)11,12. Comparable con los complejos triméricos LIF:gp130:LIFR, GIL-11 solo formará complejos tetraméricos GIL-11:IL-11R:gp130:receptor LIFR. El ensamblaje tetramérico se basará en el requisito de GIL-11 para el LIFR. Mientras que gp130 tiene dos sitios de unión a citoquinas en una molécula de receptor, LIFR tiene solo un sitio de unión a citoquinas. El LIFR interactúa solo con el sitio III de LIF/GIL-11, mientras que gp130 contacta con el sitio II de LIF/GIL-11. En este escenario, el segundo sitio de contacto en gp130 permanece libre, porque el sitio III de LIF/GIL-11 no puede interactuar con gp130 (Fig. 1c) y la formación de complejos hexamérica 2xGIL-11:2xIL-11R:1xLIFR:1xgp130 puede ser excluido.

La proliferación de la línea de células pre-B murinas Ba/F3 es dependiente de IL-334. Después de la introducción de gp130 humana más receptores familiares adicionales (IL-6R, IL-11R35,36, OSMR y LIFR (Figuras complementarias 1B, C)), la proliferación se desplazó a la respectiva combinación de receptores de citoquinas de tipo IL-6. En el caso de las células Ba/F3-gp130, la proliferación es inducida por IL-11 y el IL-11R soluble o por la correspondiente proteína de fusión Hyper IL-11 (HIL-11)37, la introducción adicional de IL-11R convierte a estas células en IL -11 dependientes. La coexpresión de gp130 e IL-6R hace que estas células respondan a IL-6. Las células Ba/F3 que expresan gp130 y LIFR proliferan con LIF y OSM, mientras que las células Ba/F3 que expresan gp130 y OSMR responden a OSM. Usando nuestro repertorio de células Ba/F3 con las ocho combinaciones diferentes de receptores gp130, gp130:IL-11R, gp130:LIFR, gp130:OSMR, gp130:IL-11R:OSMR, gp130:IL-6R:LIFR y gp130:IL-11R :LIFR, determinamos las propiedades cualitativas de proliferación después de la adición de IL-11, HIL-11, OSM, LIF y GIL-11. Usar una concentración bastante alta de 500 ng/ml para evaluar inicialmente la posible activación cruzada del receptor. GIL-11 específicamente solo indujo la proliferación de células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR pero no de ninguna otra línea celular analizada, lo que sugiere que GIL-11 emite señales a través de gp130:IL-11R:LIFR (Fig. 2a, Datos complementarios ). Como se esperaba, solo HIL-11 indujo la proliferación de todas las líneas celulares Ba/F3, ya que todas expresan gp130. Todas las células Ba/F3 que expresaban gp130 e IL-11R proliferaron con IL-11. La expresión de gp130 y LIFR dio como resultado una proliferación inducida por LIF y OSM, mientras que las células que expresaban gp130 y OSMR eran selectivas para OSM. A continuación, analizamos la fosforilación de STAT3, que es el principal sello distintivo de la señalización JAK/STAT de citoquinas de tipo IL-6 en nuestra cartera de células Ba/F3. Como se esperaba de los ensayos de proliferación celular Ba/F3 inducidos por citoquinas (Fig. 2a), la fosforilación de STAT3 en células Ba/F3 fue inducida por las siguientes combinaciones de citoquina:receptor de citoquina: HIL-11 a través de gp130; IL-11 vía gp130:IL-11R; OSM vía gp130:OSMR; OSM y LIF a través de gp130:LIFR (Fig. 2b; Figs. complementarias 2, 3). Es importante destacar que la fosforilación sostenida de STAT3 para GIL-11 solo se observó en células Ba / F3 que expresan la combinación de receptores gp130, IL-11R y LIFR (Fig. 2b; Figs. complementarias 2, 3). En conjunto, nuestros datos también mostraron que GIL-11 activó específicamente la señalización a través del complejo receptor no natural que consiste en gp130:IL-11R:LIFR.

a Proliferación de Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130-IL-11R, Ba/F3-gp130:LIFR, Ba/F3-gp130:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR, Ba/F3 -gp130:IL-6R:LIFR, Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R células sin citocina (-), con 50 ng/ml HIL-11, 50 ng/ml IL-11, 50 ng/ml IL- 6, 10 ng/ml de LIF, 10 ng/ml de OSM, 500 ng/ml de GIL-11. Los datos representan ±SEM de tres experimentos independientes de tres con tres réplicas técnicas cada uno. Se usó ANOVA de dos vías, incluida la corrección de Dunnet, para las estadísticas. b Activación STAT3 en Ba/F3, Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130_IL-11R, Ba/F3-gp130:LIFR, Ba/F3-gp130:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR, Células Ba/F3-gp130:IL-6R:LIFR, Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R sin citocina (-) y tras estimulación con 50 ng/ml HIL-11, 50 ng/ml IL-11, 10 ng/ml LIF, 10 ng/ml OSM, 500 ng/ml GIL-11 durante 15 min. Se analizaron cantidades iguales de proteínas (50 µg/carril) mediante anticuerpos específicos que detectan fosfo-STAT3 y STAT3. Los datos de Western blot muestran un experimento representativo de tres.

Para evaluar el perfil de transcripción de GIL-11, se estimularon células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR durante 40 min con GIL-11, IL-11 o LIF con concentraciones de EC50 de 100 veces para garantizar la máxima transducción y comparabilidad de la señal. para el análisis del transcriptoma. El diagrama de Venn muestra que 37 genes estaban regulados al alza al menos 1,5 veces por GIL-11, IL-11 y LIF (Fig. 3a, b). Curiosamente, 31 genes estaban regulados positivamente al menos 1,5 veces por IL-11 y LIF, pero no por GIL-11. En total, IL-11 y/o LIF aumentaron 52 genes, pero no GIL-11, lo que sugiere que GIL-11 conduce a una transcripción más atenuada en comparación con IL-11 o LIF. El análisis de enriquecimiento de ontología génica muestra que varios genes involucrados en las respuestas inflamatorias o la hematopoyesis están regulados al alza por GIL-11, IL-11 y LIF (Fig. 3c, d). En conjunto, nuestros datos demuestran que el patrón de transcripción de GIL-11 difiere ligeramente de las citocinas naturales IL-11 y LIF.

un Diagrama de Venn muestra la superposición de genes que son activados por citocinas naturales o sintéticas. Filtro: p < 0,05 incluida la corrección de la tasa de descubrimiento falso; |FC| ≥ 1,5. b El mapa de calor muestra los genes que aumentan significativamente con GIL-11 frente a los no tratados, IL-11 frente a los no tratados y LIF frente a los no tratados. La barra de escala muestra el cambio de pliegue del registro. Filtro: p < 0,05 incluida la corrección de la tasa de descubrimiento falso; |FC| ≥ 1,5 Análisis de ontología génica de vías genéticas comunes que son activadas por GIL-11, LIF e IL-11 (c) y solo por las citocinas naturales (d). Filtro: p < 0,05 incluida la corrección de la tasa de descubrimiento falso; |FC| ≥ 1,5. Eje X: número de genes implicados en la vía génica común. Código de acceso de expresión génica: GSE226064.

