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Jun 17, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 10263 (2022) Citar este artículo

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El creciente número de trazadores de tomografía por emisión de positrones (PET) que se están desarrollando para ayudar al desarrollo de fármacos y crear nuevos diagnósticos ha llevado a una mayor necesidad de desarrollo y optimización de la radiosíntesis. Los instrumentos de radiosíntesis actuales están diseñados para producir lotes clínicos a gran escala y, a menudo, se limitan a realizar una sola síntesis antes de que deban descontaminarse esperando la descomposición del radionúclido, seguido de una limpieza a fondo o eliminación de los componentes del sintetizador. Aunque con algunos radiosintetizadores es posible realizar algunas radiosíntesis secuenciales en un día, ninguno permite radiosíntesis paralelas. El rendimiento de uno o unos pocos experimentos por día no es adecuado para experimentos de optimización rápida. Para combatir estas limitaciones, aprovechamos las ventajas de la radioquímica de gotas para crear una nueva plataforma para la experimentación de alto rendimiento en radioquímica. Este sistema contiene una serie de 4 calentadores, cada uno de los cuales se utiliza para calentar un conjunto de 16 reacciones en un pequeño chip, lo que permite 64 reacciones paralelas para optimizar rápidamente las condiciones en cualquier etapa de un proceso de radiosíntesis de varios pasos. Como ejemplos, estudiamos las síntesis de varios radiofármacos marcados con 18F ([18F]Flumazenil, [18F]PBR06, [18F]Fallypride y [18F]FEPPA), realizando más de 800 experimentos para explorar la influencia de parámetros que incluyen el tipo de base, cantidad de base, cantidad de precursor, solvente, temperatura de reacción y tiempo de reacción. Los experimentos se llevaron a cabo en solo 15 días de experimento, y el pequeño volumen (~ 10 μL en comparación con la escala de ~ 1 mL de los instrumentos convencionales) consumió ~ 100 veces menos precursor por punto de datos. Este nuevo método allana el camino para estudios de optimización más completos en radioquímica y acorta sustancialmente los plazos de desarrollo de trazadores de PET.

El campo de la imagenología molecular ha creado la tomografía por emisión de positrones (PET) y la tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT)1 para la visualización y cuantificación de procesos bioquímicos en sujetos vivos. El uso de moléculas biológicamente activas marcadas con radionúclidos de vida corta permite realizar dichas imágenes de manera no invasiva a nivel de todo el cuerpo. La PET se utiliza en una amplia gama de investigaciones en animales pequeños y humanos para ayudar a comprender las vías de la enfermedad2,3, medir la farmacocinética, confirmar los efectos biológicos de nuevos compuestos terapéuticos4,5, monitorear la progresión de la enfermedad o monitorear la respuesta al tratamiento6,7,8 . Los radioisótopos comunes utilizados en PET incluyen C-11 (t1/2 = 20,4 min), F-18 (t1/2 = 109,8 min) y Ga-68 (t1/2 = 67,7 min), entre otros.

Los radiofármacos normalmente se preparan utilizando sintetizadores automáticos para limitar la exposición a la radiación del personal y mejorar la reproducibilidad9. La preparación de un lote de un radiofármaco es costosa debido al alto costo del radiosintetizador, la protección contra la radiación, los reactivos, el radioisótopo y el personal calificado. Estos costos se multiplican enormemente para los estudios de optimización, que requieren que se realicen muchas síntesis en diferentes condiciones. Además, la mayoría de los radiosintetizadores están diseñados para solo una o unas pocas radiosíntesis consecutivas por día, por lo que los estudios de optimización pueden llevar semanas o meses, lo que aumenta aún más el costo de la mano de obra, el uso de recursos y el costo de los radioisótopos.

Recientemente, se han descrito múltiples enfoques para mejorar significativamente el rendimiento de los experimentos de radioquímica. Zhang et al. realizó reacciones sin radiactividad pero imitó las concentraciones ultrabajas asociadas con los radionúclidos y aprovechó la alta sensibilidad del análisis LC-MS/MS para evaluar el rendimiento del producto10. Si bien evitar el uso de radiactividad aumentó el rendimiento de los experimentos, la dependencia de los volúmenes de reacción convencionales aún consumía una cantidad significativa de tiempo y reactivos para obtener cada punto de datos. Como alternativa, las plataformas de microfluidos y las técnicas de radioquímica miniaturizada brindan vías prometedoras para aumentar el rendimiento y minimizar el consumo de reactivos11,12,13,14 tomando prestados conceptos de la experimentación de alto rendimiento en química orgánica15,16,17. Varios grupos han demostrado que se pueden realizar secuencialmente docenas de reacciones radioquímicas a pequeña escala (es decir, decenas de µL cada una, en comparación con los ~ 0,5–2,0 mL que se usan en configuraciones convencionales) usando plataformas de reactores capilares de química de flujo con productos crudos recolectados y analizados fuera de línea18 ,19,20,21. Si bien los parámetros como la temperatura y las velocidades de flujo de los reactivos se pueden estudiar fácilmente con un alto rendimiento, otros, como el solvente de reacción o las condiciones para el secado/activación del fluoruro [18F], no pueden. Otra plataforma de optimización usó un chip microfluídico de polidimetilsiloxano (PDMS) para preparar lotes ultrapequeños (~ 100 nL cada uno) para la detección de condiciones de radiomarcaje de proteínas acuosas, pero se limitó a proporciones de reactivos y pH variables22,23.

Las reacciones basadas en viales de pequeño volumen también se han utilizado para la optimización24 y permiten estudiar una gama más amplia de parámetros. Recientemente, Laube et al. informó el uso de bloques calefactores de viales múltiples para realizar hasta ~ 50 radiofluoraciones por día, cada una de las cuales implica el secado de una pequeña alícuota de fluoruro [18F] eluido de un cartucho QMA, seguido de una reacción en la escala de 25–50 µL25. Mientras demostraba paralelismo y bajo consumo de reactivos, esta técnica requería un manejo manual significativo de los viales, incluida la instalación y extracción de las tapas de los viales. Además, es bien sabido que es esencial tener en cuenta las características de calentamiento detalladas del sistema26, y después de la optimización en viales pequeños, es posible que las condiciones deban adaptarse a un sintetizador convencional para la producción automatizada de rutina.

Nuestro grupo fue pionero recientemente en una plataforma de microfluidos, en la que las reacciones se realizan a una escala aún más pequeña (es decir, 1–10 µL) en gotas confinadas en trampas de tensión superficial modeladas en una superficie27. En estas condiciones, las reacciones de gotas suelen tener rendimientos comparables a los métodos convencionales, pero permiten un tiempo de síntesis más corto y hasta ~ 100 veces menos de consumo de reactivo por reacción28,29,30. De particular interés, después de la optimización en condiciones de baja actividad, se puede lograr una producción a mayor escala (p. ej., una o unas pocas dosis clínicas) en condiciones idénticas utilizando un radiosintetizador automático basado en gotas31,32 mediante un simple aumento de la actividad inicial. Para aumentar el rendimiento, creamos chips con múltiples sitios de reacción para realizar hasta 16 síntesis basadas en gotas en paralelo, todas con la misma temperatura y tiempo de reacción, pero con volúmenes o concentraciones de reactivos variables33. Un estudio preliminar mostró la posibilidad de optimizar varios parámetros en la síntesis de [18F]Fallypride, incluida la cantidad de base, la concentración de precursores y el volumen de reacción de las gotas. En este documento, el rendimiento y la flexibilidad aumentan aún más mediante la introducción de una matriz de 4 calentadores independientes, lo que permite el funcionamiento de 4 chips en paralelo. Esta plataforma mejorada permite la exploración paralela de variables de reacción adicionales (temperatura y tiempo de reacción) que no pueden estudiarse convenientemente con un solo chip a la vez.

Se realizaron matrices de reacciones en formato de gota en "chips" de silicio recubiertos de teflón de 25,0 × 27,5 mm2 (Fig. 1A). Cada reacción se confinó a un sitio hidrofílico circular de 3 mm de diámetro (hecho eliminando el recubrimiento de teflón) que actúa como una trampa de tensión superficial. Los detalles de la fabricación del chip se han informado previamente33.

