Indoletilamina N

Jun 16, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 280 (2023) Citar este artículo

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La indoletilamina N-metiltransferasa (INMT) es una enzima de transmetilación que utiliza el donante de metilo S-adenosil-L-metionina para transferir grupos metilo a grupos amino de compuestos aceptores de moléculas pequeñas. INMT es mejor conocido por su papel en la biosíntesis de N, N-dimetiltriptamina (DMT), un compuesto psicodélico que se encuentra en el cerebro de los mamíferos y otros tejidos. En los mamíferos, se cree que la biosíntesis de DMT ocurre a través de la doble metilación de la triptamina, donde INMT primero cataliza la biosíntesis de N-metiltriptamina (NMT) y luego DMT. Sin embargo, se desconoce si la INMT es necesaria para la biosíntesis de DMT endógena. Para probar esto, generamos un nuevo modelo de rata INMT-knockout y estudiamos la metilación de la triptamina mediante ensayos enzimáticos radiométricos, cromatografía en capa fina y espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida de rendimiento ultraalto. También estudiamos la metilación de triptamina en INMT recombinante de rata, conejo y humano. Informamos que los tejidos cerebrales y pulmonares de ratas de tipo salvaje y de INMT-knockout muestran niveles iguales de actividad dependiente de triptamina, pero que los productos enzimáticos no son ni NMT ni DMT. Además, INMT de rata no fue suficiente para la biosíntesis de NMT o DMT. Estos resultados sugieren una vía enzimática alternativa para la biosíntesis de DMT en ratas. Este trabajo motiva la investigación de nuevas vías para la biosíntesis de DMT endógena en mamíferos.

La indoletilamina N-metiltransferasa (INMT) es una enzima de transmetilación que cataliza la transferencia de grupos metilo del cofactor S-adenosil-L-metionina (SAM) a grupos amino de sustratos aceptores de moléculas pequeñas1. La enzima tiene una amplia especificidad de sustrato para varias aminas endógenas y otras moléculas pequeñas, y la triptamina y la N-metiltriptamina (NMT) suelen considerarse los sustratos principales de la enzima2,3. En una reacción de dos pasos que utiliza SAM como donante de metilo, INMT cataliza la transferencia de un grupo metilo a la cadena lateral amino de la triptamina para formar primero NMT y luego N,N-Dimetiltriptamina (DMT) (Fig. 1). Esta vía fue descrita por primera vez en 1961 por Axelrod4, quien utilizó un ensayo enzimático radiométrico y una cromatografía en capa fina para demostrar que los extractos de pulmón de conejo incubados con triptamina y C14-SAM producían C14-NMT y C14-DMT. Este estudio fue uno de los primeros en demostrar que los metabolitos 'psicotomiméticos' podrían formarse enzimáticamente a partir de compuestos naturales.

La vía biosintética de DMT de mamíferos. Se cree que la metilación de la triptamina para formar N,N-dimetiltriptamina se produce a través de una reacción de dos pasos catalizada por la enzima indoletilamina-N-metiltransferasa (INMT), con N-metiltriptamina (NMT) como intermediario. El cofactor S-adenosil-L-metionina (SAM) sirve como donante de metilo, con S-adenosil-L-homocisteína (SAH) como subproducto de esta transferencia de metilo.

La expresión de ARNm de INMT se ha investigado en múltiples especies de mamíferos y se ha informado en cerebro, hígado y pulmón de conejo1, varios tejidos humanos, incluidos corazón, pulmón, hígado y glándula suprarrenal5, así como en cerebro, hígado, pulmón, riñón, corazón , y glándula suprarrenal de rat6. Además, se ha demostrado la expresión de la proteína INMT en tejidos de la glándula pineal, la médula espinal y la retina del macaco Rhesus7. Los extractos de tejidos pulmonares, sobre todo de conejo, históricamente han mostrado una mayor expresión de INMT y una mayor actividad de metilación hacia la triptamina y la NMT, en relación con otros tejidos1,8,9. Como resultado, la INMT de conejo fue la primera INMT en ser clonada y caracterizada, seguida poco después de la INMT humana1,5. Cuando se expresaron en células COS-1, ambas proteínas recombinantes demostraron suficiencia para la metilación de triptamina con valores aparentes de Km (mM) de (media ± SEM) 0,27 ± 0,05 y 2,92 ± 0,07 respectivamente1,5.

Aunque las funciones endógenas de INMT no se comprenden completamente, la enzima es quizás mejor conocida por su función en la metilación de la triptamina endógena para formar el compuesto psicodélico doblemente metilado DMT10. La DMT tiene una similitud estructural con el neurotransmisor serotonina (5-HT), produce efectos psicodélicos cuando se administra a humanos11 y ocurre de forma endógena en una variedad de especies de plantas, así como en tejidos y fluidos corporales de mamíferos12. La presencia de DMT endógeno se confirmó por primera vez en humanos en 1965 mediante análisis de sangre y orina13 y posteriormente se confirmó en sangre, orina y líquido cefalorraquídeo de humanos con una variedad de técnicas analíticas sofisticadas, que incluyen cromatografía de gases (GC) y análisis de alto rendimiento. cromatografía líquida (HPLC) junto con espectrometría de masas (MS) (consulte la referencia 14 para obtener una revisión completa). Sin embargo, el muestreo in vivo de DMT en el cerebro se ha restringido a estudios con roedores, siendo las ratas la especie más estudiada para este propósito. Varios informes han confirmado la presencia de DMT endógeno en cerebro de rata y otros tejidos. Saavedra y Axelrod realizaron inyecciones intracisternales de C14-triptamina en ratas y demostraron la recuperación de C14-NMT y C14-DMT en todo el cerebro mediante cromatografía en capa fina con múltiples sistemas de disolventes15. Beaton y Morris detectaron y cuantificaron DMT de extractos de cerebro completo de ratas no tratadas en diferentes etapas de desarrollo utilizando GC-MS16. Kärkkäinen et al. ratas pretratadas con un inhibidor de la monoaminooxidasa (IMAO) y encontraron DMT presente en tejidos renales, pulmonares, hepáticos y cerebrales usando espectrometría de masas en tándem HPLC (MS/MS)17. Barker et al. analizaron muestras de perfusión recolectadas a través de microdiálisis en la corteza occipital de ratas no tratadas que se comportan libremente y confirmaron la presencia de DMT usando LC-MS/MS18. Finalmente, Dean et al. usó HPLC con detección de fluorescencia para cuantificar DMT en muestras de perfusión recolectadas de la corteza occipital de ratas no tratadas que se comportan libremente y mostró que los niveles de DMT endógeno oscilaron entre 0,05 y 2,2 nM6.

