Las láminas de células de fibroblastos multicapa preservadas en seco son una nueva herramienta manejable para la medicina regenerativa para promover la cicatrización de heridas

Apr 03, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12519 (2022) Citar este artículo

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Este estudio investigó los efectos terapéuticos de las láminas de células de fibroblastos multicapa conservadas en seco (láminas secas) en las úlceras cutáneas. Se prepararon hojas secas secando al aire hojas de células de fibroblastos multicapa (hojas vivas) para cesar sus actividades vitales. Antes de la aplicación in vivo, probamos la liberación de factores de crecimiento en el medio para examinar los mecanismos de las sábanas secas en la cicatrización de heridas. El factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) se liberaron tanto de las hojas secas como de las vivas, mientras que los altos niveles del factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2) y la proteína del grupo de alta movilidad 1 (HMGB1) se liberaron solo de sábanas secas. Un ensayo de proliferación de fibroblastos in vitro reveló que el eluato de hoja seca mejoró significativamente la proliferación celular y la producción de VEGF y HGF en comparación con el eluato de hoja viva. Los anticuerpos neutralizantes de FGF-2 bloquearon significativamente esta respuesta proliferativa. En heridas creadas en ratones diabéticos, los grupos de tratamiento con sábanas secas que utilizaron células autólogas o alogénicas mostraron un cierre de la herida significativamente acelerado en comparación con el grupo sin tratamiento. La estabilidad de almacenamiento de la lámina seca fue mejor a temperatura de refrigeración que a temperatura ambiente y se mantuvo estable durante al menos 4 semanas. Nuestros datos indicaron que las sábanas secas alogénicas representan una nueva herramienta prometedora para la medicina regenerativa que promueve la cicatrización de heridas.

La tecnología de láminas celulares se ha desarrollado recientemente para mejorar la retención de células trasplantadas en la región injertada1, y la terapia de trasplante de láminas celulares se ha utilizado para prevenir diversas enfermedades y complicaciones posoperatorias, incluida la miocardiopatía isquémica, la fuga de aire después de operaciones pulmonares y la estenosis después de cirugía submucosa endoscópica. disección del esófago2,3,4. Esta técnica también se puede utilizar para tratar úlceras cutáneas.

Anteriormente, desarrollamos una hoja de células mixtas que constaba de fibroblastos y células mononucleares de sangre periférica (PBMNC), que aumentaba la secreción del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de los fibroblastos mediante los efectos sinérgicos del cocultivo con PBMNC y el tratamiento del precondicionamiento hipóxico5 ,6. Uno de los principales mecanismos de acción de los efectos terapéuticos de las láminas celulares implica un efecto paracrino debido a la producción de factores de crecimiento y citocinas a partir de las láminas celulares. Se ha demostrado que las láminas de células mixtas tienen éxito en la cicatrización de heridas en modelos de úlceras cutáneas en ratones y conejos5,6. En nuestro trabajo anterior, desarrollamos un método simple para fabricar láminas de células multicapa y reportamos la utilidad de láminas mixtas multicapa autólogas, que fueron tratadas con preacondicionamiento hipóxico, en un modelo de úlcera de piel de ratón7. Además, en un estudio clínico en el que se trasplantó a una úlcera de la pierna una hoja de células mixtas multicapa autólogas hipóxicas preacondicionadas que contenía PBMNC y células de fibroblastos de la mucosa oral humana, se confirmaron estos efectos de promoción de la seguridad y la cicatrización de heridas8. Sin embargo, tres de los seis casos no dieron como resultado el trasplante: uno debido a la falta de crecimiento de células de fibroblastos, mientras que los otros dos no cumplieron los criterios para el trasplante debido a la producción deficiente de VEGF8. Este estudio clínico que utilizó células autólogas también reveló una alta tasa de rendimiento deficiente de los fibroblastos de los pacientes. La terapia de láminas celulares con células autólogas es un método prometedor con el potencial de tratar con éxito a los pacientes, lo que requiere un suministro estable de láminas celulares preparadas con células alogénicas. El propósito de las PBMNC autólogas en las hojas de células mixtas era mejorar la capacidad secretora de los fibroblastos. Sin embargo, la estratificación de láminas de células mejoró suficientemente la función de las láminas de fibroblastos, y hubo poca diferencia entre los efectos de los fibroblastos solos y las láminas de células mixtas en un modelo de úlcera de piel de ratón7. Confirmamos que las hojas de células de fibroblastos multicapa secretaron suficientes factores de crecimiento y que el efecto de curación de heridas de las hojas de células de fibroblastos multicapa alogénicas fue comparable al de las hojas de células autólogas en un modelo de úlcera de ratón. Aunque se produce cierta inmunidad local, esto no afecta negativamente a la cicatrización de heridas9. Por lo tanto, al considerar la aplicación clínica de la terapia de trasplante de láminas celulares, las láminas celulares preparadas a partir de células alogénicas que pueden suministrarse de manera estable pueden representar el mejor enfoque.

Para mejorar la comodidad y la aceptación de la terapia con láminas celulares, será esencial desarrollar un método simple de conservación de láminas celulares que se pueda usar rápidamente. Una opción es el uso de láminas de matriz extracelular (MEC), que se descelularizan por congelación-descongelación10. Estas láminas tienen las ventajas de la estabilidad de almacenamiento y menores tasas de rechazo inmunológico y actúan como un andamio para las células cuando se trasplantan10,11. Sin embargo, retienen pocas sustancias bioactivas debido al daño celular causado por la congelación y descongelación. De lo contrario, la conservación en seco es el método óptimo en términos de conveniencia. Se han realizado estudios sobre láminas de células epidérmicas liofilizadas12,13 y láminas de membrana amniótica14,15; sin embargo, todavía no hay informes sobre láminas de fibroblastos conservadas en seco. Por lo tanto, en este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar una hoja de células de fibroblastos multicapa conservada en seco (hoja seca) y evaluar sus efectos terapéuticos utilizando fibroblastos alogénicos en un modelo de úlcera cutánea de ratón. Para verificar la eficacia de las láminas secas, las comparamos con láminas de congelación y descongelación (láminas FT), que casi no contienen contenido celular después de repetidos ciclos de congelación y descongelación, y láminas de células de fibroblastos de varias capas (láminas vivas). Todas las láminas de células, vivas, secas y FT utilizadas en este estudio se produjeron a partir de láminas de células de fibroblastos multicapa preacondicionadas hipóxicas, que se informaron anteriormente7, ya que el preacondicionamiento hipóxico es eficaz para aumentar la potencia secretora de los fibroblastos5,6. Previo a la aplicación in vivo, se probó la liberación de factores de crecimiento en el medio para estudiar los mecanismos de acción de las láminas secas en la cicatrización de heridas. No se espera que las hojas secas secreten factores angiogénicos como VEGF y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), que son secretados por hojas vivas. Sin embargo, el secado puede causar daño a las membranas celulares y la liberación de sustancias intracelulares tras la rehidratación. En este estudio, nos enfocamos en el factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2)16,17,18,19,20 y la proteína de caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1)21,22,23,24,25,26, que se liberan de las células dañadas y están involucrados en la cicatrización de heridas. Investigamos si estos factores de crecimiento se liberan de las hojas secas al medio y si retienen sus actividades biológicas.