Aparato de reacción de alto rendimiento. (A) Fotografía del chip de reacción múltiple. (B) Modelo CAD que muestra los componentes de la plataforma. (C) Vista de la sección transversal de la plataforma de calentadores múltiples que muestra el camino del enfriamiento por aire forzado. (D) Fotografía de la plataforma (desde arriba) con chips de reacción múltiple instalados.

Se operaron múltiples chips en paralelo utilizando una plataforma de cuatro calentadores hecha a la medida (Fig. 1B-D). Para proporcionar protección contra la radiación, la plataforma funcionaba dentro de una celda caliente, pero el sistema de control podía colocarse en el exterior para minimizar el espacio ocupado. La plataforma constaba de cuatro calentadores cerámicos de 25 x 25 mm2 pegados con epoxi sobre un marco de aislamiento térmico mecanizado por CNC a partir de un compuesto de silicato de calcio, que a su vez se fijó sobre una pieza de nailon impresa en 3D para dirigir el aire de refrigeración a cada calentador desde un conjunto de cuatro ventiladores de 36 mm y 12 V CC (Sección complementaria 1). Se realizaron simulaciones térmicas para determinar un espaciado de calentador adecuado para evitar la diafonía térmica de los calentadores vecinos (Sección complementaria 2). Los chips se adhirieron a los calentadores con una fina capa de pasta térmica.

Cada calentador (y ventilador) se controló de forma independiente, lo que permitió que el conjunto de reacciones en cada chip de reacción múltiple se realizara a una temperatura o duración única (Sección complementaria 1). Para cada calentador, la señal del termopar tipo K integrado se amplificó y se conectó a una entrada analógica de un módulo de adquisición de datos (DAQ). Los calentadores se alimentaron con 120 V CA conmutados por un relé de estado sólido controlado por una salida digital del DAQ mediante un controlador de encendido y apagado implementado en LabView (National Instruments). Después del tiempo de calentamiento deseado, se activó el enfriamiento por aire forzado usando una salida digital del DAQ para alimentar el ventilador correspondiente a través de un circuito controlador Darlington.

Después de calibrar los calentadores (Sección complementaria 3), se evaluó la estabilidad de la temperatura mediante el control del termopar integrado con respecto al tiempo (Figura complementaria S6). En cada punto de ajuste probado, el calentamiento tomó solo ~ 5 s, y la temperatura exhibió una fluctuación de < 1 ° C una vez estabilizada (Tabla complementaria S1). El enfriamiento con aire forzado a 30 °C tomó ~ 3 min desde 140 °C, ~ 2,5 min desde 100 °C y ~ 1,2 min desde 50 °C. Además, la distribución espacial de la temperatura de cada calentador se visualizó a través de imágenes térmicas. Todos los calentadores exhibieron una temperatura superficial uniforme (Figuras complementarias S7, S8 y Tabla S2), excepto cerca de los bordes (donde se observó una desviación> 2% de la media). En todos los casos, la extensión de esta región inutilizable se limitó a < 1,5 mm en cada borde del calentador. Por lo tanto, los chips de reacción múltiple se diseñaron con un límite no utilizado de 2,4 mm, lo que garantiza que los 16 sitios de reacción estuvieran completamente ubicados dentro de la parte uniforme de la superficie del calentador (Figura complementaria S9)33. Un estudio anterior confirmó la consistencia de las reacciones en diferentes sitios del chip y el grado insignificante de contaminación cruzada de un sitio a otro33.

Con la plataforma, se podrían realizar hasta 64 síntesis radioquímicas en paralelo, cada reacción usando ~ 100 veces menos reactivos que los enfoques convencionales. Debido a que todos los pasos, incluido el secado con fluoruro [18F], se realizan en el chip, las condiciones utilizadas en cualquier parte de la síntesis se pueden explorar con un alto rendimiento.

Usamos esta nueva plataforma para realizar estudios extensos de la síntesis de varios trazadores PET clínicamente relevantes: [18F] Flumazenil [18F] FMZ), [18F] PBR06, [18F] Fallypride y [18F] FEPPA.

Para cada radiofármaco, se realizó un extenso conjunto de experimentos para comparar la influencia de diferentes condiciones de reacción relacionadas con el secado con fluoruro [18F] y la reacción de radiofluoración. Nuestros objetivos eran comprender mejor la influencia de varios parámetros de reacción y desarrollar protocolos de síntesis a microescala eficientes para estos trazadores. Las condiciones iniciales de reacción de las gotas se determinaron esencialmente mediante la reducción de volúmenes ~ 100 veces de los protocolos de macroescala convencionales. En general, los experimentos se realizaron en lotes de 64 reacciones simultáneas (4 chips × 16 reacciones cada uno), explorando 16 condiciones diferentes, cada una con n = 4 repeticiones.

La figura 2 ilustra el esquema de síntesis de cada trazador y el proceso generalizado para un conjunto de 16 reacciones. En cada sitio, se agrega una gota de 8 μL de solución madre de fluoruro [18F] (fluoruro [18F] mezclado con la cantidad deseada y el tipo de base y catalizador de transferencia de fase) al sitio de reacción y se seca. (Aunque también se pudieron estudiar los parámetros de secado para eliminar el agua residual, el secado se realizó durante 1 min a 105 °C en todos los experimentos). A continuación, 8 µL de solución precursora (6 µL para [18F]Fallypride) con la concentración y reacción deseadas se añade disolvente al residuo seco y se hace reaccionar a temperatura elevada durante el tiempo deseado. El volumen de reacción también podría estudiarse como parámetro, pero no se exploró aquí. Una vez completada la reacción, se recoge el producto bruto. Aunque los parámetros de recolección podrían optimizarse para minimizar la actividad residual en el chip, realizamos la recolección del producto en todos los casos dispensando 10 μL de solución de recolección en el sitio de reacción, aspirando el volumen y repitiendo estos pasos 4 veces para un total de 40 μL de solución recolectada. producto crudo. El rendimiento de la reacción se determinó midiendo tanto la conversión de [18F]fluoruro en producto a través de radio-TLC, como la actividad recuperada de cada reacción (en comparación con la actividad inicial, es decir, la eficiencia de recolección) para determinar un rendimiento radioquímico bruto total (RCY ). El análisis de TLC se realizó utilizando métodos de múltiples carriles recientemente informados con 8 muestras por placa34.

Proceso de optimización. (A) Esquema para la radiosíntesis de [18F]Flumazenil. (B) Síntesis de [18F]PBR06. (C) Síntesis de [18F]Fallypride. (D) Síntesis de [18F]FEPPA. (E) Procedimiento experimental para realizar radiosíntesis paralelas utilizando un chip de microgotas de reacción múltiple (4 × 4). Las concentraciones, los solventes y los volúmenes pueden variar de un sitio a otro, y la temperatura y el tiempo de calentamiento pueden variar de un chip a otro. (F) Procedimiento para el análisis del rendimiento de la reacción. Las actividades de las muestras crudas recolectadas se miden usando un calibrador de dosis y se comparan con la actividad inicial para determinar la eficiencia de recolección. La actividad residual en el chip se analiza a través de imágenes de Cerenkov. Las muestras crudas se analizan mediante radio-TLC para determinar la eficiencia de la fluoración.