Hay ciertos aspectos de la bioquímica INMT que han impedido una comprensión clara de sus funciones y su papel en la metilación de la triptamina. Esto se debe en parte al hecho de que muchos de los primeros estudios que examinaron la función de INMT se basaron en ensayos ex vivo que utilizaban extractos de proteínas crudas o parcialmente purificadas. Estas técnicas son útiles para comprender la actividad enzimática amplia de los tejidos, pero son insuficientes para caracterizar la actividad de una sola enzima. Un indicador de esta limitación es la promiscuidad reportada de la actividad enzimática de los extractos de proteínas. De hecho, múltiples estudios que utilizaron extractos de varias fuentes de tejido informaron que las enzimas de estos tejidos interactúan con hasta tres docenas de sustratos distintos, incluidos compuestos endógenos y xenobióticos2,3,19. Estos hallazgos a menudo se caracterizaron ampliamente como resultado de la "actividad del INMT", pero las metodologías fueron insuficientes para esa caracterización. Otro indicador de las limitaciones de estas técnicas es que los extractos de proteínas parecen exhibir niveles inconsistentes de actividad y afinidad hacia los sustratos cuando las condiciones del ensayo varían o cuando se obtienen de diferentes tejidos dentro de la misma especie10. Por ejemplo, usando enzimas de extractos crudos de pulmón de conejo, Axelrod identificó 5-HT como el sustrato preferido, con triptamina y NMT mostrando 81% y 39% de la actividad de 5-HT, respectivamente3. Sin embargo, otros estudios que utilizaron enzimas de la misma fuente encontraron que NMT era el sustrato preferido con un valor de Km de 50 µM, seguido de triptamina con un Km de 330 µM8,9,20. La actividad enzimática analizada del extracto crudo de cerebro de pollo mostró que la 5-HT era el sustrato preferido, con triptamina y NMT mostrando 60 % y 47 % de actividad relativa21, respectivamente, y un estudio con extractos de cerebro humano mostró que la triptamina era el sustrato preferido (111 % ), en comparación con 5-HT (100%) y NMT (55%)2. Finalmente, la actividad enzimática de los extractos crudos de cerebro de rata mostró inconsistencias adicionales, donde la triptamina fue el sustrato preferido (Km = 27,8 µM) seguido de NMT (Km = 36,8 µM)22.

Un enfoque más directo para estudiar la actividad de una enzima específica de interés es la utilización de proteínas recombinantes purificadas. Thompson y sus colegas fueron los primeros en adoptar este enfoque, ya que clonaron, expresaron y caracterizaron la INMT humana y de conejo, lo que confirmó que ambas enzimas efectivamente metilan la triptamina1,5. Sin embargo, a pesar de que las ratas han servido como especie modelo para la detección de DMT endógena en el cerebro, ningún estudio hasta la fecha ha intentado caracterizar la actividad de la INMT de rata recombinante o investigar la INMT de rata utilizando enfoques transgénicos modernos.

Para comprender mejor el papel que desempeña INMT en la biosíntesis de DMT endógeno, utilizamos CRISPR/Cas9 para desarrollar un nuevo modelo de rata con deficiencia de INMT. Se eligieron ratas porque han sido la especie modelo para la detección in vivo de DMT hasta la fecha. Debido a que durante mucho tiempo se ha asumido que una función principal de INMT es la metilación de la triptamina para formar NMT y DMT, planteamos la hipótesis de que los tejidos de ratas con deficiencia de INMT carecerían de estas funciones. Para probar esta hipótesis, utilizamos pares de compañeros de camada de cruces INMT+/− para comparar la actividad de metilación de triptamina en tejidos cerebrales y pulmonares entre ratas INMT +/+ (WT) e INMT −/− (KO). Antes de este estudio, la investigación de INMT recombinante se había limitado solo a INMT de conejo y humano, por lo que también comparamos la actividad de metilación de triptamina de INMT recombinante de rata, conejo y humano expresada en E. coli. Para estudiar la actividad enzimática, incluida la identificación y cuantificación de los productos de reacción de los ensayos enzimáticos, utilizamos una batería de técnicas experimentales y herramientas analíticas que incluyen ensayos enzimáticos radiométricos con recuento de centelleo, cromatografía en capa fina con imágenes de fósforo y líquido de ultra alto rendimiento. cromatografía espectrometría de masas en tándem (uHPLC-MS/MS).

Usando CRISPR/Cas9, se introdujo una deleción de 2 nucleótidos en el exón 1 del gen INMT de rata (Fig. 2a), lo que resultó en una mutación de cambio de marco (Fig. 2b) y ausencia de expresión de la proteína INMT en la rata (Fig. 2c) . La presencia o ausencia de expresión de INMT en ratas se confirmó con productos de PCR de cortes de cola y transferencias Western utilizando homogeneizados de tejido pulmonar. La supresión de INMT no dio lugar a anomalías fisiológicas o de comportamiento manifiestas, y las ratas eran reproductivamente viables. Para determinar el impacto de la eliminación de INMT en la actividad enzimática dependiente de triptamina, realizamos ensayos enzimáticos radiométricos utilizando tejidos cerebrales y pulmonares de ratas WT y KO; Se usaron extractos de tejido pulmonar de conejo como control positivo (Fig. 2d). Estos ensayos altamente sensibles se basan en la transferencia de un grupo metilo radiomarcado (C14) de C14-SAM a un sustrato, donde la actividad se mide mediante conteo de centelleo líquido. Los datos indican que la eliminación de INMT de rata no tuvo un impacto detectable en la capacidad de los extractos de cerebro o pulmón para metilar la triptamina.