Se sembraron fibroblastos primarios cultivados, derivados de la piel de la cola de ratón (C57BL/6N), a razón de 4,2 × 105 células por pocillo en placas de cultivo normales de 24 pocillos para formar una hoja de células multicapa y, a continuación, las células se incubaron en condiciones normóxicas (37 °C, 5 % CO2, 20 % O2) durante 2 días, seguido de condiciones hipóxicas (33 °C, 5 % CO2, 2 % O2) durante 1 día para el tratamiento del precondicionamiento hipóxico5,6,7. Después de la incubación, las láminas de células de fibroblastos multicapa se separaron suavemente de las placas de cultivo después del tratamiento de eliminación para su uso como láminas vivas en este estudio. Como se muestra en la Fig. 1a, tanto las hojas secas como las hojas FT se produjeron a partir de hojas vivas mediante secado al aire durante 30 minutos o ciclos de congelación y descongelación, respectivamente. Se proporcionan más detalles en la sección "Material y métodos". Las observaciones morfológicas de cada hoja de celda se muestran en la Fig. 1b. La lámina viva se encogió hasta aproximadamente la mitad de su tamaño adjunto después de separarse de las placas de cultivo. La hoja seca era lo suficientemente dura como para agarrarla con pinzas, pero mantuvo su estructura (Fig. S1 complementaria). La hoja FT era más transparente que la hoja viva.

Preparación y análisis histológico de láminas celulares. ( a ) Diagrama esquemático de la fabricación de láminas de células de fibroblastos de múltiples capas, láminas de células de fibroblastos de múltiples capas conservadas en seco y láminas de congelación y descongelación (FT). ( b ) Observaciones morfológicas de las hojas vivas, secas y FT. Cada lámina de células se colocó en un pocillo de la placa de 24 pocillos (barra de escala = 5 mm). (c) Secciones transversales de las láminas vivas, secas y FT con tinción HE (barra de escala = 50 µm). ( d ) Secciones transversales de las hojas vivas, secas y FT con tinción de Azan (barra de escala = 50 µm). (e) Secciones transversales de las láminas vivas, secas y FT con tinción inmunofluorescente de colágeno tipo I (rojo) y DAPI (azul) (barra de escala = 50 µm). (f) Espesor promedio de cada hoja de celda. Los valores se expresan como media ± DE (*P < 0,05, prueba de Tukey-Kramer, n = 6 por grupo). ( g ) Número promedio de capas en cada hoja de celda. Los valores se expresan como media ± SD (prueba de Tukey-Kramer, n = 6 por grupo). ( h ) Número promedio de núcleos en cada hoja de celda. El número de núcleos dentro de 100 μm a lo largo del eje largo se midió en secciones de cada lámina celular. Los valores se expresan como media ± DE (** P < 0,01, prueba de Tukey-Kramer, n = 6 por grupo). Vivir: sábanas vivas; Seco: sábanas secas; FT: láminas congeladas-descongeladas.

Las secciones transversales de cada hoja (es decir, viva, seca o FT) teñidas con hematoxilina-eosina (HE) y Azan se muestran en la Fig. 1c, d. Todas las láminas tenían capas multicelulares. La hoja seca (21 ± 4,2 µm) era ligeramente más delgada que la hoja viva (25,7 ± 5,1 µm) y tenía de cinco a siete capas (Fig. 1f, g). En la hoja seca, hubo ligeros cambios morfológicos en los núcleos celulares, que se hincharon y se volvieron más variables en tamaño. El número de núcleos por 100 μm de longitud de la hoja fue significativamente mayor en la hoja seca, probablemente debido al menor volumen después del secado (Fig. 1h). Los cambios fueron relativamente grandes en la hoja FT, en la que se redujeron notablemente el número de núcleos y la cromatina. En las tres hojas se encontraron áreas azules (que indican colágeno por tinción con Azan) y áreas rojas (que indican colágeno tipo I de ECM, según lo revelado por inmunotinción fluorescente); su prominencia se clasificó en el orden de hojas vivas, secas y FT (ver Fig. 1e).

Las hojas de células se secaron al aire en un banco de biolimpieza en las siguientes condiciones: temperatura de 30,7 °C (rango de 27,6 a 31,4 °C), humedad del 39,6 % (rango de 31,1 a 49,6 %) y velocidad del viento de 0,1 a 0,4 m/s. Se midió el cambio de peso de la hoja viva a la hoja seca durante el secado al aire. El peso medio de la hoja viva fue de 6,9 ​​mg. El secado al aire disminuyó el contenido de agua de la lámina celular y el peso de la lámina celular alcanzó el equilibrio en un promedio de 13,7 min (9, 12 y 20 min) de tres experimentos independientes. El peso promedio de una lámina seca que alcanzó el equilibrio fue de 0,31 mg (Fig. 2a). El área superficial media de la hoja seca fue de 0,31 cm2/hoja, y el contenido de humedad de la hoja seca, medido por el método de Karl Fischer, fue del 3,2%. La velocidad de secado inicial fue de 7,9 mg/min·cm2.

Investigación del cambio de peso y citotoxicidad de láminas celulares con tiempo de secado. (a) Cambios en el peso de una hoja de células de fibroblastos multicapa durante el tiempo de secado en el banco de biolimpieza. El peso medio de una hoja viva era de 6,9 ​​mg. Durante el secado, el peso promedio fue de 0,31 mg después de un promedio de 13,7 min. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. Las líneas continuas y discontinuas muestran el peso y la velocidad de secado inicial, respectivamente. (b) Tinción DAPI de sábanas vivas y secas no fijadas. Se usaron hojas vivas sumergidas en metanol como control positivo y hojas de células unidas como control negativo (barra de escala = 50 µm). (c) Evaluación de la relación entre el tiempo de secado de las láminas celulares y el daño de la membrana celular mediante el ensayo de liberación de LDH usando la lámina viva sumergida en Lysis Buffer como control positivo y PBS como control negativo. Los valores se expresan como media ± DE (**P < 0,01, ns: no significativo frente a control positivo, prueba de Tukey-Kramer, n = 6 por grupo). ( d ) Observación de la capacidad adhesiva de las láminas celulares después de 24 h de recultivo. Las láminas vivas (izquierda) se adhirieron a la placa de cultivo y se observó que los fibroblastos migraban desde los bordes, pero no en láminas secas (derecha; barra de escala = 50 µm). ( e ) Evaluación de la actividad metabólica celular de una hoja de células recultivadas de 24 h mediante el reactivo WST-8. Los valores se expresan como media ± DE (**P < 0,01, ns: no significativo, prueba de Tukey-Kramer, n = 4 por grupo). Medio: CTS AIM-V + 10% FBS.

Para evaluar la muerte celular debida al secado, se tiñeron láminas de células no fijadas con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para detectar daños en la membrana celular. Solo algunos de los núcleos se tiñeron con DAPI en las hojas vivas (Fig. 2b). A los 5, 10 y 15 minutos de secado, los núcleos de las láminas celulares se tiñeron con DAPI desde la periferia de la lámina celular, pero había áreas sin teñir en el centro de las láminas celulares (Fig. S2 complementaria). Casi todos los núcleos de las láminas secadas durante 30 min se tiñeron con DAPI (Fig. 2b). Esta observación sugiere que la permeabilidad de la membrana celular se vio afectada por el proceso de secado. Para evaluar cuantitativamente las membranas celulares dañadas, se realizó un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) para investigar la relación entre el tiempo de secado y la proporción de células dañadas. En comparación con el control positivo (la hoja viva tratada con tampón de lisis), la tasa de liberación de LDH fue del 21 % en la hoja viva. La tasa de liberación de LDH aumentó con la duración del secado y fue de 88 % a los 10 min, 92 % a los 15 min y ≥ 98 % después de 30 min, lo que corresponde al logro de un peso seco de equilibrio (Fig. 2c).