[18F]Flumazenil se utiliza para cuantificar los cambios en la densidad de los receptores GABAA asociados con la enfermedad de Alzheimer, la esquizofrenia, la plasticidad neuronal y los procesos sensoriales35. Nos enfocamos en la ruta del precursor de nitromazenil comercialmente disponible18,36,37,38,39,40, para el cual los rendimientos aislados informados están en el rango de 8 a 30%36,37,38,39,40. Aunque otras rutas de síntesis han llevado a mayores rendimientos, no se siguieron aquí debido a la falta de disponibilidad comercial del precursor del tosilato de diaryliodonio41 o la muy baja actividad molar (0,37 GBq/µmol [0,01 Ci/µmol]) del método de intercambio isotópico42 . Los estudios de optimización anteriores que utilizan enfoques de macroescala y química de flujo (Tabla 1) generalmente han comparado solo un par de valores para los parámetros estudiados y, a menudo, con pocas o ninguna réplica18,36,37,38,39,40. Aprovechando el mayor rendimiento de nuestra plataforma, realizamos una serie de experimentos para explorar rangos más completos de cada parámetro con una granularidad más fina (normalmente, 8 valores cada uno) y más repeticiones. Los parámetros explorados incluyeron: (i) temperatura de reacción, (ii) cantidad de base, (iii) cantidad de precursor, (iv) tiempo de reacción, (v) solvente de reacción y (vi) tipo de base y catalizador de transferencia de fase. Los detalles completos y los resultados de cada conjunto de experimentos se pueden encontrar en la sección complementaria. 2. Dado que la mayoría de la literatura informó el uso de los solventes N,N-dimetilformamida (DMF) y dimetilsulfóxido (DMSO)18,38, los estudios que realizamos para los parámetros i – iv se realizaron utilizando cada uno de estos solventes. Como ejemplo de cómo se configuró cada experimento, la Fig. 3 muestra cómo se usaron cuatro chips para explorar la temperatura de reacción. La figura también muestra las imágenes de radiactividad residual en los chips después de la síntesis y las imágenes de Cerenkov de las placas de TLC utilizadas para evaluar la conversión. Los cálculos de rendimiento resultantes para cada condición se tabulan en la Tabla complementaria S3 y el rendimiento se representa en la Fig. 4A. La eficiencia de fluoración aumentó fuertemente con la temperatura. Sin embargo, a diferencia de otras reacciones basadas en gotas, las pérdidas volátiles durante la reacción de fluoración, así como la actividad residual adherida al chip después de la recolección, llevaron a una disminución de la eficiencia de recolección con el aumento de la temperatura. (En general, la cantidad de pérdida volátil dominó y fue de 15 a 10 veces mayor que la pérdida residual). El crudo RCY resultante exhibió un comportamiento máximo con un máximo de 13,5 ± 0,6 (n = 4) a 200 °C (con DMF ). De acuerdo con estas tendencias, Wong et al. encontró que la temperatura de un reactor de flujo es un factor esencial con un aumento de la eficiencia de fluoración de ~ 0 % a 120 °C a ~ 20 % a 160 °C usando DMF como solvente, y de ~ 0 % a ~ 5 % usando DMSO18. Mandap et al., usando un reactor de microondas, también encontraron que la eficiencia de la fluoración aumentaba sustancialmente con la temperatura hasta un valor máximo y luego disminuía un poco a temperaturas más altas38.

Configuración experimental para un lote de experimentos que exploraron la influencia de la temperatura de reacción (8 valores) y el solvente (2 tipos) para la síntesis de [18F]Flumazenil. (A) Asignación de 64 sitios de reacción. La mitad de los sitios de reacción se usaron primero para explorar 4 temperaturas diferentes en el primer conjunto de 32 reacciones simultáneas. Luego, la otra mitad de los sitios se utilizaron para las 4 temperaturas restantes. (B) Las imágenes de Cerenkov muestran la distribución de la actividad residual en cada chip después de recolectar los productos crudos. La señal de radiactividad se corrige por desintegración a un punto de tiempo común para todas las imágenes. La reacción marcada con una "X" no se analizó (por error, la gota precursora no se agregó al sitio de reacción). (C) Imágenes de Cerenkov de placas de TLC desarrolladas (cada una con 8 muestras) para reacciones que utilizaron DMSO como disolvente de reacción. (D) Muestras crudas separadas usando DMF como solvente de reacción. Los círculos discontinuos indican los ROI utilizados para el análisis. La flecha roja discontinua indica la dirección del movimiento del solvente durante el desarrollo. Las líneas punteadas blancas representan el límite de cada placa multimuestra.

Influencia de los parámetros de reacción en el rendimiento de la radiosíntesis de microgotas de [18F]Flumazenil. Para cada parámetro, la influencia en la eficiencia de fluoración, la eficiencia de recolección y el RCY crudo se representan gráficamente de forma individual. (A) Efecto de la temperatura (y del disolvente). Cantidad de precursor: 280 nmol. Volumen de reacción: 8 µL. Cantidad base: 480 nmol. Tiempo de reacción: 2 min. (B) Efecto de la cantidad de base (y disolvente). Cantidad de precursor: 280 nmol. Volumen de reacción: 8 µL. Temperatura de reacción: 200 °C. Tiempo de reacción: 2 min. (C) Efecto de la concentración de precursor (y disolvente). Volumen de reacción: 8 µL. Cantidad base: 240 nmol. Tiempo de reacción: 2 min. Temperatura de reacción 200 °C. (D) Efecto del tiempo de reacción (y disolvente). Cantidad de precursor: 280 nmol. Volumen de reacción: 8 µL. Cantidad base: 240 nmol. Temperatura de reacción: 200 °C. (E) Efecto del disolvente de reacción. Cantidad de precursor: 280 nmol. Volumen de reacción: 8 µL. Cantidad base: 240 nmol. Temperatura de reacción: 200 °C. Tiempo de reacción: 0,5 min. (F) Efecto del tipo de base (y solvente). Cantidad de precursor: 280 nmol. Volumen de reacción: 8 µL. Cantidad base: 240 nmol. Temperatura de reacción: 200 °C. Tiempo de reacción: 0,5 min.

Debemos señalar que, por lo general, solo se informa la eficiencia de la radiofluoración (determinada por radio-HPLC o radio-TLC) y/o el rendimiento radioquímico en los experimentos de optimización, lo que dificulta hacer comparaciones detalladas con las reacciones de gotas. Informar solo sobre la eficiencia de la radiofluoración puede ser engañoso, ya que no se tienen en cuenta muchas pérdidas potenciales (p. ej., pérdidas volátiles o actividad residual atrapada en viales o tubos, que pueden ser significativas43). Informar solo el rendimiento radioquímico da cuenta de las pérdidas, pero todas las pérdidas (de varios pasos de síntesis o purificación) se agrupan. Se han informado discrepancias significativas entre la conversión radioquímica y el rendimiento radioquímico para [18F]Flumazenil36,37,39. Por ejemplo, Vaulina et al. observó una eficiencia de fluoración (TLC) del 25 %, pero obtuvo solo un rendimiento aislado del 2 % después de la purificación por HPLC y la formulación SPE, o del 9 % después de la purificación/formulación basada en SPE36. Masaweh et al. encontró que a pesar de una eficiencia de fluoración (TLC) de 27 a 35 %, el rendimiento aislado fue solo de 2 a 5 % 40, aunque mejoró a 15 a 20 % después de la optimización de la fase móvil39. Si bien estas discrepancias pueden reflejar grandes pérdidas durante el paso de purificación/formulación36, estos informes no contienen suficientes detalles o datos para descartar otras pérdidas (p. ej., actividad residual en el recipiente de reacción o tubería, pérdidas volátiles, etc.)