A continuación, realizamos una proliferación dependiente de la dosis para determinar la calidad y la capacidad de GIL-11. Nuevamente, GIL-11 no indujo la proliferación de células Ba/F3 que expresan gp130, gp130:IL-11R, gp130:LIFR, gp130:OSMR, gp130:IL-11R:OSMR incluso a la concentración más alta aplicada de 500 ng/ml. mientras que la proliferación de células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR fue claramente dependiente de la dosis con una CE50 de 1,44 ng/ml (Fig. 4a; Datos complementarios). A modo de comparación, determinamos que el EC50 para LIF e IL-11 era 0,074 ng/ml y 0,72 ng/ml en células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR (Fig. 4b, c; Datos complementarios). Para analizar la fosforilación de STAT3 y ERK, se estimularon células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR con cantidades crecientes de GIL-11, IL-11 y LIF. La transferencia de Western mostró que se necesitaban 10–100 ng/ml de GIL-11 e IL-11 para lograr la fosforilación máxima de STAT3 y ERK, mientras que la actividad biológica de LIF fue mayor con 0.1–1 ng/ml necesarios para la fosforilación máxima de STAT3 (Fig. 4d, Fig. 4 complementaria). Con respecto a la activación de las demás STAT en células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR, se evaluó la fosforilación de STAT1, 3, 5 y 6 tras la estimulación con HIL-11, IL-11, OSM, LIF y GIL-11. A través de gp130, todas las citocinas de tipo IL-6 activan eficientemente STAT3, pero solo en menor medida STAT1 y STAT5. En el caso de LIF y OSM, STAT3 y STAT1, así como STAT5, se observó activación38. Aquí, todas las citoquinas indujeron una fosforilación sostenida de STAT3. Curiosamente, HIL-11 e IL-11 no indujeron la fosforilación de STAT1 y STAT5, mientras que LIF, OSM y GIL-11 también indujeron la fosforilación de STAT1 (Fig. 4e, Fig. 6 complementaria; 2c, d). La fosforilación de STAT5 solo se observó para GIL-11. Como era de esperar, ninguna de las citocinas indujo la fosforilación de STAT6. A continuación, estimulamos las células Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R con IL-11, LIF y GIL-11 durante 5–240 min. La fosforilación de STAT3 comienza 5 minutos después de la estimulación con citoquinas, con un pico después de 30 a 60 minutos. Como se ve típicamente para IL-11 y LIF, la fosforilación de STAT3 disminuye después de 120 a 240 min, lo que probablemente se deba a la regulación positiva de SOCS339 (compárese con la Fig. 3b, análisis transcriptómico, regulación positiva de SOCS3 por 10,5 veces GIL-11, 18,4 veces IL- 11, LIF de 14,5 veces), se observó la misma regulación de la fosforilación de STAT3 para la citoquina GIL-11 (Fig. 4f, Fig. 7 complementaria). En conjunto, la actividad de GIL-11 está en el mismo rango de concentración que la citoquina precursora IL-11, lo que demuestra que la expansión del requisito del receptor por transferencia del sitio III no afectó la actividad biológica general de la citoquina.

a Proliferación de Ba/F3, Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130:IL-11R, Ba/F3-gp130:LIFR, Ba/F3-gp130:OSMR, Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR , células Ba/F3-gp130:IL-6R:LIFR, Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R en presencia y ausencia de concentraciones crecientes de GIL-11 (0,0005–500 ng/ml). b Proliferación de células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR en presencia y ausencia de concentraciones crecientes de LIF (0,000025–200 ng/ml). c Proliferación de células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR en presencia y ausencia de concentraciones crecientes de IL-11 (0,000025–500 ng/ml). a–c Las barras de error definen ±SEM. Se muestra un experimento representativo con tres réplicas biológicas de tres. d Activación de STAT3 y ERK en células Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R sin citocina (-) y después de la estimulación con cantidades crecientes de GIL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml), LIF (0,1, 1, 10, 100 ng/ml) e IL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml) durante 15 min. Se analizaron cantidades iguales de proteínas (50 µg/carril) mediante anticuerpos específicos que detectan fosfo-STAT3, STAT3, ERK y fosfo-ERK. Los datos de Western blot muestran un experimento representativo de tres. e Activación de STAT1,3,5,6 en células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR sin citocina (-) y tras estimulación con 50 ng/ml HIL-11, 50 ng/ml IL-11, 10 ng/ ml LIF, 10 ng/ml OSM, 500 ng/ml GIL-11 durante 15 min. Se analizaron cantidades iguales de proteínas (50 µg/carril) a través de anticuerpos específicos que detectan fosfo-STAT y STAT. Los datos de Western blot muestran un experimento representativo de tres. f Activación de STAT3 dependiente del tiempo de células Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR con las citoquinas IL-11 (200 ng/ml), LIF (20 ng/ml) y GIL-11 (200 ng/ml) para el tiempo indicado. Se analizaron cantidades iguales de proteínas (50 µg/carril) mediante anticuerpos específicos que detectan fosfo-STAT3 y STAT3.