Para confirmar la supervivencia celular, las hojas de células se volvieron a cultivar durante 24 h. La hoja viva se adhirió a la superficie inferior de la placa de cultivo y los fibroblastos migraron desde el margen de la hoja, mientras que en la hoja seca no hubo adhesión a la placa de cultivo ni migración de fibroblastos (Fig. 2d). Las láminas de células secas cultivadas durante 24 h no exhibieron actividad metabólica y la absorbancia fue comparable a la del medio de cultivo (Fig. 2e). Estos resultados demuestran que las membranas celulares en la lámina seca se debilitaron considerablemente al secarse y que al secarse la lámina cesó irreversiblemente la actividad vital, reflejando la muerte celular.

Tomando estas observaciones en conjunto, el tiempo de secado se fijó en 30 min para garantizar condiciones de secado confiables. Por lo tanto, los siguientes experimentos se realizaron utilizando una lámina seca que se secó al aire durante 30 min y se almacenó a temperatura ambiente (23 °C) durante un máximo de 1 semana.

Para evaluar los factores de crecimiento y las citoquinas que quedan en las hojas secas usando los sobrenadantes de las hojas de células lisadas, medimos los niveles de VEGF, HGF, FGF-2 y HMGB1 usando ELISA. En hojas secas, la cantidad de cada factor de crecimiento fue equivalente a la de las hojas vivas, mientras que las hojas FT mostraron valores significativamente más bajos (Fig. 3a). Posteriormente, examinamos si estos factores de crecimiento se liberaron de las hojas secas al medio. Cada hoja de células se sumergió en 200 µl de medio y se incubó durante 24 h, seguido de la recolección de sobrenadantes de la hoja de células sumergida. Se detectaron VEGF y HGF tanto en los eluatos de hoja viva como de hoja seca, mientras que FGF-2 y HMGB1 se detectaron solo en el eluato de hoja seca (Fig. 3b). Investigamos más a fondo la localización de FGF-2 y HMGB1 en cada hoja de células mediante tinción de inmunofluorescencia indirecta. FGF-2 se localizó principalmente en el citoplasma de hojas secas y vivas, pero no se detectó en las hojas FT (Fig. 3c). Se encontró que HMGB1 estaba colocado principalmente en el núcleo celular en hojas vivas y secas, pero no se detectó en hojas FT (Fig. 3d). Además, las señales de inmunotinción para FGF-2 y HMGB1 disminuyeron notablemente en las láminas secas después de la inmersión (Fig. S3 complementaria). Estas observaciones demuestran que el FGF-2 y el HMGB1 intracelulares en láminas secas se liberaron fácilmente de las células porque la membrana celular y la envoltura nuclear se debilitaron por el secado al aire.

Factores de crecimiento y citoquinas en hoja seca liberados de las células. (a) El nivel de retención de factores de crecimiento de cada lámina celular. La concentración de VEGF, HGF, FGF-2 y HMGB1 del sobrenadante de cada lisado de lámina celular medida por ELISA. El lisado se preparó sumergiendo la hoja de células en 200 µL de tampón de lisis celular 2. Los valores se expresan como media ± DE (**P < 0,01, ns: no significativo, prueba de Tukey-Kramer, n = 3 por grupo). (b) Liberar cantidades de factores de crecimiento de cada lámina celular. Concentraciones de VEGF, HGF, FGF-2 y HMGB1 del sobrenadante de muestras de eluato medidas por ELISA. Las muestras de eluato se prepararon sumergiendo cada hoja de células en 200 µl de CTS AIM-V con FBS al 10 % durante 24 h en condiciones normóxicas. Los valores se expresan como media ± DE (** P < 0,01, prueba de Tukey-Kramer, n = 4 por grupo). Se examinaron diferencias significativas solo entre hojas vivas, secas y FT. Cultivo superior: sobrenadante del cultivo en el momento de la preparación de la lámina (CTS AIM-V + HFDM-1(+) + 5 % FBS), Medio: CTS AIM-V + 10 % FBS. ( c ) Secciones transversales de las hojas vivas, secas y FT con tinción de inmunofluorescencia de FGF-2 (rojo) y DAPI (azul); (barra de escala = 50 µm). ( d ) Secciones transversales de las hojas vivas, secas y FT con tinción de inmunofluorescencia de HMGB1 (rojo) y DAPI (azul; barra de escala = 50 µm). Vivir: sábanas vivas; Seco: sábanas secas; FT: láminas congeladas-descongeladas.

Para investigar la bioactividad del eluato de hoja seca, examinamos la proliferación celular y la producción de VEGF y HGF en fibroblastos in vitro. Los fibroblastos se cultivaron durante 48 h con medio y eluato mezclados en una proporción de 1:1. El eluato de hoja seca fue 1,75 veces mayor que el control y mostró una proliferación celular significativamente mayor que el eluido de hoja viva o FT (Fig. 4a). A continuación, se midieron las concentraciones de VEGF y HGF en los sobrenadantes de cultivo (Fig. 4b,c). Se detectaron cantidades significativas de VEGF y HGF en el eluato seco con fibroblastos en comparación con las del control, mientras que no se detectaron niveles altos de VEGF y HGF en el eluato seco sin fibroblastos, como se ve en la Fig. 3b. Esto podría deberse a la estabilidad de los factores de crecimiento durante las 48 h de incubación. Por lo tanto, las diferencias entre los valores para el eluido con y sin fibroblastos se consideraron como los contenidos de VEGF y HGF recién producidos a partir de fibroblastos debido a la estimulación del eluato y se compararon como una proporción con el control (Fig. 4d, e). El eluato de hoja seca indujo tasas de producción de VEGF y HGF significativamente más altas a 1,53 y 4,64 veces las del control. Estos resultados demuestran que el eluato de hoja seca tenía efectos biológicos sobre las células.