La temperatura se fijó a 200 °C para experimentos posteriores. Con el aumento de la cantidad de base (Fig. 4B), observamos que la eficiencia de fluoración aumenta desde casi cero y se estabiliza en un valor máximo cuando la cantidad de base alcanza ~ 150–200 nmol. La eficiencia de recolección exhibió un comportamiento inverso, y el RCY crudo general para DMF (el solvente de mayor rendimiento) exhibió un fuerte aumento y luego se estabilizó a partir de ~ 160 nmol de base. Se seleccionó 240 nmol (donde el RCY crudo fue solo marginalmente más bajo) como la cantidad óptima para proporcionar robustez contra errores de pipeteo. El estudio de la cantidad creciente de precursor (Fig. 4C) mostró aumentos rápidos hasta ~ 80 nmol y luego una meseta, para la eficiencia de fluoración, la eficiencia de recolección y el RCY crudo. El RCY crudo más alto (con DMF, el solvente de mayor rendimiento) se produjo en una cantidad de precursor de 280 nmol, que se seleccionó como la condición óptima. El fuerte impacto de la cantidad de precursor por debajo de la meseta es consistente con Mandap et al., quienes informaron una baja eficiencia de fluoración (< 3 %, n = 1) para 1 mg de precursor en DMF a 160 °C y valores altos (~ 30 % ) con 2–8 mg de precursor. Ryzhikov et al. también encontraron marcadas diferencias en la eficiencia de la fluoración en comparaciones por pares de cantidades de precursores40. Desafortunadamente, el volumen de reacción se da como un rango en ambos documentos, lo que hace imposible comparar los valores de concentración. En muchas reacciones, la proporción de base a precursor es un parámetro relevante y, por lo tanto, representamos gráficamente el rendimiento de la reacción en función de esta proporción en la sección complementaria. 5.4. Las proporciones en el rango ~ 1–3 dieron el RCY crudo más alto, con una caída rápida para valores de proporción más bajos y una caída gradual para valores más altos. Al explorar el aumento del tiempo de reacción (Fig. 4D), la eficiencia de fluoración exhibió un aumento gradual y la eficiencia de recolección exhibió una tendencia inversa (principalmente debido a la pérdida de actividad volátil). El RCY crudo resultante en DMF (el solvente de mejor rendimiento) exhibió una disminución con el tiempo, con un máximo de 15,4 ± 0,9 % (n = 4) para una reacción de 0,5 min. Aunque el tiempo de reacción no se ha estudiado extensamente en la literatura, parece que tiempos más largos mejoran el rendimiento de la síntesis en reactores cerrados. Ryzhikov et al. observaron un aumento en la eficiencia de fluoración del 39% (n = 1) al 80% (n = 1) al aumentar el tiempo de 15 a 30 min40.

Teniendo en cuenta las altas pérdidas volátiles a altas temperaturas y los tiempos de reacción más prolongados, exploramos solventes de reacción de alto punto de ebullición adicionales (Fig. 4E), que incluyen N-metil-2-pirrolidona (NMP), 1,3-dimetil-3,4,5 ,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinona (DMPU) y etilenglicol, que se han utilizado en otras radiosíntesis44,45. La eficiencia de la fluoración y el RCY crudo mejoraron significativamente usando NMP en comparación con DMF. Como prueba final, comparamos la influencia del tipo de base y catalizador de transferencia de fase (Fig. 4F) en los solventes de reacción DMF, DMSO y NMP. La mejor combinación fue NMP con TBAHCO3; se observó un rendimiento mucho menor con K222/K2CO3 y K222/Cs2CO3. Las condiciones optimizadas (solvente de reacción de NMP, 240 nmol de base (TBAHCO3) y 280 nmol de precursor en una gota de 8 µL a 200 °C durante 0,5 min) dieron como resultado una eficiencia de fluoración de 37,5 ± 0,8 (n = 4), una eficiencia de recolección de 51 ± 1 (n = 4) y RCY crudo de 19,1 ± 0,6% (n = 4). La purificación a través de HPLC analítica (Sección complementaria 9.1 o un lote que tenía un RCY crudo de 18,0 % dio un rendimiento aislado de 11,6 % (n = 1). La optimización adicional de la purificación puede conducir a mejoras modestas, pero no se investigó. En particular, la la síntesis basada en gotas podría lograr rendimientos aislados útiles que están solo ligeramente por debajo de los rendimientos aislados informados por otros (Tabla complementaria S11) al tiempo que ofrece múltiples ventajas, incluida la finalización en solo ~ 35 min (20 min para la síntesis y la purificación por HPLC, con un estimado ~ 15 min necesarios para la formulación46) en lugar de 55–80 min 38,39,40, y 100 veces menor consumo de precursor38,39,40.

Para demostrar la versatilidad del enfoque de alto rendimiento, luego usamos la plataforma para realizar una optimización de la radiosíntesis de [18F]PBR06. Este trazador detecta la activación microglial dirigiéndose a la proteína translocadora (TSPO) y se usa para monitorear la respuesta al tratamiento en la enfermedad de Huntington47, obtener imágenes de la neuroinflamación y monitorear la progresión del tumor48. Usando el precursor de tosilato disponible comercialmente para la radiosíntesis, se han informado en la literatura rendimientos aislados de [18F]PBR06 en el rango de 30 a 60%48,49; sin embargo, hasta donde sabemos, no se han informado estudios sobre la influencia de diferentes condiciones de reacción en el rendimiento de la radiosíntesis.

Los detalles completos de todos los parámetros que exploramos (cantidad de precursor, cantidad de base, temperatura, tiempo de reacción y tipo de catalizador de transferencia de fase/base) se incluyen en la sección complementaria. 6. De manera similar a [18F]Flumazenil, los estudios de cada parámetro se realizaron en los siguientes dos solventes de reacción diferentes: DMSO (comúnmente informado en la literatura48,49) y una mezcla 1:1 (v/v) de alcohol texílico y MeCN ( utilizado en radiofluoraciones alifáticas de otros precursores de tosilato33). En el estudio de la cantidad de precursor (Fig. 5A), las reacciones en el solvente mixto mostraron una eficiencia de fluoración que aumentaba rápidamente con el aumento de la cantidad de precursor, alcanzando una meseta de ~ 100 % a ~ 100–200 nmol de precursor, y la eficiencia de recolección fue consistentemente alto. El RCY bruto resultante aumentó rápidamente a medida que aumentaba la cantidad de precursor, alcanzando una meseta de 91 ± 4 % (n = 4) a 160 nmol de precursor. Curiosamente, para las reacciones realizadas en DMSO, las tendencias fueron similares para cantidades de precursor por debajo de ~ 100–200 nmol de precursor, pero para cantidades de precursor más altas, la eficiencia de fluoración, la eficiencia de recolección y el RCY crudo mostraron una disminución gradual a moderada en lugar de estabilizarse. Aún así, el RCY crudo máximo usando DMSO (86 ± 6%, n = 4) fue similar al obtenido usando el solvente mixto.

Influencia de los parámetros de reacción en el rendimiento de la radiosíntesis de microgotas de [18F]PBR06. Para cada parámetro, la influencia en la eficiencia de fluoración, la eficiencia de recolección y el RCY crudo se representan gráficamente de forma individual. (A) Efecto de la concentración de precursor (y disolvente). Volumen de reacción: 8 µL. Cantidad base: 240 nmol. Tiempo de reacción: 5 min. Temperatura de reacción 100 °C. (B) Efecto de la cantidad de base (y disolvente). Cantidad de precursor: 160 nmol. Volumen de reacción: 8 µL. Temperatura de reacción: 100 °C. Tiempo de reacción: 5 min. (C) Efecto de la temperatura (y del disolvente). Cantidad de precursor: 160 nmol. Volumen de reacción: 8 µL. Cantidad base: 240 nmol. Tiempo de reacción: 5 min. (D) Efecto del tiempo de reacción (y disolvente). Cantidad de precursor: 160 nmol. Volumen de reacción: 8 µL. Cantidad base: 240 nmol. Temperatura de reacción: 100 °C. (E) Efecto del tipo base. Cantidad de precursor: 160 nmol. Volumen de reacción: 8 µL. Cantidad base: 240 nmol. Temperatura de reacción: 100 °C. Tiempo de reacción: 0,5 min.

En los estudios de cantidad de base (Fig. 5B), la eficiencia de fluoración, la eficiencia de recolección y el RCY crudo no se vieron afectados relativamente, mostrando solo reducciones modestas cuando la cantidad de base era inferior a ~ 150 nmol. El RCY crudo fue máximo a 240 nmol de base. En el estudio de la temperatura de reacción (Fig. 5C), la eficiencia de fluoración fue relativamente independiente de la temperatura cuando se utilizó el disolvente de reacción mixto. Al usar DMSO, la fluoración fue más alta entre 90 y 130 °C. La eficiencia de recolección fue consistentemente alta en todas las temperaturas (y para ambos solventes), y el RCY crudo reflejó la eficiencia de fluoración. Se seleccionó una temperatura de 100 °C. El tiempo de reacción (Fig. 5D) casi no tuvo impacto, con RCY crudo alto en todos los casos excepto para DMSO a 0,5 min, donde el RCY crudo fue sustancialmente más bajo. Finalmente, no encontramos ninguna diferencia significativa cuando se usa TBAHCO3 en comparación con el catalizador de transferencia de fase K222/K2CO3 típicamente informado cuando se usa el solvente mixto; sin embargo, cuando se usó DMSO como solvente de reacción, la eficiencia de fluoración y el RCY crudo fueron ligeramente inferiores cuando se usó K222/K2CO3 en comparación con TBAHCO3 (Fig. 5E). Los resultados para DMSO fueron más bajos en general debido al tiempo de reacción subóptimo utilizado en esta comparación.