Las citoquinas IL-6 e IL-11 dependientes del receptor α activan las células a través del receptor de transducción de señales gp130 y el IL-6R o IL-11R unido a la membrana no señalizadora, respectivamente37,40. Aquí, mostramos señales de GIL-11 a través del IL-11R unido a la membrana en complejo con el complejo heterodimérico gp130:LIFR. La señalización a través del IL-11R unido a la membrana se denomina señalización clásica. El IL-11R también existe como un receptor soluble que, en combinación con el IL-11, activa las células que carecen de la expresión del receptor α unido a la membrana en un proceso denominado señalización trans37,40. Aquí, analizamos en qué medida GIL-11 indujo trans-señalización en complejo con IL-11R soluble (sIL-11R) en células que expresan gp130 y LIFR. Las células Ba/F3-gp130:LIFR se estimularon con una concentración fija de 100 ng/ml de sIL-11R y concentraciones crecientes de GIL-11 (2–2000 ng/ml). A modo de comparación, utilizamos la misma concentración fija de sIL-11R y concentraciones crecientes de citoquinas para IL-11. Mientras que la EC50 para IL-11 fue de 71,6 ng/ml para 100 ng/ml de sIL-11R (Fig. 5a; Datos complementarios), GIL-11 apenas indujo la proliferación a través de sIL-11R. No fue posible calcular un valor de EC50, porque incluso la concentración de 2000 ng/ml de GIL-11 no fue suficiente para alcanzar la proliferación celular máxima (Fig. 5b; Datos complementarios). Por lo tanto, evaluamos la transducción de señales intracelulares en células Ba/F3-gp130:LIFR estimuladas con concentraciones comparablemente altas de 1 µg/ml de GIL-11 y 2 µg/ml de sIL-11R. Aquí, los complejos GIL-11:sIL-11R dieron como resultado una activación sostenida de STAT3. sgp130Fc es un inhibidor selectivo de la transseñalización de IL-6/IL-11, que inhibe la señalización de LIF al menos entre 100 y 1000 veces menos eficientemente que la transseñalización de IL-6/IL-1140,41. A continuación, probamos si sgp130Fc inhibe la transseñalización de GIL-11. Como se muestra en la Fig. 5c, la Fig. 8 complementaria, sgp130Fc (10 µg/ml) no inhibió la fosforilación de STAT3 inducida por GIL-11 (1 µg/ml): transseñalización de sIL-11R (2 µg/ml) en Ba /F3-gp130: células LIFR (Fig. 5c, Fig. 8 complementaria). Para las células Ba/F3-gp130:LIFR, se eligieron concentraciones de GIL-11 (0,5 µg/ml) o IL-11 (0,5 µg/ml) más sIL-11R (1 µg/ml) para permitir la proliferación celular a través de trans- señalización. La titulación de concentraciones crecientes de sgp130Fc dio como resultado la inhibición de la transseñalización de IL-11 (IC50 = 22,5 ng/ml, Fig. 5d; Datos complementarios), mientras que incluso la concentración más alta de 10 µg/ml de sgp130Fc no pudo inhibir GIL -11 trans-señalización. En principio, GIL-11 es capaz de enviar señales a través de la transseñalización, aunque con una eficiencia mucho menor en comparación con IL-11. Al igual que LIF, la transseñalización de GIL-11 no es inhibida por sgp130Fc al menos en condiciones suficientes para bloquear la transseñalización de IL-1137,40,41. Como se muestra en la Fig. 2a, la proliferación de Ba/F3-gp130:LIFR y Ba/F3-gp130:IL-11R fue inducida por LIF e IL-11, respectivamente, pero no por GIL-11. Sin embargo, no pudimos excluir que GIL-11 se una a IL-11R:gp130 en células Ba/F3-gp130:IL-11R y bloquee la señalización de IL-11 o a LIFR en células Ba/F3-gp130:LIFR y bloquee LIF señalización. El uso de la incubación conjunta de citoquinas para Ba/F3-gp130:IL-11R con IL-11 y GIL-11 y para Ba/F3-gp130:LIFR con LIF y GIL-11 no resultó en la inhibición de la proliferación celular incluso a 20 exceso de concentración de masa de GIL-11 sobre IL-11 y un exceso de GIL-11 de 200 veces sobre LIF (Fig. 5e; Datos complementarios). Concluimos que GIL-11 no interfirió con la señalización de IL-11 y LIF al menos para el rango de concentración probado.

a Proliferación de células Ba/F3-gp130:LIFR en presencia y ausencia de concentraciones fijas de sIL-11R (0 o 100 ng/ml) y concentraciones crecientes de IL-11 (1–2000 ng/ml). Se muestra un experimento representativo de tres. b Proliferación de células Ba/F3-gp130:LIFR en presencia y ausencia de concentraciones fijas de sIL-11R (0 o 100 ng/ml) y concentraciones crecientes de GIL-11 (1–2000 ng/ml). Se muestra un experimento representativo de tres. c Activación de STAT3 en células Ba/F3-gp130:LIFR sin citocina (-) y tras estimulación con HIL-11 (50 ng/ml), GIL-11 (1 µg/ml), GIL-11 (1 µg/ml) :sIL-11R (2 µg/ml), GIL-11 (1 µg/ml):sIL-11R (2 µg/ml):sgp130Fc (10 µg/ml) durante 15 min. Se analizaron cantidades iguales de proteínas (50 µg/carril) mediante anticuerpos específicos que detectan fosfo-STAT3 y STAT3. Los datos de Western blot muestran un experimento representativo de tres. d Proliferación de células Ba/F3-gp130:LIFR en presencia y ausencia de concentraciones fijas de IL-11 (0,5 µg/ml):sIL-11R (1 µg/ml) o GIL-11 (0,5 µg/ml): sIL-11R (1 µg/ml) y concentraciones crecientes de sgp130Fc (1–10 000 ng/ml). Se muestra un experimento representativo de tres. e Proliferación de células Ba/F3-gp130:LIFR en presencia y ausencia de concentraciones fijas de LIF (10 ng/ml) y concentraciones crecientes de GIL-11 (1–2000 ng/ml) (verde). Proliferación de células Ba/F3-gp130:IL-11R en presencia y ausencia de concentraciones fijas de IL-11 (100 ng/ml) y concentraciones crecientes de GIL-11 (1–2000 ng/ml) (rojo). Las barras de error definen ±SEM. Se muestra un experimento representativo con tres réplicas biológicas de tres.

La IL-11 humana y el LIF tienen reactividad cruzada entre ratones y hombres42,43,44. Analizamos si la GIL-11 humana también activa células murinas que expresan cadenas gp130:IL-11R:LIFR murinas. Elegimos la línea celular de mioblastos murino C2C12. Las células C2C12 se estimularon con HIL-11 humana (200 ng/ml), IL-11 humana (200 ng/ml), LIF humana (10 ng/ml) y GIL-11 (200 ng/ml). HIL-11 y LIF indujeron la fosforilación sostenida de STAT3 mientras que IL-11 y GIL-11 no lo hicieron, lo que sugiere que las células C2C12 expresan gp130 y LIFR pero carecen de la expresión de IL-11R (Fig. 6a, Fig. 9 complementaria). Transfectamos células C2C12 con un plásmido que codifica ADNc de IL-11R murino. Dando como resultado la expresión de mIL-11R, lo que hace que estas células respondan a IL-11 y GIL-11 como se muestra en la fosforilación de STAT3 (Fig. 6a, Fig. 9 complementaria). También estimulamos la línea de células de fibroblastos embrionarios murinos NIH/3T3 con 1, 10, 100 y 1000 ng/ml de GIL-11 humana, IL-11 y 0,1, 1, 10 y 100 ng/ml de LIF. LIF e IL-11 indujeron la fosforilación de STAT3 en NIH/3T3 como se muestra mediante transferencia de Western (Fig. 6b, Fig. 10 complementaria), porque estas células expresan gp130, LIFR e IL-11R45. La estimulación celular dependiente de la dosis mostró que se necesitaban 10-100 ng/ml de GIL-11 e IL-11 para lograr una fosforilación sostenida de STAT3 en NIH/3T3 murino. A continuación, inyectamos 5, 10 y 20 µg de GIL-11 por vía intraperitoneal en ratones de tipo salvaje. 30 minutos después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se extrajo tejido de corazón, hígado y bazo. El análisis de la fosforilación de STAT3 mediante transferencia Western mostró que al menos 10 µg/ratón de GIL-11 fue suficiente para inducir una fosforilación sostenida de STAT3 en el corazón, el hígado y el bazo (Fig. 6c, Fig. 11 complementaria). En conjunto, nuestros datos demostraron que la GIL-11 humana activa la combinación de receptores murinos gp130:IL-11R:LIFR.

