YiaC y CobB regulan la lactilación de lisina en Escherichia coli

Jun 18, 2023

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 6628 (2022) Citar este artículo

3484 Accesos

3 citas

1 Altmetric

Detalles de métricas

Recientemente se ha informado que la lactilación de lisina (Kla) participa en la regulación de la transcripción en células humanas. Sin embargo, la caracterización, el mecanismo regulador y la consecuencia funcional de Kla en procariotas siguen sin estar claros. Aquí, informamos que YiaC funciona como una lisina lactilasa y que CobB sirve como una lisina delactilasa en la regulación del metabolismo. Demostramos que YiaC cataliza la adición de Kla, mientras que CobB borra este PTM tanto in vitro como intracelularmente. Además, mostramos que YdiF puede catalizar la formación de una lactil-coenzima A, que dona el grupo lactilo para Kla. El análisis proteómico cuantitativo revela además 446 sitios Kla endógenos objetivo de CobB y 79 candidatos objetivo de YiaC en Escherichia coli (E. coli). Además, presentamos que Kla puede influir en las funciones de las enzimas metabólicas. Curiosamente, demostramos que CobB puede modular específicamente la actividad de PykF al regular K382la, promoviendo la glucólisis y el crecimiento bacteriano. Nuestro estudio identifica las enzimas reguladoras y la red funcional de Kla y revela un mecanismo molecular mediado por Kla catalizado por CobB para la regulación de la glucólisis en E. coli.

La modificación postraduccional (PTM) es un elemento clave en la regulación de las funciones de las proteínas y juega un papel vital en la modulación de diversas funciones celulares y la progresión de la enfermedad en eucariotas1,2. Además, la creciente evidencia indica que los PTM también realizan una función importante en los procariotas. Por ejemplo, la acetilación de lisina (Kac) regula la virulencia bacteriana3, la quimiotaxis4 y la estabilidad de las proteínas5,6. Recientemente descubrimos que la lisina 2-hidroxiisobutirilación (Khib) estaba involucrada en la regulación del metabolismo bacteriano, la transcripción y la resistencia a los antibióticos7,8,9,10. Sin embargo, la comprensión de la función y el mecanismo regulador de las PTM en procariotas sigue siendo limitada.

La lactilación de lisina (Kla) se informó recientemente como un tipo de PTM recientemente identificado en histonas humanas para regular la polarización y los estados de los macrófagos11,12,13,14. Otros estudios demostraron que Kla en las histonas puede influir en la reprogramación metabólica celular durante la diferenciación de las células madre pluripotentes y en el cáncer de pulmón de células no pequeñas15,16, puede impulsar la oncogénesis y está asociada con la excitación neural17,18 a través de la regulación de la transcripción génica. Además, se ha demostrado que Kla en la proteína no histona HMGB1 promueve la liberación exosomal en la sepsis polimicrobiana19. Según los datos, se ha informado de Kla en eucariotas, incluidos humanos, ratones, arroz y Botrytis cinerea11,18,20,21. Sin embargo, no está claro si Kla existe en procariotas y qué roles podrían desempeñar estas modificaciones de Kla no descubiertas.

Se cree que los cambios dinámicos de los PTM con el tiempo y el espacio son eventos biológicos importantes, que modulan la función de las proteínas en diversos procesos celulares. Los PTM reversibles generalmente están regulados por dos tipos de enzimas que agregan o eliminan específicamente los PTM. Por ejemplo, se ha informado ampliamente que las lisina acetiltransferasas (KAT) y las lisina desacetilasas (KDAC) catalizan diversas acilaciones o desacilaciones1,22,23,24. Para Kla, P300 funciona como la lactilasa potencial, y las histonas desacetilasas de clase I (HDAC1‒3) sirven como delactilasas11,25. Sin embargo, aún se desconocen las enzimas reguladoras de Kla en procariotas.

Aquí, perfilamos el proteoma Kla en Escherichia coli (E. coli) MG1655, identificamos al escritor y borrador de Kla e ilustramos el efecto mediado por Kla en la glucólisis y el crecimiento bacteriano. Identificamos YiaC como una lactilasa y CobB como una delactilasa mediante el cribado de cepas con proteínas de la familia de N-acetiltransferasa (GNAT) relacionadas con GCN5 sobreexpresadas y CobB. Además, revelamos que YiaC y CobB pueden catalizar la adición y eliminación de la lactilación de lisina, respectivamente, tanto in vitro como intracelularmente. A continuación, al llevar a cabo el etiquetado de isótopos estables mediante un enfoque de proteómica cuantitativa basado en aminoácidos en cultivo celular (SILAC), identificamos 79 sitios Kla endógenos potencialmente regulados por YiaC y 446 candidatos Kla objetivo de CobB. Identificamos un total de 1047 sitios Kla en 478 proteínas en E. coli MG1655 y mostramos que las proteínas lactiladas estaban principalmente relacionadas con el metabolismo. Además, demostramos que CobB puede borrar PykF K382la para mejorar la glucólisis y promover el crecimiento de E. coli. En resumen, este estudio identifica el sistema enzimático regulador de Kla en bacterias, perfila las proteínas sustrato endógenas de Kla e ilustra el mecanismo molecular de la regulación de la glucólisis mediada por Kla.