En general, las condiciones óptimas (240 nmol de TBAHCO3, 160 nmol de precursor en 8 µL de alcohol texílico: MeCN (1:1 v/v), 100 °C, 0,5 min) dieron una eficiencia de fluoración de 97,4 ± 0,2 % (n = 4) y RCY crudo de 94 ± 2% (n = 4). En comparación con los métodos convencionales (Tabla complementaria S18), nuestras condiciones óptimas fueron significativamente más rápidas (0,5 frente a 15 min de tiempo de reacción)48 y más suaves (100 frente a 140 °C)48. Realizamos la purificación mediante radio-HPLC a escala analítica (Sección complementaria 9.2) y obtuvo un rendimiento aislado del 75,8 % (n = 1). Aunque no realizamos la formulación para determinar el RCY general, esto se compara favorablemente con los valores RCY generales (30–60 %) informados en la literatura48,49, consumidos 10–30 × menos precursor48,49, y fue un proceso de síntesis más breve (~ 35 min, es decir, 20 min para la síntesis y la purificación por HPLC, más unos ~ 15 min estimados necesarios para la formulación46), en comparación con los 50 min informados en la literatura49.

[18F]Fallypride se utiliza para estudiar enfermedades asociadas con el sistema dopaminérgico, como las enfermedades de Parkinson, Huntington y Alzheimer50,51. Previamente, realizamos un estudio preliminar de la síntesis de gotas de [18F]Fallypride a partir del precursor de tosilato explorando el impacto de la cantidad de base, la cantidad de precursor y el volumen de reacción33. Sin embargo, con un solo calentador operando un solo chip, la temperatura y el tiempo de reacción no se podían estudiar previamente de manera conveniente. Utilizando las capacidades ampliadas de la plataforma de calentadores múltiples descrita aquí, estudiamos el impacto de la temperatura y el tiempo de reacción en combinación con la concentración de precursores. Los detalles completos se encuentran en la sección complementaria. 7. En función del aumento de la concentración de precursores, la eficiencia de fluoración y el RCY crudo exhiben un rápido aumento desde casi cero y alcanzan una meseta, mientras que la eficiencia de recolección es constantemente alta (Figura complementaria S41). Sorprendentemente, se observó un comportamiento casi idéntico para las temperaturas de reacción de 95, 110 y 125 °C; pero a 80 ° C era evidente que se necesitaba una concentración de precursor más alta para lograr la máxima eficiencia de fluoración y RCY crudo (Figura complementaria S41A). El RCY bruto máximo se produjo a 110 °C y 39 mM de precursor. Al examinar el efecto combinado de la concentración de precursores y el tiempo de reacción (Figura complementaria S41B), el impacto del tiempo de reacción fue casi insignificante y solo generó diferencias perceptibles cuando la concentración de precursores estaba por debajo de ~ 20 mM. El RCY bruto más alto (93 ± 5 %, n = 2) se obtuvo al ejecutar la reacción a 110 °C durante 1,0 min, 240 nmol de TBAHCO3 y 39 mM de precursor en 6 µL de alcohol texílico: MeCN (1:1 v /v). Después de la purificación por HPLC analítica (Sección complementaria 9.3), el rendimiento aislado fue del 74% (n = 1). La capacidad de realizar un estudio cinético como este en un conjunto de experimentos simultáneos es una ventaja significativa en comparación con la larga serie típica de estudios secuenciales con instrumentos convencionales o sistemas de química de flujo de microfluidos52,53,54. Es probable que este enfoque también proporcione tiempos y temperaturas de reacción más confiables que cuando se enfría y abre repetidamente una sola reacción para extraer muestras en diferentes puntos de tiempo55.

Como ejemplo final, realizamos una optimización muy limitada de la síntesis de [18F]FEPPA, un radiofármaco que se ha utilizado en varios entornos preclínicos y clínicos en los últimos años56,57,58,59,60 para observar la sobreexpresión de TSPO, que se sabe que está asociado con una variedad de trastornos neurodegenerativos. Con la ayuda de la plataforma de alto rendimiento para explorar la influencia de la temperatura (Sección complementaria 8), traducimos la síntesis en formato de gota para aprovechar las ventajas de las reacciones de pequeño volumen. Comenzamos con condiciones similares a los estudios de gotas anteriores para otros trazadores que utilizan precursores de tosilato. Dado que los informes de la literatura incluyen un rango de concentración de precursor de 9 a 45 mM56,57,58,61, elegimos un valor inicial de 30 mM. En función del aumento de la temperatura (Figura complementaria S44), la eficiencia de la fluoración fue ~ 10 % a 60 °C y aumentó considerablemente para alcanzar una meseta después de 90 °C. La eficiencia de recolección fue consistentemente alta a todas las temperaturas, y el RCY crudo resultante mostró una tendencia similar a la eficiencia de fluoración. El RCY bruto más alto (77 ± 2 %, n = 4) se observó a una temperatura de 110 °C durante 2,0 min, precursor 30 mM en 8 µL de alcohol texílico: MeCN (1:1 v/v) disolvente y 240 nmol de base (TBAHCO3). En comparación con los métodos de la literatura (Tabla complementaria S22), el tiempo de reacción es más corto (2 min frente a 10 min56,57,58,61), la reacción de gotas consume 40–50 veces menos precursor y la síntesis general es más corta y tiene un mayor rendimiento56 ,57,58,61. Se purificó un lote mediante HPLC a escala analítica (Sección complementaria 9.4) y la fracción recolectada se diluyó (1:3, v/v) con NaHCO3 9 mM para producir una solución isotónica apropiada para inyección que contenía 440 MBq [12 mCi], suficiente para múltiples estudios preclínicos. La síntesis general de 30 min tuvo un RCY del 67 % (n = 1).

Los experimentos de optimización en este trabajo se realizaron con ~ 14 MBq [0,38 mCi], donde cada reacción a menudo produjo suficiente producto para múltiples escaneos de ratones62,63. Sin embargo, queríamos explorar si uno de los compuestos optimizados ([18F]PBR06) podría escalarse a niveles clínicamente relevantes sin cambiar ninguna condición de reacción que no sea la cantidad de radiactividad inicial. Anteriormente informamos que es posible una ampliación significativa de [18F]Fallypride (7,2 GBq demostrados)31, así como de O-2-[18F]fluoroetil-L-tirosina ([18F]FET) y [18F]Florbetaben (hasta 0,8 GBq demostrados para cada uno)32. Los experimentos con actividad inicial creciente hasta 3,2 GBq (86 mCi) se describen en la sección complementaria. 10. Si bien el RCY crudo mostró una ligera reducción a medida que aumentaba la actividad inicial debido a una disminución en la eficiencia de la fluoración, las cantidades finales después de la purificación y la formulación aún serían suficientes para varias dosis clínicas.

Estos resultados refuerzan la capacidad de optimizar las reacciones a pequeña escala de manera de alto rendimiento utilizando la plataforma descrita aquí y luego aumentan la actividad inicial para aumentar la producción de una radiosíntesis de gotas. De hecho, la actividad inicial en sí podría variarse como parámetro de reacción y estudiarse con un alto rendimiento utilizando la plataforma descrita en este documento. Actualmente se están realizando estudios en nuestro laboratorio para explorar con más detalle cómo la ampliación influye en el rendimiento.