Proliferación celular mejorada, producción de VEGF y HGF en fibroblastos mediante el eluato de láminas secas. Las muestras de eluato se prepararon sumergiendo cada hoja de células en 200 μL de DMEM durante 24 h y el sobrenadante se recogió después de la centrifugación. (a) Los fibroblastos se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración de 8000 células por pocillo en 100 μL de DMEM con 10 % de FBS, seguido de la adición de 100 μL de las muestras de eluato o DMEM como control. Además, se añadieron 100 μL de la muestra de eluato a 100 μL de DMEM con 10 % de FBS por pocillo como muestra de eluato sin fibroblastos. Después de 48 h de incubación en condiciones normóxicas, se recogió el sobrenadante del cultivo y se realizó el ensayo de proliferación celular mediante el reactivo WST-8. La tasa de proliferación celular se calculó usando fibroblastos cultivados en DMEM como control. ( b, c ) Concentraciones de VEGF y HGF en el sobrenadante de cultivo de fibroblastos estimulados por eluato. ( d, e ) Relaciones de producción de VEGF y HGF a partir de fibroblastos tras la estimulación del eluato. Las proporciones se calcularon usando la siguiente fórmula: [(sobrenadante de fibroblastos cultivados con la muestra de eluido) - (sobrenadante de la muestra de eluido sin fibroblastos)]/(sobrenadante de fibroblastos cultivados con DMEM). Los fibroblastos cultivados en DMEM se usaron como control. (f) Las muestras de eluato se incubaron durante 60 min a 37 °C con anti-FGF-2 o anticuerpo de control. Los fibroblastos se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración de 8000 células por pocillo en 100 μL de DMEM con FBS al 1 %, seguido de la adición de 100 μL de la muestra de eluato con los anticuerpos o de DMEM que contenía rFGF-2 (0 o 5 ng/ml) con anticuerpos. Después de una incubación de 48 h en condiciones normóxicas, se aspiró el sobrenadante del cultivo y se realizó el ensayo de proliferación celular con el reactivo WST-8. La tasa de proliferación celular se calculó usando fibroblastos cultivados en 0 ng/ml de rFGF-2 con el anticuerpo de control como control. Los datos de todos los paneles se expresan como media ± DE (*P < 0,05, **P < 0,01, prueba de Tukey-Kramer, n = 9 por grupo). Living: eluido de láminas vivas, Dry: eluido de láminas secas, FT: eluido de láminas congeladas y descongeladas, rFGF-2: proteína FGF-2 recombinante.

FGF-2 es un potente factor de crecimiento. El eluato de hoja seca contenía una gran cantidad de FGF-2, lo que sugiere que FGF-2 puede afectar la actividad biológica. Por lo tanto, examinamos si FGF-2 en el eluato afectaba directamente a la proliferación de fibroblastos usando un anticuerpo neutralizante contra FGF-2 o proteína FGF-2 recombinante (rFGF-2). Bajo la presencia de un anticuerpo de control (control de isotipo de IgG1 de ratón), la respuesta proliferativa de los fibroblastos fue promovida por eluido de hoja seca o rFGF-2. Sin embargo, estas respuestas proliferativas fueron significativamente inhibidas por la neutralización de FGF-2 (Fig. 4f). Estos resultados indican que la actividad biológica de las hojas secas se debió principalmente al efecto del FGF-2.

Se trasplantaron hojas de células autólogas (ratón C57BL/6N) y alogénicas (ratón C3H/He) en defectos de la piel dorsal de 6 mm de espesor completo en ratones diabéticos (macho, C57BL/6N), y cada herida se evaluó los días 0, 1 y 3, 5, 7, 9, 11 y 13 (n = 6; Fig. 5a,b). La tasa de cierre de la herida fue significativamente mayor en los grupos de tratamiento con sábanas secas autólogas y alogénicas que en el grupo de control sin tratamiento en el día 5 (grupo de sábanas secas autólogas y alogénicas frente al grupo de control sin tratamiento: 74,2 ± 5,0 % [ P < 0,05] y 80,0 ± 4,9 % [P < 0,01] frente a 51,0 ± 7,2 %), el día 7 (hoja seca autóloga y hoja seca alogénica frente a sin tratamiento: 95,8 ± 2,1 % [P < 0,01] y 90,0 % ± 4,0 % [P < 0,05] frente a 72,4 ± 5,7 %), y el día 9 (hoja seca autóloga frente a sin tratamiento: 99,4 ± 0,5 % [P < 0,01] frente a 91,0 ± 2,4 %; Fig. 5c ,d).

Efecto terapéutico de láminas de células de fibroblastos multicapa conservadas en seco. ( a ) Imágenes macroscópicas representativas de la herida en los días 0, 1,3, 5, 7, 9, 11 y 13 en la terapia de trasplante de hojas de células autólogas. El grupo de láminas vivas, láminas secas y láminas FT, que se prepararon con fibroblastos autólogos (ratón C57BL/6N), se transfirieron a defectos de la piel en modelos de cierre de heridas cutáneas de espesor completo dorsal de 6 mm de ratones macho diabéticos C57BL/6N. El control indica que no hay tratamiento. (b) Imágenes macroscópicas representativas de la herida en los días 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13 en la terapia de trasplante de láminas celulares alogénicas. El grupo de láminas vivas, láminas secas y láminas FT, que se prepararon con fibroblastos alogénicos (ratón C3H/He) se transfirieron a defectos de la piel en modelos de cierre de heridas cutáneas de espesor completo dorsal de 6 mm de ratones macho diabéticos C57BL/6N. El control indica que no hay tratamiento. (c) La tasa de cierre de heridas de la terapia de trasplante de láminas de células autólogas por láminas vivas (n = 6), láminas secas (n = 6), láminas FT (n = 6) y grupo de control (sin tratamiento) (n = 6 ). La tasa de cierre de la herida se calculó como el porcentaje del área inicial de la herida en los puntos de tiempo indicados. Las barras de error indican el error estándar. Los valores se expresan como media ± SE (*P < 0,05, **P < 0,01, prueba de Tukey-Kramer). (d) La tasa de cierre de heridas de la terapia de trasplante de láminas de células alogénicas por láminas vivas (n = 6), láminas secas (n = 6), láminas FT (n = 6) y grupo de control (sin tratamiento) (n = 6 ). La tasa de cierre de la herida se calculó como el porcentaje del área inicial de la herida en los puntos de tiempo indicados. Las barras de error indican el error estándar. Los valores se expresan como media ± SE (*P < 0,05, **P < 0,01, prueba de Tukey-Kramer).

La observación de las muestras de tejido obtenidas 30 días después del trasplante de cada hoja de células no mostró hallazgos anormales en el tejido después de la cicatrización de heridas en todos los grupos de trasplante de hojas de células, tanto con células autólogas como alogénicas, en comparación con el grupo sin tratamiento (Fig. S4 complementaria) .

Investigamos la posición de las sábanas secas alogénicas durante la cicatrización de heridas. Las láminas secas se discriminaron frente a las áreas azules en el sitio de aplicación (Fig. 6b, d) porque las fibras de colágeno de las láminas se tiñeron de azul con la tinción de Azan (Fig. 1d). Un día después del trasplante, una sábana seca cubrió toda la herida (Fig. 6a,c). Las láminas secas estaban infiltradas con leucocitos, que parecían ser neutrófilos o macrófagos. Hubo una clara diferencia en el color del núcleo entre los leucocitos infiltrados y la lámina. Los núcleos de los leucocitos infiltrados eran claramente visibles con la tinción HE, mientras que los núcleos de las células derivadas de láminas secas se tiñeron débilmente y de forma indistinta con el tiempo después del trasplante (Fig. S5 complementaria). A los 3, 5 y 7 días después del trasplante de hojas secas, la tinción con Azan mostró estructuras similares a hojas "plegadas" y colapso en comparación con 1 día después del trasplante. La hoja seca estaba presente directamente debajo de la costra o epidermis formada, y no se pudo confirmar a partir de la sección transversal el día 9. Por el contrario, no se observaron estructuras similares a hojas en el grupo de control sin tratamiento (Fig. 6e,f ).