La metilación enzimática de la triptamina no difiere entre las ratas WT e INMT-KO ( a ) La estructura genética de la INMT de rata con exones representados en recuadros negros. La ubicación y la secuencia del ARN guía de INMT (ARNg) se muestran con un triángulo rojo. (b) La eliminación de 2 pares de bases responsable de generar el KO se muestra debajo de la secuencia de tipo salvaje (WT) con la ubicación del gRNA subrayada. ( c ) Western blot que muestra la presencia de INMT (bandas verdes) en WT, pero no en tejidos de pulmón de rata KO. La imagen original que incluye todos los carriles en el marcador de peso molecular se incluye como Figura complementaria S1. ( d ) Ensayos enzimáticos radiométricos con extractos de tejido de pulmón de conejo, así como cerebro de rata y pulmón de rata de ratas WT e INMT-KO. Cada punto representa el promedio de 3 experimentos por triplicado de un animal individual para conejos (n = 3) y ratas (n = 6) para cada genotipo. Los gráficos muestran promedios con barras de error que indican las desviaciones estándar. CPM: cuentas por minuto. Los extractos de tejido pulmonar de conejo (n = 3) mostraron una actividad dependiente de triptamina > 20 veces mayor que los tejidos de rata (actividad específica promedio [SA] = 322,2 ± 8,81, intervalo de confianza [IC] del 95 % de la media = 300,3–344,0). La actividad dependiente de la triptamina no difirió entre ratas WT y KO en el cerebro (t = 0,30, diferencia media = − 0,36, IC del 95 % = − 3,05–2,33, p = 0,77) o tejidos pulmonares (t = 0,52, diferencia media = − 0,25, IC 95 % = − 1,33–0,84, p = 0,62). En el cerebro, el SA promedio fue 14,68 ± 2,34, IC del 95 % de la media = 12,22–17,13 en WT, y 14,32 ± 1,76, IC del 95 % de la media = 12,47–16,16 en KO. En pulmón, la SA promedio fue 6,36 ± 0,66, IC del 95 % de la media = 5,66–7,05 en WT, y 6,11 ± 0,96, IC del 95 % de la media = 5,10–7,12 en KO. La actividad dependiente de la triptamina fue significativamente mayor en los tejidos cerebrales en relación con el pulmón (t = 8,38, diferencia de medias = 8,32, IC del 95 % = 5,87–10,77, p = 0,0002 para WT y t = 10,04, diferencia de medias = 8,21, IC del 95 % = 6,31–10,11, p < 0,0001 para KO).

Para caracterizar la actividad de metilación de la triptamina de los tejidos cerebrales y pulmonares de ratas WT y KO, primero se utilizó cromatografía de capa fina para evaluar los productos de reacción, y se implementó uHPLC-MS/MS para proporcionar validación y cuantificación adicionales. Con cromatografía de capa fina, los estándares de triptamina, NMT y DMT produjeron valores de factor de retardo (RF) de 0,65, 0,55 y 0,47, respectivamente (Fig. 3, izquierda). Los extractos de las proteínas de fusión glutatión-S-transferasa-INMT de conejo (GST-INMT) expresadas en E. coli (control positivo) produjeron dos manchas distintas que eran isográficas tanto con NMT (RF = 0,53) como con DMT (RF = 0,46). Los tejidos de rata, incluidos el cerebro y el pulmón de las ratas WT y KO, no produjeron manchas isográficas con NMT o DMT, pero sí produjeron dos manchas distintivas con valores de RF de 0,67 (arriba) y 0,37 (abajo). Todas las condiciones en las que se omitió la triptamina no mostraron actividad de metilación detectable.

Los tejidos cerebrales y pulmonares de ratas WT y KO producen productos que no son isográficos con NMT o DMT. Escaneo de imágenes con fósforo de productos de ensayo de enzimas radiométricas usando extractos de tejidos cerebrales y pulmonares de ratas WT y KO después de la separación en placas de gel de sílice usando una fase móvil de N-butanol:ácido acético:agua (12:3:5). Una mezcla estándar (Std) que contenía triptamina, NMT y DMT se separó claramente usando estos métodos de cromatografía (carril más a la izquierda). El escaneo de imágenes de fósforo sin recortar y sin procesar del gráfico se incluye como Figura complementaria S2.

Para el análisis de uHPLC-MS/MS de los productos de reacción de los ensayos de extracto de tejido (Tabla 1), se omitió la triptamina del tejido correspondiente para cada condición para que sirviera como control de fondo para los niveles de NMT.

Se utilizaron extractos de tejido de pulmón de conejo como control positivo y los resultados indican que estos extractos produjeron NMT a un nivel de casi 300 veces el nivel de fondo y DMT a un nivel de (media ± desviación estándar) 0,57 ± 0,18 nM. Esta actividad dependía de la adición de triptamina a la mezcla de reacción. Sin embargo, los tejidos cerebrales y pulmonares de ratas WT y KO no mostraron una producción de NMT o DMT dependiente de triptamina. Estos resultados son consistentes con los hallazgos de la cromatografía de capa fina y confirman que, en estas condiciones de ensayo, las enzimas presentes en el cerebro o los tejidos pulmonares de rata no producen NMT ni DMT.

Se usaron extractos de células de E.coli que expresan proteínas de fusión GST-INMT recombinantes de rata, conejo y humano para la cuantificación radiométrica de la actividad dependiente de triptamina de cada una de estas enzimas (Fig. 4). Estos datos demuestran una actividad robusta dependiente de la triptamina tanto de la INMT de conejo como de la humana e indican que la INMT de rata no es suficiente para la metilación de la triptamina.

Rat INMT no es suficiente para la metilación de triptamina. ( a ) Western blot que muestra la expresión de proteínas de fusión GST-INMT de INMT de rata, conejo y humano en E. coli. El carril de control muestra la expresión de un vector GST vacío, donde INMT está ausente. La imagen sin recortar de la transferencia Western se incluye como Figura complementaria S3. (b) Ensayos enzimáticos radiométricos con extractos de E. coli que expresan proteínas INMT recombinantes de rata, conejo y humano de fusión GST. Los gráficos muestran el promedio de 6 experimentos individuales por condición con barras de error que indican las desviaciones estándar. CPM = cuentas por minuto. El ensayo reveló actividad dependiente de triptamina tanto de INMT de conejo (SA promedio = 350,9 ± 23,08, IC del 95 % de la media = 326,7–375,1) como de INMT humana (SA promedio = 171,8 ± 12,38, IC del 95 % de la media = 158,8–184,8) . La actividad fue significativamente mayor en INMT de conejo en relación con INMT humana (t = 16,75, diferencia de medias = 179,1, IC del 95 % = 154,3–204, p < 0,0001). La actividad de INMT de rata (SA promedio = 0,64 ± 0,21, IC del 95 % de la media = 0,42–0,85) fue significativamente menor (t = 3,68, diferencia de medias = −0,48, IC del 95 % = −0,77 a −0,19, p = 0,004 ) que los extractos de GST de vector vacío (promedio de SA = 1,12 ± 0,24, IC del 95 % de la media = 0,86–1,37).