Con la plataforma presentada aquí para realizar radiosíntesis paralelas en formato de gota, pudimos estudiar de manera rápida y conveniente la influencia de varios parámetros de reacción para obtener un mapa detallado de las condiciones que influyen en el rendimiento de la síntesis. Cada síntesis radiofarmacéutica podría investigarse exhaustivamente (cientos de puntos de datos) en unos pocos días, requiriendo solo unos pocos lotes de radioisótopo. En total, para los cuatro compuestos de ejemplo, se completaron 820 experimentos en 15 días de experimento, con un promedio de 55 reacciones por día. Si bien el número máximo de experimentos completados en un solo día fue 64, probablemente sea factible aumentar este número a ~ 96. El factor limitante es la tediosa adición manual de reactivos, la recolección de productos crudos y la realización de análisis TLC. Actualmente se está desarrollando una plataforma automatizada para la experimentación de alto rendimiento, que podría abordar estos problemas y tal vez aumentar aún más el rendimiento de la reacción al tiempo que reduce la exposición a la radiación y la posibilidad de error humano64. Realizar muchas reacciones por día ahorra tiempo total (y, por lo tanto, mano de obra y otros costos) para la optimización y requiere muchos menos lotes de radioisótopos, lo que reduce significativamente la producción de radioisótopos y/o los costos de compra y envío. Es importante destacar que, dado que la variación diaria, como la calidad de los radioisótopos o la preparación de los reactivos, a veces también puede afectar los resultados65, la reducción del número total de días experimentales (y los lotes de radioisótopos) también reduce los efectos de confusión de esta variabilidad. Además, al usar reacciones de gotas a pequeña escala (es decir, 6–8 µL) en comparación con reactores convencionales (0,5–2,0 mL), el uso de reactivos por punto de datos se redujo en ~ 10-100x. La cantidad total de precursor consumido fue solo de 30 mg para 355 puntos de datos para [18F]Flumazenil, 20 mg para 296 puntos de datos para [18F]PBR06, 6 mg para 128 puntos de datos para [18F]Flypride y 4 mg para 32 puntos de datos puntos para [18F]FEPPA. Estas cantidades equivalen a solo 12 reacciones a macroescala para [18F]Flumazenil (5 mg cada una), 6–7 para [18F]PBR06 (3 mg cada una), 3 para [18F]Fallypride (2 mg cada una) y una para [ 18F]FEPPA. Además, la cantidad de actividad del producto en algunos casos es suficiente para estudios de imágenes in vivo in vitro o preclínicos. Esto podría ser una gran ventaja para el desarrollo de nuevos radiotrazadores donde el precursor es escaso. La plataforma de gotas permite la posibilidad de realizar tanto la optimización como los estudios biológicos preliminares iniciales en el menor tiempo posible utilizando solo unos pocos mg de precursor.

Además de los radiosintetizadores convencionales, también se han realizado optimizaciones rápidas y económicas utilizando plataformas microfluídicas de flujo continuo. Se hacen reaccionar secuencialmente pequeños bolos de reactivos (10s de µL) bajo diferentes condiciones20,66 (se han reportado hasta 25 experimentos por día67). Si bien es conveniente para estudiar la influencia del tiempo de residencia, las concentraciones y proporciones de los reactivos (a través de cambios en las tasas de flujo relativas) y la temperatura de reacción, variar otras condiciones (por ejemplo, solvente) es engorroso y requiere intervención manual y procedimientos de limpieza para cada cambio. Además, algunos aspectos (p. ej., las condiciones de secado del fluoruro [18F]) no se pueden explorar de forma intensiva, ya que se realizan fuera del flujo de trabajo de la química de flujo. Los reactores de gotas son adecuados para estudiar todas estas variables y pueden realizar reacciones en paralelo en lugar de secuencialmente. Una ventaja adicional de la optimización mediante reacciones de gotas es que la plataforma de calentadores múltiples es compacta (120 × 120 × 100 mm3), lo que permite operar en una pequeña parte de una celda caliente o mini celda. Su bajo peso (~ 900 g) hace que el sistema sea portátil y fácil de mover dentro y fuera de una celda caliente y ocupa espacio solo cuando se necesitan esfuerzos de optimización. Por el contrario, los radiosintetizadores convencionales y los sistemas de química de flujo suelen ser mucho más grandes y están integrados en la infraestructura (gases, vacío) y no se pueden mover fácilmente.

Una característica única del sistema abierto de microgotas es la conveniencia de visualizar y cuantificar la distribución de radiactividad en la superficie del chip a través de imágenes de Cerenkov en diferentes etapas del proceso de síntesis. Esta información permite una evaluación más completa del rendimiento de cada paso. Si bien algunos sistemas a macroescala incluyen detectores de radiación cerca de los recipientes y cartuchos de reacción que permiten realizar mediciones de actividad sencillas en estos componentes para ayudar a identificar pérdidas43, otros sistemas requieren quitar/desmontar componentes para realizar mediciones de actividad, lo que puede ser inviable o inconveniente y aumenta la exposición a la radiación. En comparación, estos datos se pueden recopilar fácilmente en paralelo para muchas reacciones a la vez en nuestro enfoque de alto rendimiento, ahorrando mucho tiempo, reduciendo la exposición a la radiación y reduciendo la posibilidad de errores.

Por otro lado, una limitación de este enfoque es que el formato de gota abierta tuvo pérdidas volátiles significativas para algunas síntesis. Si bien las pérdidas volátiles fueron muy bajas para [18F]PBR06, [18F]Fallypride y [18F]FEPPA en formato de gota (así como muchos otros trazadores28,46,68), las pérdidas fueron significativas para [18F]Flumazenil y se encontró que ocurrir durante el paso de radiofluoración. Por el contrario, en los sistemas a macroescala, el reactor suele estar cerrado durante la reacción y, en general, es probable que las pérdidas durante este paso sean menores. Por supuesto, tanto los sistemas de gotas como los sistemas convencionales pueden exhibir pérdidas volátiles en otras etapas del proceso de radiosíntesis, como durante las etapas de evaporación del solvente. A pesar de la pérdida volátil, aún se pueden realizar experimentos significativos y repetibles. Además, el rendimiento aislado de [18F]Flumazenil (que tuvo una pérdida sustancial de volátiles) estuvo solo ligeramente por debajo del rango de rendimientos aislados (antes de la formulación) informados por otros, lo que sugiere que la pérdida de especies volátiles no fue muy perjudicial para el rendimiento general de la reacción. , o quizás que la pérdida de reacción se compensó con otras mejoras (p. ej., quizás el uso de una columna de HPLC analítica en lugar de semipreparativa redujo el grado de pérdida por purificación). Por supuesto, las pérdidas volátiles presentan un peligro que debe mitigarse mediante la operación del sistema dentro de una celda caliente apropiada.

Si bien los estudios aquí se realizaron utilizando un método de una variable a la vez (OVAT), se pueden lograr mejoras adicionales en la eficiencia de la optimización mediante la integración de conceptos como el diseño de experimentos (DoE)65 y el modelado de reacciones. Además de las reacciones optimizadas aquí, el formato de gota es compatible con otros radiofármacos marcados con 18F28,29,46,69. Es probable que se pueda usar con otros isótopos, incluidos los radiometales. Aunque está diseñada para operar en un laboratorio de radioquímica, la plataforma también podría utilizarse para la optimización económica de reactivos de una amplia gama de reacciones químicas fuera del campo de la radioquímica. Recientemente, se informaron varias plataformas y técnicas nuevas para realizar el cribado de reacciones orgánicas en volúmenes de 1,5 a 100 µL15,16, y nuestra plataforma podría proporcionar una capacidad mejorada para variar las temperaturas y los tiempos de reacción para diferentes reacciones simultáneas.