Kla se identificó originalmente como un marcador de histonas en células eucariotas11,12,13,14. Sin embargo, no estaba claro si la nueva PTM existía en procariotas. Para lograr este objetivo, realizamos un ensayo de transferencia Western con anticuerpo pan-Kla para lisados ​​de células enteras de E. coli. Como se muestra en la Fig. 1a complementaria, se detectaron varias proteínas lactiladas de lisina, lo que confirma la existencia de Kla en procariotas.

Los PTM reversibles que están regulados por escritores y borradores modulan las funciones de las proteínas en diversos procesos celulares. Por lo tanto, es imperativo identificar las enzimas reguladoras de Kla para comprender su función y mecanismo regulador en procariotas. Estudios previos han demostrado que las acetiltransferasas (KAT) y las desacetilasas pueden regular diversas acilaciones de lisina, como la acetilación, la succinilación y la crotonilación24,26,27,28,29,30. Por lo tanto, planteamos la hipótesis racional de que algunos KAT y desacetilasas pueden catalizar la adición y eliminación de Kla.

Los GNAT son la única familia de proteínas que actúan como lisina acetilasa en E. coli31,32. Nuestro trabajo reciente mostró que TmcA actúa como una lisina 2-hidroxiisobutiriltransferasa mediante el cribado de cepas de E. coli BL21 (λDE3) que sobreexpresan GNAT9. Aquí, empleamos 18 cepas de E. coli BL21 (λDE3) (pGNAT) que sobreexpresan GNAT para detectar candidatos de lactilasa mediante inmunotransferencia de lisados ​​de células enteras con un anticuerpo pan-Kla. En comparación con E. coli que alberga el vector pET28a vacío, encontramos que solo la sobreexpresión de YiaC provocó un aumento extenso y obvio en los niveles de Kla (Fig. 1a, Fig. 1b, c complementaria), identificando a YiaC como un candidato de lisina lactilasa. Para confirmar su actividad catalítica hacia Kla, detectamos niveles de Kla en E. coli MG1655 yiaC+ y ΔyiaC. Los resultados de la inmunotransferencia mostraron que el nivel de Kla en la cepa ΔyiaC disminuyó significativamente (Fig. 1b). Juntos, nuestros resultados sugieren que YiaC es una lactilasa candidata que cataliza la generación de Kla.

a La sobreexpresión de YiaC aumentó los niveles de Kla en E. coli. E. coli BL21 (λDE3) se transfirió con el vector vacío (pET28a) como control y con el vector GNAT genes-pET28a como cepas que sobreexpresan GNAT (pGNAT), el nivel de Kla de los lisados ​​​​de células completas se analizó mediante inmunotransferencia. b La deficiencia de YiaC disminuyó la Kla en E. coli. El nivel de Kla de E. coli MG1655 ΔyiaC se analizó mediante inmunotransferencia, con yiaC+ como control. c La sobreexpresión de CobB disminuyó los niveles de Kla en E. coli. La inmunotransferencia analizó los niveles de Kla de E. coli BL21 (λDE3) transfirió pET28a como control y cobB-pET28a como cepa pCobB. d La deficiencia de CobB aumentó Kla en E. coli. El nivel de Kla de E. coli MG1655 ΔcobB se analizó mediante inmunotransferencia, con cobB+ como control. Todos los inmunoblots tuvieron tres repeticiones biológicas, con resultados similares. Y todas las cepas se cultivaron en medio LB a 37 °C.

Para explorar la delactilasa para E. coli, analizamos los niveles de Kla de la cepa (pCobB) de E. coli BL21 (λDE3) que sobreexpresa CobB, donde CobB es la principal desacilasa conocida en E. coli para la eliminación de la acetilación, succinilación y 2-hidroxiisobutirilación8,33,34,35. En comparación con E. coli que albergaba el vector pET28a vacío, la cepa pCobB provocó una disminución significativa en los niveles de Kla (Fig. 1c). Posteriormente, encontramos que los niveles de Kla aumentaron ligeramente en E. coli MG1655 ΔcobB en comparación con cobB+ (Fig. 1d). Estos resultados indicaron que CobB funciona como una delactilasa endógena.

Se sabe que la acetil-CoA o el acetil-fosfato puede actuar como donante del grupo acetilo para la acetilación en procariotas36. Sin embargo, no hay evidencia de la presencia de lactil-fosfato en E. coli. Para la lactil-CoA, un estudio anterior sugirió que el extracto de proteína de E. coli fresco puede catalizar el lactato a lactil-CoA37,38. Para confirmarlo, detectamos lactil-CoA en lisados ​​de células enteras como control. Como era de esperar, detectamos un nivel bajo de lactil-CoA (Fig. 2e complementaria), lo que muestra que la lactil-CoA está presente en E. coli. A continuación, incubamos el lactato con lisados ​​​​de células enteras frescos y descubrimos que el lactato podría convertirse efectivamente en lactil-CoA (Fig. 2e complementaria).