una activación de STAT3 en mioblastos murinos (C2C12) sin transfectados y transfectados con un ADNc que codifica para IL-11R murino sin citocina (-) y después de la estimulación con HIL-11 (200 ng/ml), IL-11 (200 ng/ml ), LIF (10 ng/ml), GIL-11 (200 ng/ml) durante 15 min. Se analizaron cantidades iguales de proteínas (50 µg/carril) mediante anticuerpos específicos que detectan fosfo-STAT3 y STAT3. Los datos de Western blot muestran un experimento representativo de tres. b Activación de STAT3 en fibroblastos murinos NIH/3T3 sin citocina (-) y después de la estimulación con cantidades crecientes de GIL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml), LIF (0,1, 1, 10, 100 ng/ml) e IL-11 (1, 10, 100, 1000 ng/ml) durante 20 min. Se analizaron cantidades iguales de proteínas (50 µg/carril) mediante anticuerpos específicos que detectan fosfo-STAT3 y STAT3. Los datos de Western blot muestran un experimento representativo de tres. c Activación de STAT3 en corazón, hígado y bazo después de la inyección de 5, 10 o 20 µg/ml de GIL-11. Los ratones se sacrificaron 30 minutos después de la inyección intraperitoneal de citoquinas. Se analizaron cantidades iguales de proteínas (50 µg/carril) mediante anticuerpos específicos que detectan fosfo-STAT3 y STAT3. Los datos de Western blot muestran un experimento representativo de tres.

La interleucina-6 (IL-6) está críticamente involucrada en la regeneración del hígado después de la hepatectomía parcial (PHX). Los ratones IL-6-/- e IL-6R-/- tienen una alta tasa de mortalidad de 40 a 80 % frente al 10 % en ratones de tipo salvaje, acompañada de una disminución de la fosforilación de STAT3 y una disminución de la proliferación de hepatocitos27,46,47,48,49 ,50 siguió a PHX. Hemos demostrado previamente que la inyección de Hyper IL-6 (HIL-6) 24 h antes y directamente después de la cirugía rescató a los ratones de la muerte después de una hepatectomía parcial51. Aquí, se inyectaron 10 µg/ratón de GIL-11 24 h antes y directamente después de PHX en ratones IL-6R-/-. La tasa de supervivencia general de los ratones IL-6R-/- 9 días después de PHX fue de aproximadamente el 40 %, mientras que los ratones IL-6R-/- inyectados con dos dosis de GIL-11 tuvieron una tasa de supervivencia del 90 % (Fig. 7a; Datos). Como se vio antes27, el peso corporal 9 días después de PHX no fue diferente en los ratones IL-6R-/- supervivientes, independientemente de si se les inyectó GIL-11 o PBS, mientras que la relación entre el peso del hígado y el peso corporal disminuyó ligeramente (Fig. 7b, c; Dato suplementario). Sin embargo, notamos que los ratones IL-6R-/- no tratados tenían un mayor peso del bazo en comparación con los ratones IL-6R-/- tratados con GIL-11 (Fig. 7d; Datos complementarios). El análisis de expresión génica mostró una mayor expresión del marcador fibrótico αSMA y el gen de respuesta de fase aguda SAA1 en ratones IL-6R-/- tratados con GIL-11 en comparación con ratones IL-6R-/- no tratados directamente después de PHX (Fig. 7e; Datos complementarios) . En conjunto, nuestros datos mostraron que GIL-11 rescató a los ratones IL-6R-/- de la muerte después de una hepatectomía parcial.

a Los ratones IL-6R-/- se sometieron a PHX al 70 %, se les inyectó PBS (n = 11) o GIL-11 (n = 11), 20 µg cada uno, 24 h antes y directamente después de la cirugía y se controló la supervivencia durante 9 días. b El peso corporal de los ratones IL-6R-/- tratados con y sin GIL-11 después de PHX al 70 % se determinó 12 días después de PHX (n = 4 sin tratar, n = 5 GIL-11). c Se determinó la proporción de peso corporal/hígado de ratones IL-6R-/- tratados con y sin GIL-11 después de PHX al 70 % 9 días después de PHX (n = 5 sin tratar, n = 7 GIL-11). d Se determinó el peso del bazo de ratones IL-6R-/- tratados con y sin GIL-11 después de PHX al 70 % 9 días después de PHX (n = 5 sin tratar, n = 7 GIL-11). e El ARN total se extrajo del hígado directamente después de PHX de ratones IL-6R-/- previamente tratados con y sin GIL-11 y el nivel de ARNm de aSMA, SAA1, Ki67, EGF, CycA2 y G0S2 se determinó mediante PCR cuantitativa (n = 6). b–e Cada punto representa datos derivados de un ratón. Las barras de error son ±SEM.

Nuestros experimentos definen una citoquina de diseño quimérico humano que induce la señalización JAK/STAT típica de la familia y la proliferación celular a través del complejo gp130:IL-11R:LIFR no natural con especificidad entre especies desde el ratón hasta el hombre. El intercambio del sitio III de LIF a IL-11 da como resultado la citokimera GIL-11 con propiedades de unión al receptor que hasta ahora no se encuentran en la naturaleza. El prototipo de citokimera IC7, basado en el andamio IL-6 con el sitio III de CNTF, sirvió como modelo para GIL-113. IC7 y GIL-11 revelaron que el andamiaje general dentro de la familia de citocinas de tipo IL-6 es intercambiable debido a una arquitectura modular general. Dado que la transferencia está restringida al sitio III, queda por ver si la transferencia del sitio I y el sitio II también será factible. Con el segundo de su tipo, GIL-11 tiene características únicas que lo separan de IC7. En primer lugar, IC7 recluta el complejo receptor gp130:IL-6R:LIFR, mientras que GIL-11 ensambla gp130:IL-11R:LIFR, lo que significa que GIL-11 solo se dirige a aquellas células que expresan IL-11R. Esto podría ser un tema importante con respecto a la especificidad celular in vivo. Mientras que el receptor β común gp130 se expresa de manera ubicua, la expresión de LIFR y también de los receptores α está restringida y, por lo tanto, es más específica para el tipo de célula. A diferencia del IL-6R, que se encuentra principalmente en las células inmunitarias y los hepatocitos52,53, la distribución del IL-11R unido a la membrana parece ser más equilibrada54, incluidos los cardiomiocitos55, los fibroblastos56 y las células epiteliales57.

Debido a su limitado perfil de expresión, los receptores α IL-6R, IL-11R y CNTFR confieren una segunda capa de especificidad celular6. Presumimos que el reclutamiento de complejos sintéticos finalmente da como resultado una ganancia de función en la especificidad celular y, por lo tanto, podría promover beneficiosamente y reducir los efectos negativos durante las aplicaciones in vivo de citoquinas de diseño en biología sintética. Es de destacar que IC7Fc activa selectivamente las vías metabólicas que dan como resultado una mayor oxidación de ácidos grasos acompañada de esteatosis prevenida, mayor disipación de energía acompañada de pérdida de peso, hipertrofia muscular y masa magra preservada con estabilidad ósea mejorada en ratones17. En contraste con IL-6 y CNTF, la inyección de IC7 ha demostrado ser segura tanto en ratones como en macacos de primates no humanos sin promover respuestas inflamatorias excesivas3,17,58.