Para descartar la posibilidad de que un factor inhibitorio dentro de los extractos de E.coli pudiera estar contribuyendo a la falta de actividad enzimática de la INMT de rata, realizamos experimentos idénticos utilizando proteínas INMT recombinantes de rata, conejo y humanos marcadas con Flag expresadas en riñón embrionario humano ( HEK) 293 celdas (Figura complementaria S4). Para determinar si INMT de rata tiene la capacidad de metilar NMT, los ensayos se realizaron utilizando proteínas de fusión GST-INMT y NMT como sustrato, y se observaron resultados similares (Figura complementaria S5). La INMT de rata no mostró actividad enzimática hacia la NMT, pero las INMT de conejo y humana fueron altamente activas.

Se utilizó la cromatografía en capa fina junto con la formación de imágenes con fósforo para identificar los productos de reacción dependientes de triptamina de los ensayos de enzimas recombinantes radiométricas descritos anteriormente. Las soluciones puras de los estándares de triptamina, NMT y DMT sin marcar se separaron claramente usando este sistema de solventes (Fig. 5, izquierda).

Conejo y humano, pero no rata, INMT metilan triptamina para producir NMT y DMT. Escaneo de imágenes con fósforo de productos de ensayo de enzimas radiométricas usando proteínas de fusión GST-INMT recombinantes después de la separación en placas de gel de sílice usando una fase móvil de N-butanol:ácido acético:agua (12:3:5). Una mezcla estándar (Std) que contenía triptamina, NMT y DMT se separó claramente usando estos métodos de cromatografía (carril más a la izquierda). Los estándares mostraron valores de RF respectivos de 0,58, 0,49 y 0,39. La INMT de conejo, la INMT humana y el pulmón de conejo mostraron cada uno dos puntos isográficos con NMT y DMT. Para INMT de conejo, NMT RF = 0,48 DMT RF = 0,41. Para INMT humano, NMT RF = 0,48 y DMT RF = 0,41. Para pulmón de conejo (control positivo), NMT RF = 0,50 y DMT RF = 0,41. Ni las preparaciones de GST de vector vacío ni GST-INMT de rata mostraron productos detectables, lo que indica una falta de actividad de metilación. El escaneo de imágenes de fósforo sin procesar y sin recortar del mismo gráfico se incluye como Figura complementaria S6.

Las proteínas INMT recombinantes de conejo y humano mostraron una fuerte actividad de metilación dependiente de triptamina, mientras que la proteína INMT recombinante de rata no tuvo actividad detectable hacia la triptamina.

Cuando se usó NMT en lugar de triptamina como sustrato, se observaron resultados similares (Figura complementaria S7): INMT de rata no produjo productos metilados, pero INMT de conejo y humanos produjeron DMT, como lo indica la presencia de puntos que fueron isográficos con un DMT estándar de referencia. Además, todas las condiciones en las que se omitió la triptamina (Fig. 5) o NMT (Figura complementaria S7) no mostraron metilación detectable, lo que confirma que las reacciones dependen del sustrato.

La validación de estos hallazgos se llevó a cabo utilizando uHPLC-MS/MS. Para los estudios de INMT recombinante, los extractos de E. coli transformados con GST de vector vacío incubados con triptamina y SAM sirvieron como controles de fondo, y el valor de NMT de esos ensayos se definió como fondo. Estos ensayos mostraron que la producción de NMT y DMT dependiente de triptamina ocurrió solo con INMT de conejo y humano, donde INMT de conejo mostró una producción de NMT> 50 veces mayor que los controles de fondo, y INMT humana> 60 veces mayor (Tabla 2). En contraste con la INMT humana y de conejo, la INMT de rata no mostró una producción detectable de NMT o DMT dependiente de triptamina. Las concentraciones de DMT producida enzimáticamente resultantes de estos ensayos fueron (media ± desviación estándar) 0,23 ± 0,03 y 0,12 ± 0,06 para INMT de conejo y humano respectivamente.

Cuando se usó NMT en lugar de triptamina como sustrato, la producción de DMT se confirmó solo a partir de INMT de conejo y humanos, y la INMT de rata estaba inactiva (Tabla complementaria S1). Para todas las condiciones, la omisión de sustratos de triptamina o NMT resultó en niveles indetectables de productos NMT y DMT. Además de proporcionar una cuantificación precisa de los analitos, estos resultados se corresponden estrechamente con los de los ensayos enzimáticos radiométricos y proporcionan la validación de los resultados de la cromatografía en capa fina.

Presentamos por primera vez la generación de un nuevo modelo de rata transgénica INMT-KO, así como un estudio integral de múltiples especies de INMT en relación con la actividad dependiente de triptamina y la biosíntesis de NMT y DMT. Además, este estudio es el primero en investigar la actividad dependiente de triptamina de INMT de rata recombinante, que es relevante para el campo porque la rata es actualmente la especie modelo para la detección de DMT in vivo en el cerebro. La combinación de técnicas tradicionales (ensayos radiométricos de enzimas y cromatografía de capa fina) y técnicas modernas (ratas INMT-KO desarrolladas con CRISPR/Cas9, comparaciones de INMT recombinantes de múltiples especies y uHPLC-MS/MS) da como resultado una caracterización informativa de la función INMT. , la metilación de triptamina y la biosíntesis de DMT endógena.

El hallazgo principal de esta investigación es que INMT no es necesario para la metilación de triptamina y la biosíntesis de NMT y DMT en tejidos cerebrales o pulmonares de ratas. Usando un ensayo enzimático radiométrico altamente sensible, mostramos que los extractos de tejidos cerebrales y pulmonares de ratas WT y KO muestran niveles iguales de actividad dependiente de triptamina en estas condiciones de ensayo. Al examinar la INMT recombinante expresada en células de E. coli, encontramos que la INMT de rata no muestra actividad dependiente de triptamina, mientras que la INMT humana y de conejo son altamente activas. Esto probablemente se deba al bajo grado de homología de secuencia de INMT entre especies. Aunque las secuencias de INMT de conejo y humano son casi idénticas (89%), la INMT de rata es solo un 57% homóloga con cualquiera de las dos. Juntos, estos resultados demuestran que los tejidos de rata poseen una enzima que muestra actividad de metilación dependiente de triptamina, pero que la enzima responsable no es INMT.