Para comprender mejor la formación de la lactil-CoA, exploramos la posible sintetasa o transferasa de la lactil-CoA. Primero, seleccionamos acetil-CoA sintetasa (Acs) y propionato CoA sintetasa (PrpE) como candidatos para la lactil-CoA sintetasa en E. coli. Para examinar si Acs o PrpE pueden catalizar lactato a lactil-CoA, incubamos Acs purificados con acetato o lactato y PrpE con propionato o lactato, respectivamente. Sin embargo, observamos que ni Acs ni PrpE podían catalizar la formación de lactil-CoA a partir de lactato (Figura complementaria 2c, d, f, g). Recientemente se informó que cinco CoA transferasas de diferentes especies, incluidas Megasphaera elsdenii, Clostridium propionicum, Megasphaera sp. DISK 18, Clostridium lactatifermentans An75 y la bacteria Firmicutes CAG:466 pueden convertir el lactato en lactil-CoA39,40. Después de una búsqueda BLAST, encontramos que la acetato CoA-transferasa (Ydif) en E. coli tiene una alta conservación de secuencia con las cinco transferasas, especialmente en los motivos EXGXXG y GXGGF (Fig. 2a, b complementarias). Por lo tanto, incubamos YdiF purificado con acetato o lactato. Curiosamente, encontramos que YdiF podría catalizar la conversión de acetil-CoA o lactil-CoA de acetato o lactato in vitro (Fig. 2a, b), lo que sugiere que Ydif tiene actividad lactil-CoA-transferasa. Para confirmar su actividad catalítica intracelular, analizamos más a fondo los niveles de Kac y Kla en la cepa de E. coli BL21 (λDE3) que sobreexpresa YdiF (pYdiF). En comparación con E. coli que alberga el vector pET28a vacío, encontramos que la cepa pYdiF provocó un aumento significativo en los niveles de Kac y Kla (Fig. 2c). Juntos, nuestros resultados demuestran que la lactil-CoA existe en E. coli y que YdiF puede servir como una lactil-CoA-transferasa para la conversión de lactato de lactil-CoA.

Se realiza una producción de acetil-CoA (Ac-CoA) por YdiF. − YdiF: acetato de incubación con acetoacetil-CoA (Acac-CoA), + YdiF: acetato de incubación con acetoacetil-CoA (Acac-CoA) con YdiF. n = 3 repeticiones biológicas. b se realiza producir lactil-CoA (la-CoA) por YdiF. − YdiF: lactato de incubación con acetoacetil-CoA (Acac-CoA), + YdiF: lactato de incubación con acetoacetil-CoA (Acac-CoA) con YdiF. n = 3 repeticiones biológicas. La sobreexpresión de c YdiF aumentó la formación de acetil-CoA y lactil-CoA. La inmunotransferencia analizó Kac y Kla de E. coli BL21 (λDE3) transfirió pET28a como control e ydiF-pET28a como cepa pYdiF. d Análisis ITC de la afinidad de YiaC recombinante con lactil-CoA, acetil-CoA y succinil-CoA, tres repeticiones biológicas, con resultados similares. e YiaC catalizó la acetilación pero no la succinilación. La inmunotransferencia analizó Kac y Ksucc de E. coli BL21 (λDE3) transfirió pET28a como control y yiaC-pET28a como cepa pYiaC. f Análisis ITC de la afinidad de CobB recombinante con el péptido Kla (AETAEK(la)YGDEQVK) y el péptido Kac (AETAEK(ac)YGDEQVK), tres repeticiones biológicas, con resultados similares. g CobB catalizó la deslactilación del péptido in vitro. Se usaron péptidos sintéticos (AETAEK(la)YGDEQVK, AETAEK(ac)YGDEQVK) como sustratos para la reacción de CobB con detección por LC-MS de actividades de desacetilación y desacetilación de lisina de CobB, tres repeticiones biológicas, con resultados similares. h Lactilación de péptido catalizada por YiaC in vitro. El péptido sintético (TICHDKAFVR) se utilizó como sustrato para la reacción de YiaC con detección por LC-MS de la lactilación de lisina y actividades de acetilación de YiaC, tres repeticiones biológicas, con resultados similares. i Parámetros cinéticos (kcat, Km y kcat/Km) de YiaC para lactilaitón y CobB para deslactilación, n = 3 repeticiones biológicas. Los datos son medias ± SEM de tres ensayos independientes, prueba t de Student de dos colas. Los valores P se indican en la figura. Todos los inmunoblots tuvieron tres repeticiones biológicas, con resultados similares. Todas las cepas se cultivaron en medio LB a 37 °C. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Estudios previos mostraron que las lisina acilasas generalmente se unen con acil-CoA relevante para iniciar la función catalítica22,41, mientras que las desacilasas necesitan reconocer la lisina modificada correspondiente para catalizar la eliminación de PTM8. Por lo tanto, realizamos un ensayo de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para detectar la unión de YiaC con lactil-CoA y CobB con péptido lactilado. Debido a que YiaC es una lisina acetilasa conocida y CobB es una desacetilasa32,33, usamos por separado acetil-CoA y péptido acetilado como controles. Como se anticipó, hubo una fuerte unión entre YiaC y lactil-CoA (KD = 6,83 μM), que fue similar a la acetil-CoA (KD = 5,57 μM); en cambio, no hubo unión entre YiaC y succinil-CoA (Fig. 2d, Datos complementarios 1). A continuación, descubrimos que la sobreexpresión de YiaC podía regular positivamente Kac como se informó32, pero no provocó un cambio en la succinilación en comparación con E. coli transformada con el vector pET28a (Fig. 2e), lo cual fue consistente con los resultados de ITC. Estos resultados proporcionan evidencia de apoyo adicional de que YiaC puede catalizar la adición de Kla. También detectamos la unión de CobB con péptido lactilado (AETAEK(la)YGDEQVK, de GpmA) y péptido acetilado (AETAEK(ac)YGDEQVK, de GpmA). Los resultados de ITC mostraron que CobB podría unirse con el péptido lactilado (KD = 0,371 μM), similar al péptido acetilado (KD = 0,508 μM) (Fig. 2f, Datos complementarios 1).