Además, se asumió que el perfil transcriptómico de GIL-11 podría cubrir con LIF, ya que ambos reclutan y activan los heterodímeros gp130 y LIFR, mientras que IL-11 recluta homodímeros gp130. Curiosamente, GIL-11 actuó más entre IL-11 y LIF pero con un grado atenuado. Se ha propuesto que la geometría y la afinidad del complejo ligando-receptor pueden explicar la diversidad funcional de citoquinas particulares de tipo IL-659. La falta de capacidad de GIL-11 para la expresión de algunos genes podría ser beneficiosa. Smad7 es un regulador negativo de la señalización de TGF-ß y parece estar involucrado en la patogenia de las enfermedades inflamatorias del intestino (EII), incluida la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) y media la inflamación intestinal60. Se ha demostrado que la sobreexpresión de MyD88 disminuye la función cardíaca y contribuye a las enfermedades autoinmunes cardiovasculares61,62,63. Se supone que Arid5a contribuye a la tormenta de citocinas. Aparte de eso, los ratones Arid5a-/- son refractarios al shock por endotoxinas, a la lesión pulmonar inducida por bleomicina y a la enfermedad inflamatoria autoinmune64.

En segundo lugar, las citoquinas naturales IC7, IL-6 y CNTF dependen de la unión del receptor α antes de unirse a gp130 y LIFR3, lo que significa que la configuración del sitio de unión III derivado de CNTF en IC7 es una consecuencia directa de la unión de IL-6R, como después de la unión de CNTF a CNTFR. Esta situación es diferente para GIL-11. Aquí, introdujimos el sitio de unión III independiente del receptor α de LIF en la IL-11 dependiente del receptor α. Como se muestra aquí, GIL-11 activa el complejo receptor gp130:LIFR solo después de unirse al IL-11R que no transduce señales. Además, GIL-11 no pudo inhibir la señalización de LIF en células Ba/F3-gp130:LIFR, lo que debería haber sido el caso, si GIL-11 puede unirse a LIFR en ausencia de IL-11R. En conjunto, nuestros experimentos mostraron que, aunque el contexto del sitio de unión original del sitio III de LIF a LIFR es independiente del receptor α, el reformateo del sitio III de LIF en el andamio de IL-11 hace que el sitio III de LIF se una al receptor α dependiente . Por lo tanto, no es la composición exacta de aminoácidos del sitio de unión III, sino más bien la interconexión mediada por los desplazamientos helicoidales α del sitio I con el sitio III lo que define si una citoquina es dependiente o independiente del receptor α65.

Con respecto a la actividad biológica, GIL-11 (CE50: 1,44 ng/ml) es comparable a IL-11 (CE50: 0,72 ng/ml) pero menos eficaz que LIF (CE50: 0,074 ng/ml). Esto podría estar basado en el efecto de andamiaje dominante de IL-11 en lugar del efecto de intercambio del sitio III menor de LIF. Sin embargo, la actividad biológica de GIL-11 podría aumentar por la mutación D186A del sitio I, ya que se sabe que este intercambio de aminoácidos aumenta la afinidad de IL-11 por IL-11R66. Mejorar la unión de citoquinas al receptor α es una estrategia común para mejorar la actividad general en esta familia de citoquinas, como también se ha demostrado para CNTF a CNTFR67 e IL-6 a IL-6R68.

Después de haber caracterizado la actividad biológica y la composición única del receptor de GIL-11, investigamos la capacidad de GIL-11 para sustituir funcionalmente a IL-6 durante la regeneración hepática después de PHX en ratones IL-6R-/-. Nosotros y otros hemos demostrado previamente que la IL-6 y la IL-6R están involucradas críticamente en la regeneración del hígado después de PHX, lo que resulta en una mayor mortalidad en ratones IL-6R-/-27,46,47,48,49,50. Es importante destacar que HIL-6 rescató a los ratones de la muerte después de una hepatectomía parcial51. Además, en ratones de tipo salvaje, la inyección combinada de IL-6 e IL-6R soluble (sIL-6R), pero no de IL-6 sola, acelera la regeneración del hígado después de PHX69. Probablemente debido a que los hepatocitos expresan mucho más gp130 que IL-6R, la mayor presencia de IL-6 y sIL-6R da como resultado una mayor activación de gp130 y una señalización más fuerte de IL-6 en comparación con la IL-6 sola70. Finalmente, el bloqueo de la transseñalización de IL-6 por sgp130Fc da como resultado una mayor mortalidad después de PHX27. Mecánicamente, la producción de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) inducida por transseñalización de IL-6 por las células estrelladas hepáticas contribuyó directamente a la regeneración del hígado después de PHX27. Dado que los ratones IL-6R-/- utilizados en este trabajo carecen de la expresión de IL-6R, tanto la señalización clásica como la trans están deshabilitadas. Por lo tanto, exhiben una tasa de mortalidad del 90% frente al 10% en ratones de tipo salvaje27. Una diferencia crucial entre el tratamiento con GIL-11 y HIL-6 es que GIL-11 se dirige solo a las células que expresan gp130:IL-11R:LIFR, lo que limita el alcance de las posibles células objetivo en el cuerpo, mientras que HIL-6 se dirige a casi todas las células, porque a diferencia de IL-11R y LIFR, se considera que gp130 se expresa de forma ubicua71. Sin embargo, dado que IL-11R, LIFR y gp130 se expresan en los hepatocitos, GIL-11 pudo compensar la transseñalización de IL-6 y rescató a los ratones IL-6R-/- de la muerte después de PHX. Curiosamente, la mayoría de los parámetros, incluidos el peso corporal, del hígado y del bazo, no cambiaron en los ratones supervivientes tratados con GIL-11 y sin tratar. GIL-11, sin embargo, aumenta SAA1 más de 300 veces incluso nueve días después de PHX. SAA1 induce la proliferación de células estrelladas hepáticas72, lo que podría contribuir a la regeneración hepática tras la aplicación de GIL-11.

Habiendo demostrado la actividad general in vitro e in vivo, creemos que GIL-11 será de interés común para las condiciones en las que las citocinas de tipo IL-6, incluida IC7, muestran efectos beneficiosos73. Recientemente, los efectos beneficiosos descritos originalmente de la IL-116 humana en modelos murinos de enfermedades humanas han sido cuestionados. Se afirmó que el modo de acción de la IL-11 humana inyectada en ratones en realidad se basa en la inhibición competitiva de la señalización de la IL-11 endógena26. Se concluyó que la IL-11 tiene efectos más perjudiciales que beneficiosos en una variedad de modelos de enfermedades murinas, incluida la esteatohepatitis no alcohólica, la fibrosis cardiovascular, la fibrosis pulmonar idiopática y la enfermedad pulmonar fibrótica26. Curiosamente, se consideró que la IL-11 inducía preferentemente la señalización de ERK y no, como la IL-6, que actúa a través del mismo homodímero gp130, la fosforilación de STAT326. Por lo tanto, tratamos mioblastos murinos (células C2C12) con HIL-11, IL-11 y GIL-11 recombinantes en presencia y ausencia de IL-11R murino que, sin embargo, resultó en una fosforilación sostenida de STAT3 dependiente de IL-11R. La inyección de GIL-11 en ratones también dio como resultado una fosforilación sostenida de STAT3 en el corazón, el hígado y el tejido del bazo, lo que demuestra que nuestras citocinas humanas y GIL-11 activan las vías de señalización canónicas gp130 y gp130:LIFR caracterizadas por la fosforilación de STAT3. Por razones desconocidas ya diferencia de IL-11, GIL-11 solo induce pobremente la transmisión de señales a través de complejos GIL-11:sIL-11R y no es inhibida por sgp130Fc. Será interesante ver cuál será la consecuencia de la aplicación de GIL-11 para modelos murinos de enfermedades fibróticas.