La cromatografía en capa fina junto con la formación de imágenes con fósforo reveló que los productos metilados de tejidos pulmonares de conejo, así como la INMT recombinante humana y de conejo, eran isográficas con NMT y DMT. Sin embargo, la INMT de rata no dio como resultado la biosíntesis de ningún producto metilado detectable, lo que indica que la INMT de rata no cataliza la metilación de la triptamina. Curiosamente, al mismo tiempo que los resultados del ensayo radiométrico, los extractos de tejido de cerebro y pulmón de ratas WT y KO mostraron la misma actividad de metilación de triptamina, produciendo dos puntos distintivos cuando se sometieron a cromatografía en capa fina. Sin embargo, ninguno de estos puntos fue isográfico con NMT o DMT. Estos resultados respaldan la conclusión de que la identidad de la enzima que metila la triptamina no es INMT, y además muestran que los productos de esa reacción enzimática no identificada no son ni NMT ni DMT. Finalmente, los experimentos de uHPLC-MS/MS replicaron y validaron los resultados de la cromatografía de capa fina: pulmón de conejo, así como conejo recombinante y humano (pero no rata) INMT puede producir NMT y DMT en estas condiciones de ensayo, y extractos de tejido de cerebro y pulmón de las ratas WT y KO no producen NMT ni DMT. Tomados en conjunto, junto con el hecho de que DMT ha sido detectado de forma independiente en el cerebro de rata por múltiples grupos6,15,16,17,18, estos resultados sugieren que una ruta biosintética alternativa para NMT y DMT está presente en los tejidos cerebrales y pulmonares de ratas Por lo tanto, es probable que exista una N-metiltransferasa de mamífero distintiva que pueda metilar la triptamina para producir NMT y DMT.

Existe evidencia bioquímica que respalda la posible existencia de múltiples enzimas que modifican la triptamina. El trabajo pionero de Axelrod en 19614 utilizó extractos crudos tomados de tejidos de pulmón de conejo para analizar la actividad de metilación de la triptamina, una práctica relativamente común en la metodología de análisis enzimático. La gran mayoría de los estudios de INMT durante las siguientes tres décadas utilizaron estrategias similares con extractos de tejidos crudos o parcialmente purificados como fuentes de proteínas para los llamados ensayos de INMT. De hecho, a medida que se dispuso de métodos de purificación de proteínas más sofisticados, estudios más recientes tomaron nota de la probable existencia de proteínas distintivas con actividad metilante de triptamina. Utilizando extractos de pulmón de conejo parcialmente purificados, Porta et al. describieron dos proteínas de metilación de triptamina similares a INMT distintivas con cinética enzimática similar, pero puntos isoeléctricos distintivos y pH óptimo23. Además, Ansher y Jakoby identificaron lo que etiquetaron como "metiltransferasa A" y "metiltransferasa B" a partir de extractos purificados de hígado de conejo19. Estas dos formas de INMT mostraron actividad de metilación de triptamina y tenían el mismo peso molecular pero diferían en sus puntos isoeléctricos e interacciones de subestado. Nuestros resultados motivan estudios similares en tejidos de rata y humanos para determinar si están presentes enzimas de metilación de triptamina alternativas.

Es bien sabido que el comportamiento de las enzimas individuales en condiciones in vitro depende en gran medida de una serie de variables experimentales, como el pH, la temperatura, la fuerza iónica, la concentración de los componentes del ensayo, la composición del tampón y las interacciones de varios cofactores o componentes no directamente involucrados en la reacción 24. Por lo tanto, es razonable concluir que en las condiciones in vitro actuales, la metilación de la triptamina para formar NMT y DMT en extractos crudos de cerebro y pulmón de rata no es posible. En cambio, estas condiciones favorecieron la actividad de una enzima alternativa, que contribuyó a la producción de los productos no identificados que se muestran en la Fig. 3. Varios estudios han utilizado enfoques in vivo para demostrar la presencia de DMT endógeno en el cerebro de rata6,15,17, 18,25, destacando la importancia de las condiciones fisiológicas in vivo para la metilación de la triptamina en tejidos cerebrales de rata. Por lo tanto, especulamos que una exploración de condiciones de ensayo alternativas o una detección enzimática más exhaustiva daría como resultado la producción detectable de NMT y DMT en tejidos de rata. Estos estudios serán esenciales para comprender mejor la función, la regulación y las vías biosintéticas de la DMT endógena.

Actualmente se desconoce la identidad de los productos producidos a partir de extractos de cerebro y pulmón de tejidos de ratas WT y KO, pero los candidatos probables para estos compuestos pueden ser las β-carbolinas y sus alcaloides asociados. Las β-carbolinas son una clase abundante de compuestos que sirven como IMAO y se caracterizan por su marco tricíclico de indol fusionado con piridina. Hasta la fecha, se han aislado más de 500 monómeros de alcaloides de β-carbolina tricíclicos de fuentes naturales26. Curiosamente, se sabe desde hace mucho tiempo que la triptamina sirve como reactivo en la biosíntesis de varias β-carbolinas a través de la reacción de Pictet-Spengler, una reacción química que da como resultado la condensación de la triptamina y el posterior cierre del anillo27. Esta reacción puede ocurrir de forma no enzimática o enzimática a través de la enzima estrictosidina sintasa28. Además, se ha demostrado la presencia de múltiples alcaloides de β-carbolina en los tejidos cerebrales de mamíferos, incluidas las ratas29, y otros estudios han informado sobre la posible formación de alcaloides de β-carbolina utilizando ensayos similares al estudio actual30,31. Con este mecanismo en mente, es por lo tanto razonable suponer que las identidades de los productos resultantes de la incubación de tejido cerebral y pulmonar de rata con triptamina pueden ser alcaloides de β-carbolina. Independientemente de las identidades de los productos de reacción desconocidos, la producción enzimática de estos compuestos derivados de la triptamina es claramente independiente de la INMT, lo que indica la existencia de una enzima alternativa que modifica la triptamina en los mamíferos. Una investigación de estos productos y sus respectivas rutas biosintéticas probablemente conducirá a una comprensión más profunda de los metabolitos de triptamina en la fisiología de los mamíferos. La disponibilidad de ratas INMT-KO debería facilitar una mayor comprensión de la función endógena de esta enzima en ratas.