Para caracterizar las actividades enzimáticas de YiaC y CobB, realizamos además ensayos de reacción enzimática in vitro con péptidos sintéticos. Se empleó cromatografía líquida-MS (LC-MS) para monitorear Kla y Kac de los péptidos reaccionados, y se usó el espectro MS/MS para verificar su veracidad. Al incubar CobB con péptido lactilado o acetilado (AETAEK(la o ac)YGDEQVK, de GpmA), encontramos que CobB catalizó eficientemente la hidrólisis del péptido lactilo en presencia de NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido). Por el contrario, el péptido deslactilado no se detectó en la reacción sin NAD+, lo que sugiere un mecanismo de deslactilación dependiente de NAD, similar a la desacetilación (Fig. 2g). Posteriormente, descubrimos que la nicotinamida (NAM) (un inhibidor de HDAC de clase III) podía inhibir la reacción de desacetilación y que la NAM era más eficaz para la desacetilación que para la desacetilación (Fig. 2g). Estos resultados indicaron que CobB dependiente de NAD puede catalizar la deslactilación de lisina in vitro, que puede ser inhibida eficientemente por NAM. Además, al incubar YiaC con un péptido (TICHDKAFVR) que presenta lactil-CoA o acetil-CoA, encontramos que YiaC puede catalizar la lactilación in vitro. En comparación con la acetilación, es probable que YiaC sea más eficiente para la lactilación (Fig. 2h).

Para determinar la cinética enzimática de YiaC y CobB, a continuación utilizamos un ensayo MS de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistido por matriz (MALDI-TOF) para calcular los parámetros cinéticos (kcat, Km y kcat/Km) de YiaC para la lactilación y CobB para la deslactilación. Las mediciones cinéticas (Fig. 2i, Fig. 3 complementaria, Datos complementarios 2) confirmaron la actividad lactilasa de YiaC (kcat = 0,97 ± 0,03 s-1, Km = 26,6 ± 1,1 μM, kcat /Km = 3,6 × 104 s-1 .M−1) es más eficaz que la acetilasa (kcat = 0,23 ± 0,04 s−1, Km = 28,7 ± 1,2 μM, kcat /Km = 8,0 × 103 s−1.M−1). La actividad delactilasa de CobB (kcat = 0,99 ± 0,04 s−1, Km = 25,4 ± 1,5 μM, kcat /Km = 3,9 × 104 s−1.M−1) es similar a la actividad desacetilasa (kcat = 0,97 ± 0,02 s −1, Km = 18,7 ± 1,0 μM, kcat /Km = 5,2 × 104 s−1.M−1). Estos resultados muestran la caracterización cinética enzimática de YiaC para la lactilación y CobB para la deslactilación.