En este trabajo, hemos desarrollado una plataforma para la optimización de la radiosíntesis que se basa en matrices de reacción basadas en gotas que permiten realizar muchas reacciones (hasta 64) en paralelo, cada una con un consumo mínimo de reactivos. Combinado con métodos de análisis de alto rendimiento34, es práctico realizar cientos de experimentos en cuestión de días. Si bien el rendimiento es similar a los métodos de optimización basados ​​en la química de flujo70, esta plataforma permite realizar estudios de todas las etapas del proceso de síntesis, incluido el secado/activación del fluoruro [18F], y se ha demostrado en trabajos anteriores que los chips también son compatibles con la optimización. de reacciones que tienen al menos 2 pasos sintéticos29,46. También permite que las cantidades de reactivo y solvente de reacción se varíen fácilmente sin las limitaciones de los sistemas basados ​​en flujo. Finalmente, las cantidades de productos se pueden escalar después de la optimización variando la actividad inicial.

Como ejemplos, usamos la plataforma para realizar la optimización rápida de la producción de [18F]Flumazenil, [18F]PBR06, [18F]Fallypride y [18F]FEPPA a partir de sus precursores disponibles comercialmente. Usando la plataforma, se realizó una serie de síntesis usando diferentes condiciones (85 para [18F]Flumazenil, 74 para [18F]PBR06, 64 para [18F]Fallypride y 8 para [18F]FEPPA), que abarcan 6 parámetros de reacción diferentes. . Se realizaron estudios repetidos para cada condición y la pequeña desviación estándar calculada para cada conjunto de réplicas indicó que la plataforma tiene una alta reproducibilidad. Para [18F]Flumazenil, las tendencias observadas fueron comparables a los estudios de optimización realizados con radiosintetizadores convencionales. Para otros trazadores hay datos de optimización limitados en la literatura.

Esta plataforma trae convenientemente el poder y la eficiencia de la experimentación de alto rendimiento al campo de la radioquímica. Podría encontrar uso en: (i) refinamiento rápido y optimización de protocolos de radiosíntesis para radiofármacos nuevos o existentes, (ii) traducción de protocolos de macroescala conocidos en formato de gota, y (iii) estudios de métodos de marcaje novedosos. La plataforma de alto rendimiento permite la exploración de muchas más condiciones de reacción dentro del espacio de parámetros disponible, lo que potencialmente puede conducir al descubrimiento de condiciones de reacción favorables que de otro modo no se podrían intentar con los métodos convencionales debido al tiempo, el costo y el bajo rendimiento. La pequeña cantidad de precursor requerida para cada reacción es una ventaja crucial, particularmente en las primeras etapas del desarrollo de nuevos radiofármacos, donde puede estar disponible solo una pequeña cantidad del material de partida; la plataforma de alto rendimiento permite el desarrollo de síntesis en un corto plazo a bajo costo.

N,N-dimetilformamida anhidra (DMF, 99,8 %) comprada a Fisher Scientific, sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO, ≥ 99,9 %), acetonitrilo anhidro (MeCN, 99,8 %), 2,3-dimetil-2-butanol (alcohol texílico, 98 %), 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano (K222, 98 %), trietilamina (TEA, 99 %), ácido trifluoroacético (TFA, > 99 %), tetrahidroflurano (THF, > 99,9 %, sin inhibidores), hexanos (95 %), diclorometano (DCM, > 99,8 %), acetona (99,5 %), formiato de amonio (NH4HCO2: 97 %) N-metil- 2-pirrolidona (NMP, 99,5 % anhidra), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinona (DMPU, 98 %), etilenglicol (99,8 %) y carbonato de potasio ( K2CO3, 99,995%) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El n-butanol (nBuOH, 99 %) se adquirió de Alfa Aesar (Ward Hill, MA, EE. UU.). Bicarbonato de tetrabutilamonio (TBAHCO3, 75 mM en etanol), etil-5-metil-8-nitro-6-oxo-5,6-dihidro-4H-benzo[f]imidazo[1,5-a][1,4] diazepina-3-carboxilato (nitromazenil; precursor de [18F]Flumazenil, > 97 %) y flumazenil (estándar de referencia, > 99 %), 2-((2,5-dimetoxibencil)(2-fenoxifenil)amino)-2- oxoetil-4-metilbencenosulfonato (precursor de [18F]PBR06, > 95 %), 2-fluoro-N-(2-metoxi-5-metoxibencil)-N-(2-fenoxifenil)acetamida (estándar de referencia para [18F]PBR06, > 95 %), (S)-2,3-dimetoxi-5-[3-[[4-metilfenil)-sulfonil]oxi]-propil]-N-[[1-(2-propenil)-2-pirrolidinilo ]metil]benzamida (precursor de [18F]Fallypride, > 90 %), Fallypride (estándar de referencia, > 95 %), 2-(2-((N-4-fenoxipiridin-3-il)acetamido)metil)fenoxi)etilo -4-metilbencenosulfonato (precursor de [18F]FEPPA, > 90 %), y N-[[2-(2-fluoroetoxi)fenil]metil]-N-(4-fenoxipiridin-3-il)acetamida (estándar de referencia para [ 18F]FEPPA, > 95 %) se adquirieron de ABX Advanced Biochemical Compounds (Radeberg, Alemania). El agua DI se obtuvo de un sistema de purificación de agua Milli-Q (EMD Millipore Corporation, Berlín, Alemania). El fluoruro de [18F] sin portador añadido en [18O]H2O se obtuvo de UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility y Crump Cyclotron Facility.

La solución Teflon AF 2400 al 1 % se adquirió de Chemours. La fotoprotección positiva (MEGAPOSIT SPR 220–7.0) y el revelador (MEGAPOSIT MF-26A) se adquirieron de MicroChem (Westborough, EE. UU.). Disolventes y productos químicos adicionales utilizados para la fabricación de chips de microfluidos, incluidos metanol (MeOH, grado LP para salas limpias), acetona (grado LP para salas limpias), isopropanol (IPA, grado LP para salas limpias), ácido sulfúrico (96 %, grado MB para salas limpias) y peróxido de hidrógeno ( 30%, grado LP para sala limpia), se adquirieron de KMG Chemicals (Fort Worth, EE. UU.).

Las siguientes soluciones madre se prepararon diariamente para llevar a cabo reacciones de gotas. La solución madre de fluoruro [18F] contenía TBAHCO3 60 mM y 1,8 MBq/μL (48 μCi/μL) de fluoruro [18F] en agua (es decir, para [18F]Flumazenil, [18F]PBR06, [18F]Flypride y [ 18F]FEPPA), o 60 mM de K222 con 30 mM de K2CO3 y 1,8 MBq/μL (48 μCi/μL) de [18F]fluoruro en agua (es decir, para [18F]Flumazenil y [18F]PBR06), o 60 mM de K222 con 30 mM de Cs2CO3 y 1,8 MBq/μL (48 μCi/μL) de [18F]fluoruro en agua (es decir, para [18F]Flumazenil). La solución madre de precursor de [18F]flumazenil contenía precursor 70 mM en DMSO, DMF, NMP, DMPU o etilenglicol. La solución madre de precursor de [18F]PBR06 contenía precursor 70 mM en DMSO o en una mezcla 1:1 v/v de alcohol texílico y MeCN. La solución madre de [18F]Fallypride contenía 77 mM de precursor en una mezcla 1:1 v/v de alcohol texílico y MeCN. La solución madre de [18F]FEPPA contenía 30 mM de precursor en una mezcla 1:1 v/v de alcohol texílico y MeCN. Para [18F]Flumazenil, la solución madre de recolección era una mezcla 2:1 v/v de solvente de reacción y agua cuando se usaba DMSO o DMF como solvente de reacción, o una mezcla 9:1 v/v de MeOH y solución madre de recolección de H2O. cuando se utiliza NMP, DMPU o etilenglicol como disolvente de reacción. Para [18F]PBR06, [18F]Fallypride y [18F]FEPPA, la solución madre de recolección fue una mezcla 9:1 v/v de MeOH y H2O.