Aunque el LIF está relacionado con la fertilidad y una serie de trastornos neurológicos, entre ellos la esclerosis múltiple, el LIF recombinante no se utiliza como tratamiento74,75. La capacidad de GIL-11 para inducir señalización similar a LIF a través de complejos gp130:LIFR podría abrir aplicaciones similares a LIF como sustituto potencial de hLIF recombinante. Dado que la actividad de GIL-11 necesita células que no solo expresen LIFR sino también IL-11R, la actividad de GIL-11 está restringida a un número limitado más bajo de células diana en comparación con LIF, lo que podría aliviar los posibles efectos secundarios negativos no deseados.

En conclusión, nuestro estudio define a GIL-11 como una nueva citoquimera prometedora, según nuestro conocimiento, con activación específica de alta afinidad del receptor no natural gp130: LIFR: IL-11R complejo. La arquitectura modular de las citoquimeras en general permite una amplia gama de combinaciones de receptores dirigidos y de células dirigidas.

El cDNA que codifica para GIL-11 fue ordenado por BioCat GmbH, que se optimizó por codones y se basó en IL-11 y LIF humanos. Luego, el ADNc de GIL-11 se insertó en el vector de expresión pcDNA3.1, incluido el péptido señal 5 'para IL-11R humano (Q14626, aa 1–24), seguido de secuencias para la etiqueta myc (EQKLISEEDL) y el fragmento que codifica para GIL-11, Enlazador Gly4Ser, un sitio de reconocimiento TEV y una etiqueta twin-strep.

Los modelos de proteínas se generaron a través del portal web Phyre276. Se generaron modelos complejos y alineaciones de secuencias basadas en estructuras utilizando UCSF Chimera versión 1.13.1, desarrollado por Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics de la Universidad de California, San Francisco, con el apoyo de NIH P41-GM10331177.

La generación de células Ba/F3-gp130, Ba/F3-gp130:IL-6R y Ba/F3-gp130:IL-11R se describió en otro lugar35,36. La línea celular de envasado Phoenix-Eco se recibió de Ursula Klingmüller (DKFZ, Heidelberg, Alemania). Las células NIH/3T3 se adquirieron del Instituto Leibnitz DSMZ-Colección Alemana de Microorganismos y Cultivo Celular (Braunschweig, Alemania). Todas las células se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO2 en una atmósfera saturada de agua en medio de cultivo alto en glucosa modificado de Dulbecco Eagle's medium (DMEM) (GIBCO®, Life Technologies, Darmstadt, Alemania) con suero de ternera fetal al 10 % (GIBCO ®, Life Technologies) y 60 mg/l de penicilina y 100 mg/l de estreptomicina (Genaxxon Bioscience GmbH, Ulm, Alemania). Se obtuvieron células murinas Ba/F3-gp130 de Immunex (Seattle, WA, EE. UU.) y se cultivaron en presencia de HIL-6. Medio acondicionado al 0,2% (10 ng/ml) de un clon estable de células CHO-K1 que secretan HIL-6 en el sobrenadante78. Las células Expi-293F™ (ThermoFisher Scientific) se cultivaron en medio de expresión Expi293™ sin antibióticos hasta que alcanzaron una densidad de 3–5 × 106 c/ml en una incubadora a 37 °C con 8 % de CO2 en un agitador orbital a 125 rpm. Los ligandos sintéticos se expresaron y purificaron como se describe79. La OSM humana recombinante (n.º de catálogo 295-OM) y la LIF humana recombinante (n.º de catálogo 7734-LF) se adquirieron de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.). Se usó un plásmido de expresión para IL-11 pET22-IL-11-His6 para la expresión de IL-11. La IL-11 se expresó como una proteína soluble en Escherichia coli y se purificó mediante cromatografía de afinidad con metales inmovilizados. Sgp130FC se expresó en células ExpiCHOTM (ThermoFisher Scientific). Las células se cultivaron en medio ExpiCHOTM y se transfectaron de acuerdo con el manual del proveedor (Número de catálogo: A29133). La proteína se purificó como se describió anteriormente80.

Las líneas celulares Ba/F3-gp130 se lavaron tres veces con PBS para eliminar las citocinas y se privaron de suero en DMEM durante 3 h. Se añadió el inhibidor sgp130Fc o sIL-11R 5 min antes de la estimulación. Las células se estimularon durante 15 min (o como se indica) con proteína purificada (concentración como se indica), se recolectaron, se congelaron en nitrógeno líquido y luego se lisaron. En el caso de las células C2C12 y NIH/3T3, las células se lavaron después de la estimulación con PBS una vez antes de separarlas mediante tratamiento con tripsina al 0,05 %, EDTA al 0,1 % (Genaxxon, catálogo C4261.0100) durante 5 min y lavar de nuevo. Las células se lisaron durante 45 min con tampón que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 0,5 mM y una tableta completa de mezcla de inhibidores de proteasa sin EDTA (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La concentración de proteína se determinó mediante un ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, se analizó la expresión de proteínas y la activación de la ruta mediante transferencia Western.

Cincuenta microgramos de proteína total se cargaron en cada carril y se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham Protan; Cytiva; LC, Reino Unido; número de catálogo 10600016). El bloqueo de la membrana se realizó con tampón de bloqueo (Intercept® Blocking Buffer; LI-COR; EE. UU.; nº de catálogo 927-60001) diluido 1:3 en TBS (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, NaCl 150 mM) durante 1 h. Anticuerpos primarios (Phospho-STAT3; Tyr-705; D3A7; n.° de catálogo 9145, STAT3; 124H6; n.° de catálogo 9139, Erk1/2; L34F12; n.° de catálogo 4696, Phospho-Erk1/2; D13.14.4E; catálogo n.º 4370, Cell Signaling Technology, EE. UU. se diluyeron 1:1000 en tampón de bloqueo que contenía Tween-20 al 0,2 % (Sigma-Aldrich; EE. UU.; n.º de catálogo P1379-1L) durante al menos 90 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron con TBS-T (0,1 % Tween-20) y luego se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo 1:10 000 (IRDye® 800CW Donkey anti-Rabbit; catálogo n.° 926-32213 e IRDye® 680RD Donkey anti-Rabbit). Mouse; catálogo n.° 926-68072, LI-COR; EE. UU.) durante 1 h. La detección de señal se logró con LI-COR Odyssey; EE. UU.; modelo 2800). Los anticuerpos secundarios se detectaron simultáneamente en diferentes canales. El análisis de datos se realizó con Image Studio Lite 5.2. Se lisaron tejidos de hígado, bazo y corazón en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0, NaF 2 mM, Na3VO4 1 mM, NP-40 al 1 %, Triton X-100 al 1 %). , 1 comprimido combinado de inhibidor de proteasa completo). Después de la lisis, se midió el contenido de proteínas mediante un ensayo BCA. A continuación, se cargó una cantidad de proteína total de cincuenta microgramos en cada línea, seguido de inmunotransferencia. Los anticuerpos utilizados para la transferencia de órganos animales lisados ​​fueron los siguientes: anti-p-STAT3 (nº de catálogo 9145), anti-total-STAT3 (nº de catálogo 9139).