Para comprender los sustratos Kla endógenos regulados por YiaC y CobB, realizamos proteómica cuantitativa combinando SILAC y enriquecimiento por afinidad para analizar la influencia de la eliminación del gen YiaC o CobB en el lactiloma en E. coli (Fig. 3a). Comparando las cepas E. coli MG1655 yiaC+ y ΔyiaC, cuantificamos 451 sitios Kla en 247 proteínas (Datos complementarios 3). Al normalizar las abundancias detectadas a la expresión de sus proteínas correspondientes (Fig. 4a complementaria), cuantificamos 79 sitios Kla significativamente regulados a la baja (reducción de más de 1.5x) en E. coli ΔyiaC (Fig. 3b). Estos Kla regulados a la baja pueden ser sustratos dirigidos a YiaC potencialmente funcionales. Además, al comparar las cepas E. coli MG1655 cobB+ y ΔcobB, cuantificamos 818 sitios Kla en 375 proteínas (Datos complementarios 4). Normalizado por la abundancia de las proteínas correspondientes (Fig. 4b complementaria), el resultado mostró que más de la mitad de los sitios Kla estaban significativamente regulados al alza (más de un aumento de 1,5x) en la cepa ΔcobB en comparación con la cepa cobB+ (Fig. 3c) . Un total de 446 sitios Kla regulados al alza fueron sustratos candidatos dirigidos a CobB. Al comparar los candidatos a los que se dirigen YiaC y CobB, encontramos que el 63 % de las proteínas lactiladas por YiaC también eran sustratos para CobB (Fig. 4c complementaria), mientras que solo 29 sitios Kla en 25 proteínas estaban marcadamente corregulados por estas dos enzimas (Fig. 4d), lo que indica que el sistema regulador Kla compuesto por YiaC y CobB puede no ser el único, y es probable que existan otras enzimas reguladoras intracelulares. Además, analizamos las características de la secuencia de los péptidos Kla potencialmente regulados por YiaC y CobB. Como se muestra en la Fig. 3d, el glutamato ácido y el aspartato y la valina hidrofóbica rodearon claramente a Kla ubicada en los péptidos Kla dirigidos a YiaC. Además, el glutamato ácido, la alanina hidrofóbica y la lisina básica rodeaban a Kla ubicada en los péptidos Kla dirigidos por CobB (Fig. 3e). La diferencia en las características de secuencia indicó que YiaC y CobB tienden a catalizar Kla en diferentes secuencias de aminoácidos características. Esto también explica en cierta medida por qué solo se identificó una pequeña cantidad de sitios regulados comunes. Para comprender la importancia biológica de la regulación de YiaC y CobB, realizamos un análisis de ontología génica (GO) adicional de los candidatos de proteína Kla dirigidos por YiaC o CobB. Descubrimos que los candidatos de Kla para YiaC o CobB están relacionados principalmente con el metabolismo y la biosíntesis, especialmente la glucólisis, y ocurren principalmente en el ribosoma y el citosol con actividades de unión diversas (Fig. 3f, g), lo que sugiere que Kla regulado por YiaC y CobB puede influir en el metabolismo y la biosíntesis.

una representación esquemática del flujo de trabajo experimental para la cuantificación SILAC. b Diagrama de dispersión que muestra la proporción de péptidos Kla en E. coli MG1655 yiaC+ frente a ΔyiaC (normalizado por la abundancia de proteína). c Diagrama de dispersión que muestra la proporción de péptidos Kla en E. coli MG1655 cobB+ frente a ΔcobB (normalizado por la abundancia de proteína). d El logotipo del motivo de la secuencia muestra una secuencia representativa de los sitios Kla regulados por YiaC. El logotipo del motivo de secuencia muestra una secuencia representativa de los sitios Kla regulados por CobB. f Análisis GO para candidatos de proteína Kla objetivo de YiaC. g Análisis GO para candidatos de proteína Kla objetivo de CobB. El valor de corte p = 0,05 y el valor de corte q = 0,2 se seleccionaron como criterios de corte. Se utilizó la corrección de Benjamini y Hochberg para ajustar los valores de p.

Las características biológicas de Kla en procariotas seguían sin estar claras, por lo que combinamos los dos grupos de datos de lactiloma cuantificados enumerados en Datos complementarios 3, 4 y seleccionamos todos los datos de Kla identificados en E. coli MG1655 de tipo salvaje como la lactiloma en E. coli. Identificamos un total de 1047 sitios Kla en 478 proteínas (Fig. 4a, Datos complementarios 5). Al analizar la frecuencia de Kla en las proteínas, encontramos que la mayoría de las proteínas identificadas (~57 %) tienen 1 o 2 sitios Kla, y el 11 % de las proteínas tienen más de 5 sitios Kla. Curiosamente, muchas proteínas ricas en sitios Kla son enzimas metabólicas y biosintéticas (Fig. 4b), lo que indica que Kla puede tener efectos funcionales sobre el metabolismo y la biosíntesis bacterianos. Al analizar las características de la secuencia de los péptidos Kla, encontramos que el glutamato ácido y la lisina básica estaban rodeados por Kla con alta confianza (Fig. 5a complementaria). Además, el análisis GO de este lactiloma mostró que las proteínas lactiladas están relacionadas principalmente con el metabolismo, la traducción, el ensamblaje de ribosomas y la biosíntesis y ocurren principalmente en ribosomas con diversas actividades de unión (Fig. 5b complementaria). Para analizar la probabilidad de Kla en relación con su sustrato, utilizamos la intensidad de Kla identificada en E. coli MG1655 de tipo salvaje dividida por la intensidad de la proteína correspondiente. Definimos una proporción> 0.001 como sitios Kla con una alta frecuencia en las proteínas (Datos complementarios 6); por lo tanto, se definió que un total de 323 sitios Kla en 240 proteínas ocurrían con alta frecuencia (Fig. 5c, d complementarias). El análisis GO mostró que estas proteínas con Kla de alta frecuencia también están relacionadas principalmente con varias vías metabólicas (Fig. 5e complementaria). En particular, un análisis adicional de las proteínas lactiladas en las vías reveló que casi todas las enzimas en la glucólisis, el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la biosíntesis de ácidos grasos están lactiladas; además, la mayoría de estas enzimas también se identificaron como candidatas para la regulación CobB o YiaC (Fig. 4c). También se demostró que CobB tiene un rango regulatorio más amplio que YiaC, y pueden regular conjuntamente la misma proteína y tener sus propias proteínas reguladoras específicas.

a Análisis estadístico de las proteínas Kla y sitios de E. coli. b La frecuencia de Kla ocurre en las proteínas. c Las enzimas lactiladas en el metabolismo central del carbono y la red de biosíntesis de ácidos grasos en E. coli.