En conclusión, nuestros resultados confirman que los extractos de INMT de conejo, INMT humano y tejido pulmonar de conejo son capaces de metilar la triptamina para formar tanto NMT como DMT. Sin embargo, la INMT de rata y los extractos de tejido de cerebro y pulmón de rata no producen NMT ni DMT en las condiciones actualmente estudiadas. Más bien, los tejidos de rata interactúan con la triptamina para producir productos alternativos y la INMT no es necesaria para esta reacción. Dado que la presencia in vivo de DMT en el cerebro de rata está bien establecida, estos resultados sugieren la posible existencia de una ruta biosintética alternativa para DMT en la fisiología de los mamíferos.

Todos los animales se alojaron en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 que comenzaba a las 7 am y se les proporcionó acceso ad libitum a alimento y agua. El estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan en Ann Arbor, y todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y recomendaciones pertinentes de ese comité. Las ratas INMT-KO se generaron en un fondo F344 utilizando CRISPR/Cas9 en The Transgenic Animal Model Core de la Universidad de Michigan a través de una eliminación de 2 pares de bases en el exón 1 de la secuencia codificante de INMT. En el día 21 después del nacimiento, las crías de rata se destetaron y se recolectaron secciones de colas de 1 mm en tubos estériles para genotipificar utilizando un procedimiento estándar de extracción de ADN, y las ratas se identificaron como WT (INMT + / +), KO (INMT -/-) , o heterocigoto (INMT + /-). Para los ensayos enzimáticos que compararon ratas WT frente a KO, se criaron ratas heterocigotas para producir camadas que contenían ambos genotipos, y se usaron compañeros de camada para las comparaciones de ensayos INMT entre ratas WT y KO. Los criterios de exclusión para las ratas se definieron a priori e incluyeron (1) un genotipo heterocigoto y (2) cualquier anomalía fisiológica o de comportamiento obvia. Por lo tanto, solo se usaron ratas WT y KO en el estudio, y todas las ratas estaban sanas en el momento del sacrificio. Todos los procedimientos cumplieron con las pautas ARRIVE recomendadas.

Se generaron INMT de rata (NM_001109022.1), conejo (NM_001082043.1) y humano (NM_006774.5) mediante PCR utilizando las siguientes secuencias de cebadores: los cebadores sentido y antisentido humanos fueron 5′-AAAAGGATCCATGAAGGGTGGCTTCACTGGG-3′, y 5′-AAAAGAATTCTCAGGGCCCAGGCTTCTTGCG-3′, respectivamente. Los cebadores sentido y antisentido de conejo fueron 5'-AAAAGGATCCATGGAGGGCGGCTTCACGGG-3' y 5'-AAAAGAATTCTCAGGACCCCGGCTTCTTGC-3' respectivamente. Los cebadores de sentido y antisentido de rata fueron 5'-AAAAGGATCCATGGCAGGCAAGGTATACATG-3' y 5'-AAAAGAATTCTCAGGCACTGGGACCCTTTCG-3' respectivamente. Cada uno de los clones se diseñó en vectores de expresión bacterianos pGEX-2TK usando las enzimas de restricción BamH I y EcoR I. Estos vectores contenían genes de glutatión-S-transferasa (GST) que sirven para aumentar la solubilidad y expresión de INMT recombinantes. Los clones se transformaron en BL21 (DE3) (Sigma Aldrich #CMC0015) para expresión en E. coli. Las colonias se inocularon en 25 ml de ampicilina LB a 37 °C durante 15 a 18 h. Luego, las células se recolectaron, se sedimentaron, se descartó el sobrenadante y las células se congelaron a -20 ° C antes de la lisis celular y la diálisis.

Para los extractos de cerebro y pulmón, las ratas (10 semanas de edad) se sacrificaron mediante inhalación de CO2 y se decapitaron. El cerebro y los pulmones completos se extrajeron rápidamente, se cortaron en cubitos y se congelaron inmediatamente en hielo seco en tubos de microcentrífuga. Se obtuvieron tejidos de pulmón de conejo congelados de Pel-Freez Biologicals. Los tejidos congelados (cerebro o pulmón de rata o pulmón de conejo) y gránulos de GST-INMT congelados se resuspendieron en 5 volúmenes de tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 7,9) y se homogeneizaron con tres ráfagas a 6000 rpm. Los homogeneizados se centrifugaron a 100 000 g durante 60 min a 4 °C. Los sobrenadantes se dializaron durante la noche a 4 °C con 100 volúmenes de tampón de fosfato de sodio con 3 cambios de tampón cada 4 h, utilizando kits de diálisis Pur-A-Lyzer Maxi con corte de peso molecular de 12 kDa (Sigma Aldrich). Las concentraciones de proteína de los sobrenadantes dializados se determinaron mediante el ensayo Bradford (Bio-Rad) y las fracciones restantes se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C para los ensayos enzimáticos. Para confirmar la expresión de INMT, todos los extractos de tejido y GST-INMT se analizaron mediante transferencia Western. Se desnaturalizaron 30 µg de cada proteína en solución salina tamponada con fosfato que contenía β-mercaptoetanol y se hirvieron a 100 °C durante 5 min. Las muestras se separaron en geles estándar de SDS-poliacrilamida y se electrotransfirieron a nitrocelulosa. El análisis de transferencia Western se realizó con anticuerpos INMT de rata (policlonal de conejo ordenado a medida de GenScript), tubulina (monoclonal de ratón de Developmental Studies Hybridoma Bank) y GST (monoclonal de ratón de Fisher), seguido de incubación con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo infrarrojo contra conejo. y ratón (Li-COR). Las bandas se detectaron utilizando un escáner infrarrojo Li-COR Odyssey. Las imágenes de Western blot resultantes (Figs. 2 y 4) se presentan como versiones recortadas de los archivos sin procesar. Ver materiales complementarios para imágenes sin recortar.