Las líneas celulares Ba/F3-gp130 se lavaron tres veces con PBS para eliminar las citocinas del medio. Las células con una densidad de 5 × 104 células/ml se suspendieron en DMEM que contenía suero de ternero fetal al 10%, 60 mg/l de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. Las células se cultivaron durante 3 días en un volumen de 100 µl con o sin citoquinas o inhibidor en las concentraciones indicadas. Se usó el ensayo de viabilidad CellTiter Blue (Promega, Karlsruhe, Alemania) para determinar el número aproximado de células viables midiendo la fluorescencia (λex560 nm/λem590 nm) usando el lector de placas Infinite M200 Pro (Tecan, Crailsheim, Alemania). Después de agregar 20 µl/pocillo de reactivo CellTiter Blue (punto de tiempo 0), se midió la fluorescencia después de 60 min cada 20 min hasta por 2 h. Para cada condición de un experimento, se midieron 3 pocillos. Todos los valores se normalizaron restando los valores del punto de tiempo 0 de la medición final.

Las líneas celulares Ba/F3-gp130 se transdujeron retroviralmente con los plásmidos de expresión pMOWS como se describe34. Las células transducidas se cultivaron en medio DMEM como se describe anteriormente complementado con 10 ng/ml de HIL-6. La selección de células Ba/F3-gp130 transducidas se realizó con puromicina (1,5 μg/ml) o higromicina B (1 mg/ml) (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) durante al menos 2 semanas. Posteriormente, las líneas celulares Ba/F3-gp130 generadas se analizaron para determinar la expresión de la superficie celular receptora mediante citometría de flujo. Las células C2C12 se transfectaron con 7,5 µg de plásmido pcDNA3.1 que codifica mIL-11R cDNA y 15 µl de TurboFect y se incubaron durante 48 h.

La expresión en la superficie celular de las líneas celulares Ba/F3-gp130 transfectadas de forma estable se detectó mediante anticuerpos específicos. Se lavaron 5 × 105 células en tampón FACS (PBS, BSA al 1 %) y luego se incubaron en 50 µl de tampón FACS que contenía el anticuerpo primario específico indicado (anti-LIFR o –OSMR; 1:20; nº de catálogo BAF249 y BAF4389, R&D Systems; MN, EE. UU.). Después de una incubación de al menos 1 h a temperatura ambiente, las células se lavaron y resuspendieron en 50 µl de tampón FACS que contenía anticuerpo secundario (IgG anti-cabra conjugado con NorthernLights 493 1:200) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron y resuspendieron en 500 µl de tampón FACS y se analizaron mediante citometría de flujo (citómetro de flujo BD FACSCanto II usando el software FACSDiva, BD Biosciences). El análisis de datos se realizó con FlowJo Versión 10 (Tree Star Inc, EE. UU.).

Los ratones C57BL/6 e IL-6R-/-52 se obtuvieron del Laboratorio Jackson y de las instalaciones para animales de la Universidad Heinrich-Heine de Düsseldorf, respectivamente. Los experimentos de este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con los requisitos de LANUV-NRW, Alemania con el número de aprobación 84-02.04.2019.A303.

Las células Ba/F3-gp130-IL-11R:LIFR se estimularon con GIL-11, IL-11 o LIF durante 40 min a 37 °C. El ARNm se aisló con NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel, Düren, Alemania; nº de cat. 740955.250) según el manual del proveedor. Las muestras de ARN total digerido con ADNasa utilizadas para los análisis de 3′-RNA-Seq se cuantificaron (Qubit RNA HS Assay, Thermo Fisher Scientific) y la calidad se midió mediante electroforesis capilar con el Fragment Analyzer y el 'Total RNA standard Sensitivity Assay' (Agilent Technologies, Inc. . Santa Clara, EE.UU.). Todas las muestras de este estudio mostraron números de calidad de ARN de muy alta calidad (RQN; media = 10,0). La preparación de la biblioteca se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando el QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit FWD de Lexogen®. El montaje de entrada fue de 200 ng de ARN total. Las bibliotecas purificadas de perlas se normalizaron y finalmente se secuenciaron en el sistema NextSeq2000 (Illumina Inc. San Diego, EE. UU.) con una configuración de lectura de SR 1 × 100 pb. La herramienta Illumina DRAGEN FASTQ Generation (versión 3.8.4) se usó para convertir los archivos bcl en archivos fastq, así como para recortar y demultiplexar el adaptador. El análisis de la ontología génica se realizó con el paquete r clusterprofiler y la versión r 4.1.3.

Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos y se manipularon de acuerdo con las normas definidas por FELASA y el organismo nacional de bienestar animal GV-SOLAS (www.gv-solas.de). Todos los animales transgénicos estaban en el fondo C57BL/6 N. Los ratones se alimentaron con una dieta estándar de laboratorio y se les administró agua del grifo esterilizada en autoclave ad libitum. Se mantuvieron en una habitación con aire acondicionado con temperatura controlada (20-24 °C), humedad (45-65%) y ciclo día/noche (12 h luz, 12 h oscuridad). La laparotomía se realizó predominantemente en ratones macho al menos a las 10-12 semanas de edad usando isoflurano por inhalación narcosis 1,5-2% de isoflurano con 1 l/min de oxígeno81. Para realizar una hepatectomía parcial del 70%, se resecó el lóbulo superior derecho, el lóbulo superior izquierdo y el lóbulo inferior izquierdo del hígado junto con la vesícula biliar mediante ligadura en un solo paso con hilo de sutura de poliéster 5-0 (B. Braun Surgical, SA, Rubi , España). Posteriormente, la cavidad abdominal y la capa externa de la piel se cerraron con ácido poliglicólico 5-0 (HR13, B. Braun Surgical, SA, Rubí, España) y monofilamento de polipropileno 4-0 (DS16, B. Braun Surgical, SA, Rubí, España). España) respectivamente. Para reducir el dolor leve de la operación, los ratones se trataron con 5 mg/kg de carprofeno (Rimadyl; Pfizer, Wurselen, Alemania) después de la cirugía. Los ratones IL-6R-/- se sometieron a hepatectomía parcial al 70%. En puntos de tiempo específicos (0, 12 y 24 h) después de la cirugía, los ratones se pesaron y anestesiaron (100 mg/kg de ketamina, 10 mg/kg de xilazina; Vetoquinol GmbH, Ravensburg, Alemania). Tras la anestesia, se extrajo sangre de los ratones para generar el suero para su posterior análisis. Para el tejido hepático, el hígado se enjuagó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se pesó para calcular la relación entre el peso del hígado y el peso corporal y las muestras de tejido se almacenaron a -80 °C para histología y extracción de ARN y proteínas.