Para explorar la función de Kla regulada por YiaC y CobB, realizamos experimentos in vitro. De acuerdo con las redes Kla (Fig. 3b, c), realizamos además un grupo de reacciones in vitro en las que se incubaron YiaC y CobB con sus respectivas proteínas candidatas. Luego, los niveles de Kla de las proteínas candidatas se detectaron mediante inmunotransferencia. Descubrimos que YiaC puede lactilar efectivamente la citrato sintasa (GltA) y la nicotinato fosforribosiltransferasa (PncB) (Fig. 5a, b), mientras que CobB puede deslactilar claramente la piruvato quinasa I (PykF), la fosfoglicerato mutasa dependiente de 2,3-bisfosfoglicerato (GpmA) y malato deshidrogenasa (Mdh) in vitro (Fig. 5c-e). Así, se puede observar que YiaC y CobB pueden regular los niveles de Kla de diversas enzimas metabólicas y biosintéticas; en particular, CobB puede deslactilar ampliamente las enzimas de la glucólisis in vitro, lo que es consistente con los resultados del análisis GO que se muestra en la Fig. 3g.

a, b YiaC puede catalizar específicamente Kla de GltA y PncB in vitro. Se incubó GltA o PncB recombinante con YiaC en presencia de lactil-CoA (1 mM) durante 10 ha 25 °C y se realizó inmunotransferencia. c–e CobB puede borrar específicamente Kla de GpmA, Mdh y PykF in vitro. Se incubó GpmA, Mdh o PykF recombinante con CobB durante 10 ha 25 °C y se realizó inmunotransferencia. f La lista de sitios Kla identificados de enzimas. g–i Detección de las actividades de las enzimas y sus mutantes (K a Q y K a R) (los datos son medias ± SEM de tres ensayos independientes, prueba t de Student de dos colas). Todos los inmunoblots tuvieron tres repeticiones biológicas, con resultados similares. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Determinar si Kla puede influir en la actividad enzimática. Primero, confirmamos los sitios Kla de estas proteínas reguladas por YiaC y CobB de los Datos complementarios 3 y 4 (Fig. 5f), y luego reemplazamos la K lactilada por Q (glutamina) porque la propiedad eléctrica de Kla es neutral, similar a eso de glutamina y reemplazó la K no modificada por R (arginina) porque la carga positiva de K es similar a la de R. Al combinar los ensayos de actividad enzimática in vitro, encontramos que las actividades enzimáticas de la simulación de las variantes de Kla PncBK381Q, GpmAK106Q y PykFK382Q eran disminuyó significativamente en comparación con las de las proteínas de tipo salvaje. Las actividades enzimáticas de los mutantes no modificados PncBK381R, GpmAK106R y PykFK382R aumentaron (Fig. 5g-i). Estos resultados sugieren que YiaC y CobB pueden mediar en Kla para influir en las actividades de las enzimas metabólicas.