Las fuentes de proteínas para los ensayos enzimáticos incluyeron extractos de tejido (pulmón de conejo, cerebro de rata, pulmón de rata) y GST-INMT recombinantes (rata, conejo y humano). Los ensayos de enzimas se realizaron en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y contenían aproximadamente 50 µg de proteína (las concentraciones de proteína madre oscilaron entre 4,1 y 6,9 mg/ml para el cerebro de rata, entre 10,6 y 14,6 mg/ml para el pulmón de rata y conejo, y entre 0,75 y 1,05 mg/ml). para GST-INMT recombinantes). Los ensayos enzimáticos radiométricos utilizaron triptamina 4 mM (Sigma Aldrich) o NMT (Cayman Chemical) junto con 2,3 nmol C14-SAM (actividad específica 52,6 mCi/mmol, PerkinElmer Inc.) en un volumen de reacción final de 150 µl con tampón de fosfato de sodio. Los componentes del ensayo se combinaron y se incubaron a 37 °C durante 60 min, y las reacciones se detuvieron añadiendo 1 ml de tampón de borato 0,5 M enfriado con hielo (pH 9,5). Para extraer los productos de reacción, las mezclas de reacción se transfirieron a tubos Falcon de 15 mL con 6 mL de una solución de tolueno:alcohol isoamílico (T:IAA) 97:3 y los tubos se agitaron con vórtex durante tres ráfagas de 5 s cada una y se centrifugaron a 1650 g durante 3 minutos Para la cuantificación, se añadieron 4 ml de la capa orgánica T:IAA a viales de centelleo que contenían 5 ml de cóctel de centelleo (Ultima Gold; PerkinElmer Inc.) y se contó la radiactividad durante 1 min en un contador de centelleo Beckman LS. Los tubos con sustrato (triptamina) omitido sirvieron como controles de fondo. La actividad específica (SA) se calculó restando el CPM promedio de 3 controles de fondo para cada condición y dividiendo el valor de CPM resultante por la cantidad de proteína (µg) utilizada. Los resultados se presentan como promedios de experimentos por triplicado en tejido cerebral y pulmonar para n = 6 ratas por genotipo, y como 6 experimentos repetidos para cada condición GST-INMT. Se llevaron a cabo ensayos no radiactivos para el análisis mediante análisis uHPLC-MS/MS. Estos ensayos utilizaron triptamina 1 mM o NMT con SAM 33 µM en un volumen de reacción final de 150 µL con tampón de fosfato de sodio. Los componentes del ensayo se combinaron y se incubaron a 37 °C durante 60 min. Los tubos con sustrato omitido sirvieron como controles de fondo. Los productos de reacción se extrajeron inmediatamente añadiendo 1 ml de T:IAA y se agitaron. Se transfirieron 950 µl de la fase orgánica a un tubo nuevo de 1,5 ml y se evaporó el disolvente orgánico en un concentrador de sobremesa VacuFuge™ (Eppendorf) a temperatura ambiente durante 2 h. Los productos resultantes se resuspendieron en 1 ml de metanol al 30 %, se sometieron a agitación vorticial durante 3 min y se analizaron mediante uHPLC-MS/MS (consulte a continuación los "Métodos"). Las muestras que tenían NMT como sustrato se diluyeron diez veces más en metanol al 30%. Los ensayos con extractos de tejido se realizaron por duplicado para cada rata (n = 6 por genotipo), y los ensayos con extractos de GST-INMT se realizaron por triplicado para cada condición, con transformaciones GST de vector vacío que sirvieron como controles de fondo. Las identidades de las muestras fueron cegadas por LC para el análisis de uHPLC-MS/MS realizado por NGG

Para el análisis del producto, los ensayos INMT se repitieron para todos los tejidos y GST-INMT recombinantes utilizando los métodos descritos anteriormente para los ensayos enzimáticos radiométricos. Las reacciones se prepararon por cuadruplicado con o sin triptamina en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Para la extracción del producto, se añadió 1 ml de T:IAA a los tubos de reacción inmediatamente después del ensayo. Los tubos se agitaron tres veces con vórtex a intervalos de 5 s y se centrifugaron a 13 000 rpm durante 3 min. Luego, el sobrenadante se transfirió a tubos de microcentrífuga limpios y se evaporó a 50 °C durante la noche en Eppendorf Thermomixer. Los productos resultantes de cuatro repeticiones para cada condición se agruparon utilizando 100 µl de T:IAA. Antes de la detección, las placas de cromatografía en capa fina de gel de sílice se activaron en un horno a 90 °C durante 30 min, y un tanque de revelado de cromatografía en capa fina de vidrio se llenó previamente con 50 ml de fase móvil que consistía en N-butanol, ácido acético y agua (12:3:5). Las placas se mancharon con una mezcla de estándares que incluían 0,5 µg de cada uno de triptamina, NMT y DMT en T:IAA junto con 50 µL de productos de reacción de ensayo de enzima combinados, todos manchados con una separación de 1,0 cm. La placa se colocó en el tanque de revelado durante aproximadamente 2 h, luego se retiró y se dejó secar al aire durante 1 h. Los estándares de triptamina, NMT y DMT (visibles bajo luz ultravioleta), así como los orígenes del producto y los frentes de solventes se cubrieron con una mezcla diluida de C14-SAM para permitir que estas ubicaciones fueran visibles con imágenes de fósforo. Para el desarrollo, la placa se envolvió en film plástico y se almacenó en una pantalla de fósforo (Molecular Dynamics) durante 72 h. La imagen de la pantalla se realizó utilizando un Amersham Typhoon Phosphorimager con sensibilidad de tubo fotomultiplicador a 1000v, velocidad de exploración normal y tamaño de píxel de 100 µm. Las imágenes resultantes (Figs. 3 y 5) se recortaron para excluir las líneas de manchas y los frentes de solventes, y se modificaron globalmente con el software de imágenes Amersham Typhoon para mejorar la visibilidad de los productos de reacción. Las imágenes sin procesar, sin recortar y sin procesar se proporcionan en los materiales complementarios. Los valores del factor de retardo (RF) se determinaron dividiendo la distancia de migración del soluto por la distancia de migración del frente del solvente.