GIL-11 fue producido y secretado por células Expi293 (Thermo Fisher) y purificado por cromatografía de afinidad Strep-Tag (Strep-TactinXT 4flow; IBA, catálogo no. 2-5023-001) de acuerdo con el manual del fabricante. Con el fin de forzar la señalización de citoquinas, a los ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal (ip) 20 µg de GIL-11 24 h antes y directamente después de la cirugía.

El ARN total se extrajo del hígado y el bazo con Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La concentración de ARN se midió con un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU., nº de catálogo 172-5140) y se ajustó a 100 ng/µl para todas las muestras. Para determinar la expresión de genes específicos, se utilizó iTaqTM Universal SYBR green One-Step Kit (BioRad, California, EE. UU., n.º de catálogo 1725151). Master Mix se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron 5 µl de mezcla de reacción de sonda universal iTaq (2x), 0,125 µl de transcriptasa inversa avanzada iScript, 0,125 µl de cebadores y 200 ng de ARN. A continuación, el volumen total de la mezcla se ajustó a 10 µl mediante la adición de H2O libre de Nuclease. Para el análisis, los niveles de expresión de todos los genes objetivo se normalizaron a la expresión de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gapdh) (ΔCT). Los valores de expresión génica se calcularon en base al método ΔΔCt. Las cantidades relativas82 se determinaron utilizando la ecuación: RQ = 2−ΔΔCt. El nivel de expresión de los genes objetivo se determinó mediante el sistema de PCR en tiempo real ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). En este estudio se utilizaron los siguientes pares de cebadores: GAPDH fw 5′ TCCCACTCTTCCACCTTCGA, GAPDH rev 5′ AGTTGGGATAGGGCCTCTCTT, SAA1 fw 5′ GACACCATTGCTGAGCAGGAA, SAA1 fw 5′ GGGAGTCCAGGAGCTCTGTAG, Ki67 fw 5′ GCCGAGTCTGGCATTGAA, Ki67 rev 5′ TTTTCTTTC TTCTTTTGCTGAGG, EGF fw 5′ TTCTCACAAGGAAAGAGCATCTC, EGF rev 5′ GTCCTGTCCCGTTAAGGAAAAC, Cyclin A2 rev 5′ GAGGTGGGAGAAGAATATAA, Cyclin A2 rev 5′ ACTAGGTGCTCCATTCTCAG, G0S2 rev 5′ TCTCTTCCCACTGCACCCTA, G0S2 rev 5′ TCCTGCACACTTTCCATCTG, aSMA fw 5′ CT GACAGAGGCACCACTGAA, aSMA rev 5′ CATCTCCAGAGTCCAGCACA.

Los datos se proporcionan como medias aritméticas ± SEM utilizando GraphPad Prism, versión 8. Las diferencias estadísticamente significativas entre dos grupos se determinaron con una prueba t de Student, incluida la corrección de Welch, si se indica. Los análisis estadísticos entre varios grupos se determinaron utilizando un ANOVA de dos vías, incluida la corrección de Tukey o Dunnet. La significación se calculó como sigue p > 0,05: ns; p < 0,05: *; p < 0,01: **; p < 0,001: ***; p < 0,0001: ****. Los ensayos in vitro se realizaron al menos en tres experimentos independientes. Para los experimentos in vivo, se usaron ratones compañeros de camada como especímenes individuales independientes.

Los análisis de datos en archivos fastq se realizaron con CLC Genomics Workbench (versión 22.0.2, QIAGEN, Venlo. NL). Después del filtrado UMI (Unique Molecular Identifier), todas las lecturas restantes de todas las sondas se recortaron con el adaptador y la calidad (usando los parámetros predeterminados: las bases por debajo de Q13 se recortaron desde el final de las lecturas, nucleótidos ambiguos como máximo 2). El mapeo se realizó contra la secuencia del genoma de Mus musculus (mm39; GRCm39.107) (20 de julio de 2022). Después de agrupar las muestras (para réplicas biológicas cada una) según su respectiva condición experimental, se determinó la expresión diferencial estadística utilizando la herramienta Expresión diferencial para RNA-Seq (versión 2.7). Los valores de P resultantes se corrigieron para pruebas múltiples mediante la corrección FDR. Se consideró significativo un valor de AP ≤0,05. La prueba de enriquecimiento de conjuntos de genes (versión 1.2) se realizó con parámetros predeterminados y se basó en el término GO 'proceso biológico' (M. musculus; 16 de diciembre de 2021). Para cada grupo se utilizaron n = 4 muestras biológicamente independientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los autores declaran que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el manuscrito y de los autores previa solicitud. Los datos de expresión génica de 3′-RNA-Seq están disponibles en NCBI Gene Expression Omnibus; código de acceso: GSE226064. El plásmido que codifica GIL-11 se ha depositado en Addgene; ID de plásmido: 199627 y se proporcionará a pedido.

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Damos las gracias a Yvonne Arlt para la asistencia técnica. La infraestructura computacional y el soporte fueron proporcionados por el Centro de Tecnología de la Información y los Medios de la Universidad Heinrich Heine de Düsseldorf. Este trabajo fue financiado por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1116).

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de Medicina, Universidad Heinrich-Heine, 40225, Düsseldorf, Alemania

Puyan Rafii, Christiane Seibel, Hendrik T. Weitz, Julia Ettich, Anna Rita Minafra, Doreen M. Floss, Kristina Behnke, Jens M. Moll y Jürgen Scheller

Centro de Investigaciones Biológicas y Médicas (BMFZ), Facultad de Medicina, Universidad Heinrich-Heine, Universitätsstraße 1, 40225, Düsseldorf, Alemania

patricio petzsch

Laboratorio de Investigación Cardiovascular, Facultad de Medicina, Hospital Universitario de Düsseldorf, 40225, Düsseldorf, Alemania

Alexander Lang y Karl Köhrer

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PR realizó la mayoría de los experimentos, curación de datos, PR, CS, AM, HTW, DMF, KB, JM, JS análisis formal, validación, investigación, metodología, corrección del manuscrito; KB y HTW realizaron una hepatectomía parcial. JE apoyó la clonación y el cultivo celular. CS expresó y purificó el sgp130Fc; PP y KK ayudó con el análisis transcriptómico; AL ayudó con el diagrama de Venn y la ontología de genes; PR y JS redacción-borrador original; Administración de proyectos JS, adquisición de fondos.

Correspondencia a Jürgen Scheller.

JS, PR y JM son inventores de GIL-11 y tienen patentes de esta molécula (EP22214005.5). Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: Joao Valente.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Rafii, P., Seibel, C., Weitz, HT et al. Cytokimera GIL-11 rescató ratones deficientes en IL-6R de la muerte inducida por hepatectomía parcial mediante la señalización a través de complejos gp130:LIFR:IL-11R no naturales. Comun Biol 6, 418 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04768-4

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Recibido: 30 junio 2022

Aceptado: 27 de marzo de 2023

Publicado: 15 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04768-4

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