En particular, las vías metabólicas y sintéticas afectan el crecimiento bacteriano42,43,44. Por lo tanto, predijimos racionalmente que los cambios en las actividades de PncB, GpmA y PykF causados ​​por Kla pueden influir en el crecimiento bacteriano. Para confirmar esta hipótesis, primero confirmamos la confiabilidad de los péptidos Kla identificados al sintetizar tres tipos de péptidos Kla del proteoma relacionado con YiaC y tres tipos de péptidos Kla del proteoma relacionado con CobB que contienen los péptidos PncB K381la (TICHDK(la) AFVR), GpmA K106la (AETAEK(la)YGDEQVK) y PykK382la (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR). Como se muestra en la Fig. 6a, b y la Fig. 6 complementaria, todos los espectros de MS/MS de los péptidos Kla sintéticos se superponen casi por completo con los péptidos modificados intracelularmente; por lo tanto, se confirmó la fiabilidad de los péptidos Kla. A continuación, construimos por separado PykF, PykFK382Q y PykFK382R que sobreexpresan E. coli MG1655 (cepas pPykF, pPykFK382Q y pPykFK382R) y construimos las cepas pPncB, pPncBK381Q, pPncBK381R, pGpmA, pGpmAK106Q y pGpmAK106R. . Luego, las curvas de crecimiento se detectaron después de cultivar en medio de caldo de lisogenia (LB). Descubrimos que pPncB, pGpmA y sus cepas mutantes no mostraron diferencias en el crecimiento (Fig. 7a, b complementarias). Sin embargo, en el grupo PykF, la cepa pPykFK382R tuvo el crecimiento más rápido, mientras que la cepa pPykFK382Q creció más lentamente entre las tres cepas con los mismos niveles de sobreexpresión (Fig. 6c, d). Además, detectamos actividad PykF intracelular. De acuerdo con las curvas de crecimiento, la cepa pPykFK382R mostró la actividad más alta y pPykFK382Q tuvo la actividad más baja entre las tres cepas (Fig. 6e). Como se informó, PykF es una enzima limitante de la velocidad crítica en la glucólisis que controla el flujo metabólico e influye en la división celular bacteriana45. Estos resultados demuestran que PykF K382la ralentiza el crecimiento bacteriano al reducir la actividad de PykF. Para confirmar aún más esta observación, considerando que el fosfoenolpiruvato producido por la glucólisis de glucosa puede producir piruvato bajo la catálisis de PykF46,47, seleccionamos el medio mínimo M9 con 1% de glucosa para hacer que PykF realice su función metabólica normal y seleccionamos el medio mínimo M9 con 1% de piruvato. para bloquear la función de PykF. Luego, medimos las curvas de crecimiento y la actividad de PykF intracelular de estas tres cepas en medio mínimo M9 con 1% de glucosa, como en LB. La cepa pPykFK382R creció más rápido y mostró la actividad de PykF más alta, y la cepa pPykFK382Q creció más lentamente y mostró la actividad de PykF más baja (Fig. 6f, g). Por el contrario, para bloquear la influencia de PykF, medimos las curvas de crecimiento y la actividad de PykF intracelular de estas tres cepas cultivadas en medio mínimo M9 con piruvato al 1%. Encontramos que no hubo diferencia en el crecimiento de las tres cepas (Fig. 6h). Estos resultados ilustran que PykF K382la afecta el crecimiento bacteriano al reducir la actividad de PykF.

a El espectro MS/MS del péptido (LDAPLIVATQGGK(la)SAR, PYKF) del proteoma de ΔcobB. b El espectro MS/MS del péptido sintético (LDAPLIVATQGGK(la)SAR). c Selección de la misma expresión de PykF recombinante para cepas de sobreexpresión mediante inmunotransferencia con anticuerpo his tag. d Curva de crecimiento de medición de cepas de E. coli que sobreexpresan PykF (pPykF, pPykFK382Q y pPykFK382R) cultivadas en medio LB a 37 °C con placas de 96 pocillos. e Medición de la actividad intracelular de PykF de cepas relacionadas con d. f Curva de crecimiento de medición de las cepas pPykF, pPykFK382Q y pPykFK382R cultivadas en medio M9 con glucosa al 1 % a 37 °C con placas de 96 pocillos. g Medida de la actividad intracelular de PykF de cepas relacionadas con f. h Curva de crecimiento de medición de las cepas pPykF, pPykFK382Q y pPykFK382R cultivadas en medio M9 con piruvato al 1 % a 37 °C con placas de 96 pocillos. i Delactilación catalizada por CobB de PykF K382la in vitro. Se usó el péptido sintético PykF K382la (LDAPLIVATQGGK(la)SAR) como sustrato para la reacción de CobB con detección por LC-MS de la actividad de deslactilación de lisina de CobB. j, k CobB regula la actividad de PykF borrando K382la in vitro. PYKF se incubó con CobB para disminuir K382la (j), después de la deslactilación, detección de la actividad de PykF (k). l Medición de la curva de crecimiento de las cepas E. coli MG1655 cobB+ y ΔcobB cultivadas en medio M9 con 1 % de glucosa a 37 °C con placas de 96 pocillos. m Medida de la actividad intracelular de PykF de cepas relacionadas con l. n Medición de la curva de crecimiento de las cepas E. coli MG1655 cobB+ y ΔcobB cultivadas en medio M9 con piruvato al 1 % a 37 °C con placas de 96 pocillos. o Análisis 3D del resultado de la simulación MD del sistema PykF-FBP. p Análisis 3D del resultado de la simulación MD del sistema PykF K382la-FBP. Para medir la actividad de PykF y la curva de crecimiento, n = 3 réplicas biológicas, los datos son medias ± SEM, prueba t de Student de dos colas, los valores P se indican en la figura, NS significa no significativo. OD600, densidad óptica a 600 nm. Los inmunoblots tuvieron tres repeticiones biológicas, con resultados similares. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El lactiloma mostró que CobB deslactiló PykF K382la intracelularmente (Fig. 5f). Para confirmar este resultado, incubamos el péptido PykF K382la (LDAPLIVATQGGK(la)SAR) con CobB y detectamos los productos por LC‒MS/MS, y los resultados mostraron que CobB puede catalizar eficazmente la deslactilación de PykF K382la in vitro (Fig. 6i ). Por lo tanto, incubamos PykF con CobB para borrar PykF K382la (Fig. 6j) y luego detectamos la actividad. El resultado mostró que CobB borrando PykF K382la mejoró la actividad de PykF in vitro (Fig. 6k). Para los ensayos intracelulares, medimos las curvas de crecimiento y la actividad PykF intracelular de las cepas cobB+ y ΔcobB cultivadas en medio mínimo M9 con glucosa al 1 % o piruvato al 1 %. Además, encontramos que la cepa cobB+ creció más rápido que la cepa ΔcobB en medio mínimo M9 con 1% de glucosa (Fig. 6l). Además, la actividad de PykF intracelular de cobB + fue mayor que la de la cepa ΔcobB (Fig. 6m). Como era de esperar, no hubo diferencia en el crecimiento de las cepas cobB+ y ΔcobB (Fig. 6n). Juntos, estos resultados demuestran que CobB puede regular la actividad de PykF e influir en el crecimiento bacteriano al borrar PykF K382la in vitro e intracelularmente.