Las mediciones de radiactividad se realizaron utilizando un calibrador de dosis calibrado (CRC-25R, Capintec, Florham Park, NJ, EE. UU.). Para calcular la actividad inicial en cada sitio de reacción, medimos la actividad en el chip después de cargar la solución de fluoruro [18F] inicial en cada punto individual (a través del calibrador de dosis) y restamos la medición anterior de la actividad del chip. Todas las medidas fueron corregidas por descomposición a un punto de tiempo común. La eficiencia de recolección se determinó dividiendo la actividad de la muestra cruda recolectada de un punto individual por la actividad inicial utilizada en ese mismo sitio de reacción (corregida por descomposición). La eficiencia de la fluoración se analizó usando radio-TLC. El rendimiento radioquímico crudo (RCY crudo) se calculó multiplicando la eficiencia de recolección por la eficiencia de fluoración. La actividad residual total que quedaba en el chip se midió colocando el chip en un calibrador de dosis después de recoger los productos crudos de cada sitio de reacción. Para calcular la actividad residual que queda en el chip en cada sitio de reacción individual, primero se determinó la distribución de la actividad en los chips a través de imágenes de Cerenkov33,68,71. Para las imágenes de Cerenkov, se colocó un portaobjetos de microscopio de vidrio (76,2 mm × 50,8 mm, 1 mm de espesor; C&A Scientific; Manassas, VA, EE. UU.) encima del chip y el tiempo de adquisición fue de 5 min. Las imágenes sin procesar se corrigieron como se describió anteriormente34. La actividad residual para un sitio de reacción particular en el chip se calculó con la ayuda de un software de análisis personalizado de región de interés (ROI) escrito en MATLAB (MathWorks, Natick, MA). Para cada sitio de reacción, se dibujó un ROI y se calculó la señal integrada de Cerenkov a partir de la imagen. Para cuantificar la cantidad de actividad residual en un sitio de reacción en particular, la señal integrada de ROI correspondiente se dividió por la suma de la señal integrada para todos los ROI y se multiplicó por la radiactividad residual total medida en el chip. Luego, este valor podría expresarse como una fracción de la radiactividad inicial dividiendo la actividad residual para un sitio de reacción en particular por la actividad inicial utilizada en ese sitio de reacción en particular (corrigiendo la descomposición).

Realizar 64 reacciones simultáneas presenta un desafío importante para el análisis. Los métodos típicos de detección de una muestra por placa de TLC para las longitudes y condiciones de las placas de TLC utilizadas normalmente requieren de 2 a 7 minutos por separación y lectura de muestra y no se pueden escalar prácticamente a 64 muestras. Para acelerar el análisis, se detectaron placas de TLC (gel de sílice 60 F254; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) con múltiples muestras (8 muestras con un paso de 0,5 mm), con todas las muestras separadas en paralelo y leídas simultáneamente a través de imágenes de Cerenkov utilizando métodos que han informado previamente34. Brevemente, se colocaron 8 muestras (0,5 μl cada una) en una placa de TLC de 50 mm × 60 mm (ancho x largo), con puntos adyacentes separados por 5 mm. Las placas de TLC reveladas se leyeron cubriendo la placa de TLC con una placa de centelleo (50 mm × 35 mm, 1 mm de espesor, BC-400, Saint-Gobain, OH, EE. UU.) o un portaobjetos de microscopio de vidrio (76,2 mm × 50,8 mm, 1 mm de espesor, A&C Scientific) para obtener imágenes de la luz emitida. El frente de disolvente tardó ~ 2 min en recorrer 45 mm (correspondiente a una distancia de separación de 30 mm). La fase móvil para separar la muestra cruda de [18F]Flumazenil fue 100% MeCN, para muestras crudas de [18F]PBR06 13:10:24:54 (v/v) diclorometano:cloroformo:acetona:hexanos como fase móvil, para [ Las muestras crudas de 18F]FEPPA 25,6:37,5:36,5:0,4 (v/v) nBuOH:THF:hexanos:TEA como fase móvil, y las muestras crudas de [18F]Fallypride se separaron usando MeCN al 60 % en HN4HCO2 25 mM con TEA al 1 %. (v/v), como se informó previamente33. Se puede encontrar más información sobre los valores de Rf y los estudios de separación de TLC en la sección complementaria. 4.

Se utilizó radio-HPLC analítica para identificar el producto de cada síntesis (mediante coinyección con estándar de referencia) y para aislar productos puros para confirmar el valor de Rf de las bandas del producto en radio-TLC. La configuración del sistema de radio-HPLC comprendía un sistema Smartline HPLC (Knauer, Berlín, Alemania) equipado con un desgasificador (Modelo 5050), bomba (Modelo 1000), detector UV (254 nm; Eckert & Ziegler, Berlín, Alemania) y gamma- detector de radiación y contador (B-FC-4100 y BFC-1000; Bioscan, Inc., Poway, CA, EE. UU.). Todas las separaciones de HPLC utilizaron una columna C18 Gemini (Kinetex, 250 × 4,6 mm, 5 µm, Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.). Utilizando una fase móvil de H2O:MeCN 3:1 con TFA al 0,1 % (v/v) y un caudal de 1,0 ml/min, el tiempo de retención de [18F]Flumazenil fue de 11 min. Para [18F]PBR06, el tiempo de retención fue de 8 min utilizando una fase móvil de 60:40 (v/v) MeCN:tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH = 5,8) con un caudal de 1,5 ml/min. Las muestras de [18F]Flypride se separaron con una fase móvil de MeCN al 60 % en HN4HCO2 25 mM con TEA al 1 % (v/v) y un caudal de 1,5 ml/min, lo que dio como resultado un tiempo de retención de 4,5 min. Las muestras de [18F]FEPPA se separaron con una fase móvil de H2O:EtOH 70:30 v/v con H3PO4 al 0,1 % a 0,8 ml/min, lo que dio un tiempo de retención de 15,5 min.

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Descargar referencias

Los autores agradecen a Roger Slavik, Giuseppe Carlucci y al personal de la Instalación de Ciclotrones Biomédicos Ahmanson de UCLA por proporcionar generosamente fluoruro [18F] para muchos de estos estudios. También agradecemos a Jeffrey Collins por producir el fluoruro [18F] para nuestros estudios posteriores. Los sustratos de microfluidos se produjeron en la sala limpia de nanosistemas integrados (ISNC) de UCLA y agradecemos al personal por el soporte técnico. Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional del Cáncer (R21 CA212718 y R33 CA240201), el Instituto Nacional de Salud Mental (R44 MH097271), el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (R21 EB024243 y T32 EB002101), y por la UCLA Beca Eugene Cota Robles (a AR).

Programa de Postgrado Interdepartamental de Física y Biología en Medicina, Universidad de California Los Ángeles (UCLA), Los Ángeles, CA, EE. UU.

Alejandra Rios & R. Michael van Dam

Departamento de Farmacología Molecular y Médica, Facultad de Medicina David Geffen, UCLA, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Travis S. Holloway y R. Michael van Dam

Departamento de Bioingeniería, UCLA, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Philip H. Chao y R. Michael van Dam

Departamento de Física y Astronomía, UCLA, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Christian De Caro

Instituto para la Sociedad y la Genética, UCLA, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Chelsea C Okoro

Instituto Crump de Imágenes Moleculares, UCLA, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Alexandra Ríos, Travis S. Holloway, Philip H. Chao, Christian De Caro, Chelsea C. Okoro y R. Michael van Dam

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AR realizó los experimentos y analizó los datos. TSH y CO ayudaron con los experimentos. PHC diseñó el aparato de alto rendimiento, y AR y PHC ensamblaron y caracterizaron el sistema. CD fabricó los chips de silicio de reacción múltiple. AR y RMV contribuyeron al diseño experimental y escribieron el manuscrito. RMV supervisó el proyecto. Todos los autores han editado el manuscrito y aprobado la versión final.

Correspondencia a R. Michael van Dam.

El Dr. van Dam es uno de los fundadores de Sofie, Inc. y recibió apoyo para la investigación de aspectos de este proyecto a través de un subcontrato de subvención federal. Los restantes autores declaran no tener conflictos de interés.

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Reimpresiones y permisos

Ríos, A., Holloway, TS, Chao, PH et al. Conjuntos de reacción a escala de microlitros para la experimentación económica de alto rendimiento en radioquímica. Informe científico 12, 10263 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14022-2

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Recibido: 09 Diciembre 2021

Aceptado: 31 de mayo de 2022

Publicado: 17 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14022-2

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