Análisis histológico del curso del tratamiento después del trasplante de hojas secas. (a) Sección transversal teñida con HE de una herida cutánea de ratón trasplantada con la sábana seca los días 1, 3, 5, 7 y 9 (barra de escala = 500 µm). Las flechas negras muestran el borde del neoepitelio. (b) Sección transversal teñida con Azan de una herida cutánea de ratón trasplantada con la sábana seca los días 1, 3, 5, 7 y 9 (barra de escala = 500 µm). Las flechas negras muestran el borde del neoepitelio. (c) La imagen encerrada en el cuadrado en (a) en los días 1, 3, 5, 7 y 9 (barra de escala = 50 µm). Las flechas blancas muestran la hoja seca. (d) La imagen encerrada en el cuadrado en (b) en los días 1, 3, 5, 7 y 9 (barra de escala = 50 µm). Las flechas blancas muestran la hoja seca. HE: hematoxilina-eosina. (e) Sección transversal teñida con HE de la herida de la piel en ratones en el grupo sin tratamiento los días 1, 3, 5, 7 y 9 (barra de escala = 500 µm). Las flechas negras muestran el borde del neoepitelio. (f) Sección transversal teñida con Azan de la herida de la piel en ratones del grupo sin tratamiento los días 1, 3, 5, 7 y 9 (barra de escala = 500 µm). Las flechas negras muestran el borde del neoepitelio.

Curiosamente, las observaciones histológicas indicaron que el tratamiento con sábanas secas promovió la cicatrización de heridas. En el día 3 después del trasplante, el grupo de tratamiento alogénico con sábanas secas mostró un aumento significativo en la cantidad de capas de queratinocitos y microvasos en el borde de la herida en comparación con el grupo sin tratamiento (Fig. S6a-d complementaria). De acuerdo con las observaciones macroscópicas de la cicatrización de heridas (Fig. 5b, d), la longitud del neoepitelio en los días 5 y 7 después del trasplante mostró una prolongación significativa en el grupo de tratamiento alogénico con sábanas secas en comparación con el grupo de control sin tratamiento. (Figura complementaria S6e-h).

Para investigar la estabilidad de almacenamiento de los factores de crecimiento contenidos en las hojas secas, examinamos las temperaturas de almacenamiento y la duración del almacenamiento usando hojas secas preparadas simultáneamente. Las láminas secas se almacenaron a temperatura de refrigeración (4 °C) y temperatura ambiente (23 °C) durante 1 día y 1, 2 o 4 semanas. A continuación, los eluatos se prepararon sumergiendo cada lámina seca en el medio durante 24 h y se almacenaron a -30 °C hasta la medición. Las concentraciones de VEGF y HGF no mostraron grandes fluctuaciones con la temperatura o el período de almacenamiento, pero las concentraciones de FGF-2 y HMGB1 disminuyeron gradualmente a temperatura ambiente durante el período de almacenamiento de 4 semanas (Fig. 7). Estos resultados demuestran que el almacenamiento refrigerado es adecuado para láminas secas y que se mantienen estables durante al menos 4 semanas.

Investigación de la estabilidad al almacenamiento de láminas secas. Las láminas secas preparadas simultáneamente se almacenaron a temperatura de refrigeración (4 °C) y temperatura ambiente (23 °C) durante 1 día, 1, 2 o 4 semanas, y luego se prepararon los eluatos sumergiendo cada lámina seca en 200 µL de CTS AIM-V con FBS al 10 % durante 24 h en condiciones normóxicas (37 °C, 5 % CO2, 20 % O2) y almacenado a −30 °C hasta la medición. Las concentraciones de VEGF, HGF, FGF-2 y HMGB1 en el sobrenadante de las muestras de eluato se midieron mediante ELISA. 1D: Período de almacenamiento de 1 día. 1 W: Período de almacenamiento de 1 semana. 2 W: Período de almacenamiento de 2 semanas. 4 W: Período de almacenamiento de 4 semanas. Los valores se expresan como media ± DE (*P < 0,05 frente a 1D 4 ℃, **P < 0,01 frente a 1D 4 ℃, †P < 0,05 frente a 1D 23 ℃, ††P < 0,01 frente a 1D 23 ℃, prueba de Dunnett, n = 4 por grupo).

En la terapia de trasplante de láminas celulares, se teoriza que los efectores más importantes son las células vivas y que se pueden obtener efectos terapéuticos debido a los factores que producen. De acuerdo con esta teoría, estudios previos han demostrado que las láminas celulares producen varios factores de crecimiento y citoquinas, incluidos VEGF, HGF, factor de crecimiento transformante-beta1 y proteína quimiotáctica de monocitos 1, que promueven la cicatrización de heridas7,9. Por lo tanto, generalmente se acepta que las láminas secas no viables no secretan continuamente factores de crecimiento y solo pueden promover la cicatrización de heridas de forma limitada. Sorprendentemente, nuestros datos demostraron que las sábanas secas que usaban células autólogas o alogénicas no fueron significativamente menos efectivas que las sábanas vivas y ejercieron una promoción significativa de la cicatrización de heridas en comparación con el grupo de control sin tratamiento (Fig. 5). Esto probablemente fue inducido por las sustancias bioactivas liberadas de las hojas secas, dadas las diferencias entre las hojas secas y las FT.

Encontramos que cantidades similares de factores de crecimiento y citocinas, incluidos VEGF, HGF, FGF-2 y HMGB1, se conservaron en las células de las hojas secas como en las de las hojas vivas, y que estas sustancias se liberaron fácilmente de las células a la solución ( Figura 3a,b). En particular, FGF-2 en el citoplasma y HMGB1 en el núcleo no se secretaron de las hojas vivas, sino que se liberaron de las hojas secas (Fig. 3b). Confirmamos que el eluato de hoja seca exhibió una bioactividad más fuerte que el eluato de hoja viva mediante el examen in vitro de un ensayo de proliferación de fibroblastos (Fig. 4a). Además, el eluato estimuló los fibroblastos y mejoró la producción de VEGF y HGF (Fig. 4b-d), lo que sugiere que las sustancias liberadas de las hojas secas promueven, tanto directa como indirectamente, la cicatrización de heridas y la angiogénesis.

Se liberaron altos niveles de FGF-2 de las láminas secas al medio y estuvieron involucrados en la actividad biológica. FGF-2 es un factor de crecimiento potente e importante para promover la cicatrización de heridas y la angiogénesis16. Aunque el FGF-2 se expresa en gran medida en los fibroblastos, su secreción extracelular generalmente es ineficaz debido a la falta de péptidos señal secretores. Por lo tanto, la mayor liberación de FGF-2 proviene de células dañadas o muertas17,18,19,20. Un estudio anterior sobre la terapia de trasplante de células estromales mesenquimales (MSC) mostró que los altos niveles de FGF-2 liberados de las MSC trasplantadas lesionadas estimularon la angiogénesis y la neuropoyesis20. Posteriormente, no ha habido informes sobre FGF-2 como efector secretado por láminas celulares. En este estudio, demostramos que el eluato de hoja seca promovió la actividad proliferativa de los fibroblastos, que fue marcadamente suprimida por el anticuerpo neutralizante FGF-2 (Fig. 4f). Estos hallazgos sugieren que la liberación de FGF-2 de las sábanas secas juega un papel importante en la promoción de la cicatrización de heridas y la angiogénesis.