Aunque los ensayos radiométricos son muy sensibles en su capacidad para detectar niveles extremadamente bajos de actividad enzimática, no proporcionan información sobre la identidad de los productos de reacción. La cromatografía en capa fina es útil para la visualización de una variedad de productos de reacción, pero la técnica a menudo carece de resolución. Sin embargo, uHPLC-MS/MS proporciona un alto nivel de sensibilidad y resolución en la identificación de analitos y representa un estándar de oro para la separación, detección y cuantificación de analitos. Además, nuestro método uHPLC-MS/MS utiliza múltiples técnicas para confirmar definitivamente la identificación del analito, incluido el tiempo de retención a través de uHPLC, monitoreo de reacciones múltiples de triple cuadrupolo de iones precursores y productos, y estándares de referencia internos deuterados enriquecidos para NMT y DMT.

Para determinar las concentraciones de NMT y DMT, se enriquecieron 10 µL de la resuspensión de metanol al 30 % (consulte la sección "Ensayos enzimáticos") con 10 µL de una mezcla que contenía 100 nM de d3-NMT y d6-DMT (Toronto Research Chemicals) como deuterados. estándares internos para normalizar la eficiencia de extracción y la eficiencia de ionización por espectrometría de masas. Las soluciones de calibración de NMT y DMT se prepararon en metanol al 30 % para crear un rango de calibración de 0,625 a 125 nM para NMT y de 0,125 a 25 nM para DMT. Los estándares de calibración se enriquecieron con la solución de estándar interno como se describe anteriormente y se inyectaron antes de cada día de análisis. Las curvas de calibración de 6 puntos se determinaron en función de la relación del área del pico del estándar de calibración al estándar interno mediante regresión lineal. Todas las muestras y estándares se analizaron utilizando una columna de cromatografía Phenomenex Kinetex C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 μm, 100 Å) en un uHPLC Vanquish (Thermo Fisher Scientific, Gemering, Alemania) conectado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ Quantum Ultra (Thermo Fisher Scientific, San José, CA). La fase móvil A era formiato de amonio 10 mM con ácido fórmico al 0,15% (v/v) en agua. La fase móvil B era acetonitrilo. El gradiente utilizado fue el siguiente: inicial, 5% B; 0,01 min, 19% B; 0,68 min, 26% B, 1,05 min, 75% B; 1,8 min, 100% B; 2,2 min, 100% B; 2,3 min, 5% B; 3,0 min, 5% B a 600 μL/min. El volumen de inyección de la muestra fue de 7,5 µL, el muestreador automático se mantuvo a temperatura ambiente y la columna se mantuvo a 30 °C en modo de aire quieto. NMT eluyó a los 0,92 min y DMT a los 0,96 min. Se utilizó ionización por electropulverización en modo positivo a 4 kV. La temperatura del capilar fue de 325 °C, la temperatura del vaporizador fue de 300 °C, la presión del gas envolvente fue de 50 y la presión del gas auxiliar fue de 10. Los iones se detectaron en el modo de espectrometría de masas en tándem. Los parámetros de exploración para los 4 analitos fueron los siguientes. NMT: ion precursor m/z = 175, ion producto m/z = 143,8, energía de colisión = 14, lente de tubo = 53. d3-NMT: ion precursor m/z = 178, ion producto m/z = 143,8, energía de colisión = 14, lente de tubo = 65. DMT: ion precursor m/z = 189,1, ion de producto m/z = 144,1, energía de colisión = 19, lente de tubo = 49. d6-DMT: ion precursor m/z = 195,1, ion de producto m/z = 144,1, energía de colisión = 19, lente de tubo = 49. La integración de picos automatizada se realizó con el software XCalibur 3.0 MS y todos los picos se inspeccionaron visualmente para garantizar una integración adecuada.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 9.4.1 (La Jolla, CA). Para los ensayos de enzimas radiométricas, todos los datos mostraron una distribución normal confirmada mediante la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Se usaron pruebas t de dos colas, paramétricas, no pareadas con la corrección de Welch para todas las comparaciones estadísticas. En el texto, se informan los valores de p, las medias ± desviaciones estándar, las medias de las diferencias, los intervalos de confianza (IC) del 95 % y los valores de t. α = 0,05 para todas las pruebas.

Los datos y los reactivos estarán disponibles previa solicitud razonable del autor correspondiente (JB).

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Este trabajo fue apoyado por el departamento de Fisiología Molecular e Integrativa, la subvención MCube (a JB, MMW y YK), una subvención del Center for Consciousness Science (a JB) de la Universidad de Michigan, y una subvención de PharmaDrug Inc. (a JB). Agradecemos al Dr. Brian Shay, que asesoró sobre las técnicas de uHPLC-MS/MS, a Gregg Sobocinski, que apoyó los estudios de imágenes con fósforo, así como al Dr. Steven Barker, que compartió información y consejos valiosos sobre la metodología experimental y la interpretación de los resultados. MMW fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Grant NS099160 y VA grant BX003824. RTK fue compatible con NIH RF1NS128522.

Estos autores contribuyeron por igual: Nicolas G. Glynos y Lily Carter.

Departamento de Fisiología Molecular e Integrativa, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.

Nicolás G. Glynos, Lily Carter, Michael M. Wang y Jimo Borjigin

Centro Psicodélico de Michigan, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.

Nicolás G. Glynos, George A. Mashour y Jimo Borjigin

Departamento de Neurología, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.

Soo Jung Lee, Michael M. Wang y Jimo Borjigin

Asuntos de Veteranos Ann Arbor Healthcare System, Ann Arbor, MI, EE. UU.

Soo Jung Lee y Michael M. Wang

Departamento de Química, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.

Youngsoo Kim y Robert T.Kennedy

Departamento de Anestesiología, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.

Jorge A. Mashour

Programa de posgrado en neurociencia, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EE. UU.

George A. Mashour, Michael M. Wang y Song Borjigin

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JB concibió la idea del estudio y dirigió los experimentos. LC y NGG realizaron experimentos y analizaron datos con la ayuda de JBSJL El trabajo de proteínas recombinantes fue dirigido y respaldado por SJL y MMW El desarrollo y análisis del método uHPLC-MS/MS fue respaldado por YK y RTK La generación de ratas INMT-KO fue respaldada por GAM Finalmente, NGG escribió el manuscrito con la ayuda de JB y LC

Correspondencia a Jimo Borjigin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Glynos, NG, Carter, L., Lee, SJ et al. La indoletilamina N-metiltransferasa (INMT) no es esencial para la actividad de metilación endógena dependiente de triptamina en ratas. Informe científico 13, 280 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27538-y

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Recibido: 26 Septiembre 2022

Aceptado: 04 enero 2023

Publicado: 06 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27538-y

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