El experimento in vivo que utilizó un modelo de herida en la piel de un ratón diabético mostró que no hubo diferencia en el cierre de la herida entre el grupo de sábanas secas y el grupo de control el día 13. Sin embargo, hubo una diferencia significativa en la tasa de cierre de la herida por observación macroscópica a los 5 días. , 7 y 9 días después del tratamiento (Fig. 5). En los días 5 y 7 después del tratamiento, histológicamente, la epitelización aumentó significativamente en el grupo de sábanas secas (Figura complementaria S6e-h), y hubo una diferencia significativa en la cantidad de microvasos y crecimiento de queratinocitos en el borde de la herida el día 3 después del tratamiento. (Figura complementaria S6a-d). Estos hallazgos indican que los factores de crecimiento se liberaron de las láminas secas durante la fase inicial después del trasplante y que estimularon tanto los fibroblastos como las células alrededor de la herida, incluidos los queratinocitos y las células endoteliales vasculares, tanto directa como indirectamente, lo que puede haber promovido la cicatrización de heridas. Observamos que la estructura en forma de hoja que contenía ECM parecía proteger la herida de factores externos (Fig. 6), pero no pudimos confirmar la proliferación celular dentro de la estructura de hoja. Las características y posibles mecanismos de acción de las láminas celulares utilizadas en este estudio se resumen en la figura 8.

Esquema del mecanismo para el efecto de cicatrización de heridas de cada lámina celular. Se consideró que las hojas vivas tenían el mayor efecto terapéutico al injertarlas después de aplicarlas a la herida. Mientras las hojas vivas estaban vivas, el efecto paracrino de secretar continuamente grandes cantidades de factores de crecimiento promovió la cicatrización de heridas. Cuando las sábanas secas se trasplantan a las heridas, liberan transitoriamente varios factores de crecimiento, que se cree que estimulan la angiogénesis y la activación de las células alrededor de la herida. Además, todas las láminas celulares retuvieron ECM, lo que puede haber promovido la cicatrización de heridas al proteger la herida. Debido a estas diferencias en el mecanismo de acción, la clasificación de la aceleración de la cicatrización de heridas fue la siguiente: sábanas vivas > sábanas secas > sábanas FT. MEC: matriz extracelular.

Cuando el eluato de hoja seca se trató con una cantidad en exceso del anticuerpo neutralizante de FGF-2, la proliferación celular se inhibió al mismo nivel que el control. Sin embargo, la respuesta de proliferación celular al eluato de hoja seca fue significativamente mayor que la del rFGF-2 solo (Fig. 4f). Este resultado indicó que otras sustancias además de FGF-2 también pueden afectar la proliferación celular. Aunque se necesitan más estudios, las sábanas secas también liberan sustancias nucleares, como HMGB1, que se conocen colectivamente como alarminas y actúan como factores de defensa21,22 y participan en la promoción de la cicatrización de heridas23,24,25,26, lo que sugiere que Múltiples factores pueden actuar en conjunto para promover la cicatrización de heridas.

En nuestro estudio anterior, las láminas vivas trasplantadas en modelos de úlceras cutáneas de ratón, tanto autólogas como alogénicas, desaparecieron el día 9 de las imágenes in vivo de fibroblastos que expresan luciferasa9. De manera similar, las observaciones histológicas del proceso de cicatrización de heridas indicaron que las láminas secas alogénicas se ubicaron debajo de la capa epidérmica durante la epitelización, pero no quedaron láminas secas en las muestras de tejido después de completar la epitelización el día 9 (Fig. 6). Se sugirió que la hoja seca se descompuso naturalmente y fue absorbida por los leucocitos infiltrantes. Un estudio anterior que utilizó láminas de células epidérmicas derivadas de seres humanos en un modelo de úlcera de ratón asumiendo un trasplante alogénico en humanos confirmó que las láminas se excretaron ex vivo durante el proceso de cicatrización de heridas27. Estas observaciones sugieren que las láminas secas derivadas de fibroblastos pueden usarse no solo en la superficie del cuerpo sino también en los órganos internos porque se descomponen y absorben. Anteriormente, también hemos demostrado la eficacia de una lámina de células de fibroblastos multicapa para fístulas bronquiales y pancreáticas postoperatorias en modelos animales28,29. Además, las láminas secas también se pueden usar como materiales de recubrimiento biológico para promover la reparación de tejidos y prevenir diversas complicaciones postoperatorias.

Aquí, confirmamos que las sustancias bioactivas retenidas en la hoja seca refrigerada fueron estables durante al menos 1 mes y que algunas sustancias bioactivas se retuvieron incluso cuando se almacenaron a temperatura ambiente (Fig. 7). Aunque en los experimentos con ratones de este estudio se usaron sábanas secas almacenadas a temperatura ambiente durante 7 días o menos, el grupo tratado con sábanas secas mostró efectos significativos de promoción de la cicatrización de heridas en comparación con el grupo sin tratamiento. Dado que el estudio de estabilidad de almacenamiento in vitro reveló que la cantidad de FGF-2 se ve afectada por la temperatura de almacenamiento, se puede esperar un mejor efecto terapéutico controlando estrictamente la temperatura de almacenamiento.

Las hojas secas mantienen su estructura similar a una hoja mientras conservan un cierto grado de rigidez, lo que significa que se pueden usar sin el soporte requerido para la terapia de trasplante de hojas de células y tienen la ventaja de un manejo más fácil (Fig. S1 complementaria). Varias láminas de membrana amniótica deshidratadas ya se han utilizado para el tratamiento de úlceras cutáneas30. Las láminas secas derivadas de fibroblastos tienen ventajas en términos de estabilidad de disponibilidad de material y seguridad frente a infecciones causadas por donantes. Nuestras láminas secas se pueden producir en masa a partir de un solo material, lo que garantiza un suministro estable y una calidad uniforme del producto.

Como limitación, siguiendo nuestros estudios previos5,6,7, todas las láminas de células utilizadas en este estudio se produjeron a partir de láminas de células de fibroblastos de múltiples capas preacondicionadas hipóxicas, ya que el tratamiento del preacondicionamiento hipóxico es efectivo para aumentar la potencia secretora del fibroblasto. Antes de este estudio, planteábamos la hipótesis de que las sábanas secas podrían proporcionar efectos de cicatrización de heridas a través de los mismos factores de crecimiento secretados por las sábanas vivas. Sin embargo, a diferencia del mecanismo de acción de las láminas celulares convencionales, quedó claro que la liberación de FGF-2 de las láminas secas, que no es secretada por las láminas vivas, juega un papel importante en la cicatrización de heridas. Por lo tanto, el efecto del preacondicionamiento hipóxico sobre los factores de crecimiento retenidos en la hoja seca debe investigarse en el futuro.

En conclusión, este es el primer estudio que demuestra que la capacidad de cicatrización de heridas de las sábanas secas alogénicas para las úlceras cutáneas es comparable a las sábanas secas autólogas. Es importante destacar que descubrimos que las hojas secas retenían y liberaban sustancias bioactivas, incluido FGF-2, de las células para promover la cicatrización de heridas. Las hojas secas se pueden refrigerar o almacenar fácilmente a temperatura ambiente y se pueden suministrar de forma rápida y estable. Así, las sábanas secas alogénicas representan una herramienta útil para el tratamiento de las úlceras cutáneas.

Todos los experimentos en este estudio se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes. Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de conformidad con las pautas ARRIVE y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yamaguchi (aprobación número 31-093).

Se compraron ratones macho C57BL/6N y C3H/He (6 semanas de edad) de Japan SLC (Shizuoka, Japón). Se alojaron en una habitación con control de temperatura (22 ± 2 °C), humedad (70 ± 20 %) e iluminación (ciclos de luz/oscuridad de 12 h) con acceso ad libitum a alimentos y agua.

Se aislaron fibroblastos de la piel de la cola de ratones utilizando colagenasa (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japón) y se cultivaron en medio CTS™ AIM-V™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) con suero bovino fetal al 10 % ( FBS; Thermo Fisher Scientific). Las células primarias de fibroblastos se sembraron en una placa normal de 24 pocillos (4,2 × 105 células/pocillo) utilizando 2 ml de medio compuesto por CTS™ AIM-V™ y HFDM-1 (+) (Cell Science & Technology Institute, Sendai, Japón) suplementados con FBS al 5 % y se incubaron en condiciones normóxicas (37 °C, 5 % CO2, 20 % O2) durante 2 días, seguidas de condiciones hipóxicas (33 °C, 5 % CO2, 2 % O2) durante 1 día para la tratamiento del precondicionamiento hipóxico5,6,7. Después de la incubación, las láminas de células de fibroblastos multicapa se enjuagaron dos veces con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se incubaron con 500 µl de solución de dispasa (10 PU/ml, FUJIFILM Wako) durante 30 min en condiciones normóxicas. Después de lavar dos veces con PBS, las láminas de células de fibroblastos multicapa se separaron suavemente de las placas de cultivo. Estas hojas se utilizaron como hojas vivas en este estudio.

El secado al aire se realizó dentro de un banco de biolimpieza (CCV-1300E, Hitachi, Ltd., Tokio, Japón), con la llama piloto del quemador de gas operando en el centro, donde se podían mantener las operaciones limpias. Las hojas vivas se transfirieron a un pedestal de silicona utilizando una punta de calibre ancho de 1000 µl y se desplegaron para evitar arrugas. Después de eliminar la mayor cantidad de agua posible, las láminas se dejaron reposar durante 30 min. Las láminas de células secas se despegaron del silicio con pinzas y se transfirieron a microtubos de 1,5 ml. Para los experimentos de trasplante, las hojas secas se almacenaron a temperatura ambiente (23 °C) y se usaron dentro de 1 semana después de la preparación. Para los experimentos de estabilidad de almacenamiento, las láminas secas se almacenaron con un desecante a temperatura de refrigeración (4 °C) o temperatura ambiente (23 °C).

Se transfirió una placa de cultivo de 24 pocillos que contenía hojas vivas a una bolsa de plástico sellable y se colocó en un congelador (-80 °C) durante 60 min, seguido de descongelación en una incubadora (37 °C) durante 90 min. Los ciclos de congelación y descongelación se repitieron tres veces para destruir las membranas celulares, seguido de dos lavados con 2 ml de PBS para obtener láminas de FT. Las láminas FT se almacenaron después del tercer ciclo de congelación (-80 °C) hasta su uso.

Se transfirieron ocho láminas vivas a una placa de plástico usando una punta de calibre ancho de 1000 µl y se midió el cambio de peso cada minuto usando una balanza XS104 (Mettler Toledo, Inc.) instalada en un banco de biolimpieza. Se realizaron tres experimentos independientes y se calculó la velocidad de secado. Las condiciones ambientales en el banco de biolimpieza se midieron utilizando HYGROPALM-HP32 (Rotronic, Bassersdorf, Suiza) y anemómetro manual INFURIDER (AP-816B, AOPUTTRIVER).

Se midió el peso total de las 50 láminas secas y se sumergieron las láminas en 2 ml de metanol durante dos horas. La cantidad de agua en el metanol se midió utilizando el método de Karl Fischer (Japan Testing Laboratories, Inc., Ohgaki, Japón). El método de Karl Fischer se realizó dos veces.

Las hojas de células no fijadas se tiñeron con DAPI (Dojindo, Kumamoto, Japón). Las imágenes se capturaron con un microscopio BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japón).

Las láminas vivas individuales se secaron al aire durante 5, 10, 15, 30, 45 o 60 min y se sumergieron inmediatamente en 500 µl de PBS durante 30 min a temperatura ambiente. La LDH en el sobrenadante de cada hoja de células se midió con la hoja de células vivas sumergida en 500 µl de tampón de lisis celular como control positivo y PBS como control negativo utilizando un kit de detección de citotoxicidad de LDH (Dojindo).

Las láminas vivas y las láminas secas obtenidas después de un secado de 30 min se transfirieron a otra placa de 12 pocillos que contenía 2 ml de CTS™ AIM-V™ con 10 % de FBS y se cultivaron durante 24 h en condiciones normóxicas. Las hojas de células se observaron utilizando un microscopio óptico de diferencia de fase. La actividad metabólica celular de las láminas de células recultivadas se analizó de la siguiente manera: después de retirar los sobrenadantes del cultivo, 1 mL de CTS™ AIM-V™ con 10 % de FBS que contenía 10 % de [2-(2-metoxi-4-nitrofenil)- 3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio, sal monosódica] (WST-8) (Cell Count Reagent SF; Nacalai Tesque, Inc. Kyoto, Japón) a cada bien e incubar durante 3 h en condiciones normóxicas. La absorbancia del sobrenadante se midió a 450 nm (longitud de onda de referencia: 630 nm).

El protocolo detallado se describió previamente7. En resumen, las hojas de células se transfirieron a un CellShifter (CellSeed Inc., Tokio, Japón) para preparar secciones de tejido. Los tejidos cutáneos aislados o las láminas celulares se fijaron en una solución tampón neutra de formalina al 10 % y se incluyeron en parafina. Se montaron secciones de tres micrómetros de espesor en portaobjetos y se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) o Azan. La inmunotinción se realizó utilizando anticuerpos primarios de conejo para anti-colágeno I (1:200, ab34710, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-FGF-2 (1:30, ab208687, Abcam) y anti-HMGB-1 (1: 400, ab79823, Abcam), anticuerpo anti-CD31 de conejo (1:200, ab28364, Abcam) y un anticuerpo secundario para DyLight550 conjugado cabra anti-IgG de conejo (H&L) (1:200, ab96884; Abcam). Se usó DAPI para teñir los núcleos celulares. Todas las imágenes histológicas fueron capturadas por el microscopio BZ-X710 y analizadas usando el analizador BZ-X (Keyence). Todos los análisis histológicos fueron realizados por un patólogo.

Las láminas de células se sumergieron en microtubos de 1,5 ml con la tapa sellada. Para medir los niveles de citoquinas dentro de las hojas de células, cada hoja de células se sumergió en 200 μL de Cell Lysis Buffer 2 (R&D Systems, Inc. Minneapolis, MN, EE. UU.) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para medir los niveles de citoquinas liberados de las hojas de células, cada hoja de células se sumergió en 200 µl de CTS™ AIM-V™ con FBS al 10 % durante 24 h en condiciones normóxicas (37 °C). Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 2460 × g durante 5 min a 4 °C, y los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -30 °C hasta la medición. Las concentraciones de VEGF, HGF, FGF-2 y HMGB1 en el sobrenadante se midieron utilizando Quantikine Immunoassay Kits (R&D Systems) y HMGB1 ELISA Kit Exp (SHINO-TEST CORPORATION, Kanagawa, Japón), respectivamente, según las instrucciones del fabricante.

Las muestras de eluato se prepararon sumergiendo cada hoja de células en 200 μL de DMEM (Thermo Fisher Scientific) sin FBS durante 24 h en condiciones normóxicas. El sobrenadante se recogió después de la centrifugación (2460 × g, 4 °C, 5 min). Los fibroblastos se sembraron en placas de 96 pocillos a 8000 células/pocillo en 100 μl de DMEM con FBS al 10 %, seguido de la adición de 100 μl de la muestra de eluato o de DMEM sin FBS. Cada muestra de eluato diluida dos veces con DMEM que contenía FBS al 10 % se utilizó como muestra de eluato sin fibroblastos. Después de 48 h de incubación en condiciones normóxicas, se recogió el sobrenadante del cultivo para la medición de VEGF y HGF, seguido del ensayo de proliferación celular. Se añadió DMEM (100 μL) con FBS al 5 % que contenía reactivo WST-8 al 10 % (reactivo de recuento celular SF) a cada pocillo y se incubó durante 1 hora en condiciones normóxicas. La absorbancia del sobrenadante se midió a 450 nm. La tasa de proliferación celular se calculó usando los fibroblastos cultivados en DMEM como control. Las concentraciones de VEGF y HGF en el sobrenadante del cultivo se midieron mediante ELISA y las proporciones de producción se calcularon mediante la siguiente fórmula: [(sobrenadante de fibroblastos cultivados con la muestra de eluido) - (sobrenadante de la muestra de eluato sin fibroblastos)]/(sobrenadante de fibroblastos cultivados con DMEM). Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado.

Las muestras de eluato de hoja seca se prepararon mediante el mismo procedimiento que para el análisis de proliferación celular descrito anteriormente. También se prepararon DMEM que contenían rFGF-2 (0 o 5 ng/mL, FUJIFILM Wako). Estas muestras se incubaron durante 60 min a 37 °C con el anticuerpo neutralizante anti-FGF-2 (30,3 μg/mL, #05-117, clon bFM-1, Merck Millipore, Darmstadt, Alemania), o el anticuerpo de control (Mouse Control de isotipo IgG1, clon 11711; 30,3 μg/mL, MBA002, R&D Systems). Los fibroblastos se sembraron en placas de 96 pocillos a razón de 8000 células por pocillo en 100 μl de DMEM con FBS al 1 %, seguido de la adición de 100 μl de la muestra de eluato con los anticuerpos o de DMEM que contenía rFGF-2 (0 o 5 ng/ ml) con anticuerpos. Después de una incubación de 48 h en condiciones normóxicas, se aspiró el sobrenadante del cultivo y se realizó el ensayo de proliferación celular. Se añadió DMEM (100 μL) con FBS al 0,5 % que contenía 10 % de Cell Count Reagent SF a cada pocillo y se incubó durante 2 h en condiciones normóxicas. La absorbancia del sobrenadante se midió a 450 nm. La tasa de proliferación celular se calculó usando fibroblastos cultivados en 0 ng/ml de rFGF-2 con el anticuerpo de control como control. Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado.

A ratones macho C57BL/6N se les administró estreptozotocina (STZ; FUJIFILM Wako) por vía intraperitoneal a 55 mg/kg cada 24 h durante cinco días consecutivos. Los ratones con valores de glucosa en sangre ≥ 300 mg/dl los días 9 y 10 después de la administración de STZ se clasificaron como ratones diabéticos. Se preparó una úlcera cutánea en los ratones diabéticos el día 14 después de la última administración de STZ. Se anestesiaron ratones macho C57BL/6N con isoflurano al 2 % por inhalación y se creó un defecto cutáneo de 6 mm de espesor total en la piel dorsal mediante un punzón de biopsia (n = 6 por grupo). Las láminas vivas y las láminas FT se transfirieron al defecto de la piel utilizando una punta de calibre ancho de 1000 µL y las láminas secas se manipularon con pinzas. Cada hoja de células se preparó a partir de ratones macho C57BL/6N (autólogos) y ratones macho C3H/He (alogénicos). Todas las heridas se cubrieron con ADAPTIC (#2012; Acelity, San Antonio, TX, EE. UU.) y Derma-aid® (ALCARE, Tokio, Japón) y se fijaron con vendaje Silkytex (#11893; ALCARE) durante las primeras 24 h. El primer día, todas las heridas se cubrieron con Airwall Fuwari (# MA-E050-FT; Kyowa, Osaka, Japón) y se fijaron con vendaje Silkytex9. Cada herida se fotografió con una cámara digital los días 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13. Cada fotografía se normalizó con una medida de 10,5 mm de diámetro y el área de la herida se midió trazando manualmente cada herida. borde utilizando el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.). La tasa de cierre de la herida se calculó de la siguiente manera: [día X] (%) = {1 − (área de la herida [día X]/área de la herida [día 0])} × 100. Las hojas secas se almacenaron a temperatura ambiente (23 °C ) y utilizado para este experimento dentro de 1 semana después de la preparación.

Los resultados se presentan como media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario. Las diferencias estadísticas se evaluaron mediante un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba de Tukey-Kramer para comparaciones múltiples entre grupos o la prueba de Dunnett para comparaciones de grupos múltiples con un grupo de control. Se realizó la prueba t de Student para una comparación estadística entre los dos grupos. Los datos se analizaron estadísticamente en Statcel (software complementario para Microsoft Excel, OMS Ltd., Japón). La significación estadística se fijó en P < 0,05.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Damos las gracias a Yukari Hironaka y Kenzo Ikemoto de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (21K08845 para MY y 22K08960 para RS) y AMED con el número de subvención JP21lm0203008 (para KH).

Departamento de Cirugía y Ciencias Clínicas, Facultad de Medicina de la Universidad de Yamaguchi, Ube, Japón

Yutaro Matsuno, Masashi Yanagihara, Koji Ueno, Toshiro Saito, Hiroshi Kurazumi, Ryo Suzuki, Shunsaku Katsura y Kimikazu Hamano

Departamento de Patología Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Yamaguchi, Ube, Japón

Atsunori Oga

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YM, MY, TS, KU, RS, SK y KH contribuyeron a la concepción y diseño de experimentos. YM, MY, HK y RS realizaron experimentos. YM, MY, KU, RS, AO y KH analizaron los datos. YM, MY, HK y RS contribuyeron con reactivos, materiales y herramientas analíticas, respectivamente. YM, MY, RS, SK, AO y KH escribieron el manuscrito. Todos los autores han discutido los resultados y aprobado el manuscrito.

Correspondencia a Masashi Yanagihara.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Matsuno, Y., Yanagihara, M., Ueno, K. et al. Las láminas de células de fibroblastos multicapa preservadas en seco son una nueva herramienta manejable para la medicina regenerativa para promover la cicatrización de heridas. Informe científico 12, 12519 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16345-6

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Recibido: 09 Marzo 2022

Aceptado: 08 julio 2022

Publicado: 22 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16345-6

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