Estudios previos indicaron que la fructosa 1,6-bisfosfato (FBP) puede unirse a PykF y activar alostéricamente PykF, y K382 es una regulación alostérica clave relacionada con el sitio de PykF48,49,50. Por lo tanto, especulamos que la disminución de la actividad de PykF por parte de K382la puede deberse a la influencia sobre la activación alostérica. Para confirmar esto, realizamos simulaciones de dinámica molecular (MD) de 100 ns para PykF-FBP y PykF K382la-FBP tres veces, respectivamente. Para observar la estabilidad dinámica de los dos complejos del sistema, se monitorearon las desviaciones cuadráticas medias (RMSD) desde la estructura inicial. Descubrimos que los RMSD promedio de estos dos complejos de sistemas fluctúan ligeramente (Fig. 8a complementaria), lo que sugiere que ambos sistemas son estables. Para comprender mejor la influencia en la unión, medimos las distancias promedio entre el átomo de nitrógeno de la cadena lateral K382 y el átomo de carbono central de FBP tanto en el sistema PykF-FBP como en el sistema PykF K382la-FBP de 45 ns a 100 ns, respectivamente ( Figura complementaria 8b). Descubrimos que la distancia promedio de tres veces entre K382 y FBP es muy estable en el sistema PykF-FBP, pero la de K382la y FBP tiene fluctuaciones significativas en el sistema PykF K382la-FBP. Este resultado indica que PykF K382la puede afectar la unión entre FBP y PykF. Para observar los cambios en la microestructura, seleccionamos la estructura inicial y estable (0 y 55 ns) utilizando GROMACS en dos procesos de simulación, respectivamente. Para el sistema PykF-FBP, podemos ver que la distancia de K382 y FBP en la estructura inicial es de 9.4 Å, y que en la estructura estable es de solo 8.4 Å (Fig. 6o). Para el sistema PykF K382la-FBP, la distancia de K382la y FBP en la estructura inicial es de 10,7 Å, mientras que en la estructura estable es de 15,8 Å (Fig. 6p). Por lo tanto, estos resultados sugirieron que PykF K382la obstaculizó la unión entre FBP y PykF y debilitó aún más la activación alostérica de PykF, reduciendo finalmente la actividad de PykF.

El lactato, antes considerado un desecho metabólico, ahora se reconoce como un metabolito importante en los mamíferos. El lactato actúa como un importante combustible de carbohidratos circulantes al proporcionar compuestos de tres carbonos51 y modular los microambientes celulares para regular el desarrollo de tumores y la respuesta inmunitaria52,53. El descubrimiento de la lactilación de la lisina abrió el horizonte de la regulación funcional por lactato, y Kla en las histonas sirvió como marcador significativo para regular la transcripción en eucariotas11,15,17. Toda esta evidencia demostró la importancia de Kla. Para las bacterias, el lactato se identificó inicialmente como un metabolito secundario universal, y la fermentación bacteriana es el principal método de producción industrial de lactato54. El lactato sirve como una importante fuente de carbono para el metabolismo bacteriano55 y la utilización del lactato microbiano puede modular la resistencia al estrés, la remodelación de la pared celular y los factores de virulencia56. Además, los metabolitos microbianos del huésped son un factor crítico que influye en muchos procesos fisiológicos y en el desarrollo de enfermedades57, en las que el lactato puede alterar el microambiente y provocar una respuesta inmunitaria56,58. Si Kla ocurre en procariotas y qué funciones biológicas podría realizar siguen sin estar claros. Por lo tanto, es necesario explorar la caracterización, funciones y mecanismos de regulación de Kla en bacterias.

Nuestro estudio muestra que Kla está ampliamente distribuida en proteínas bacterianas. Es importante destacar que identificamos un par de enzimas catalíticas Kla en las que CobB sirve como delactilasa, mientras que YiaC funciona como lactilasa (Fig. 7). Mediante la constante de unión termodinámica y la cinética enzimática, caracterizamos las capacidades catalíticas de CobB y YiaC y demostramos además que el mecanismo regulador de deslactilación por CobB depende de NAD, y la lactilación por YiaC depende de La-CoA. Para la generación de Kla, detectamos la presencia de lactil-CoA como donante de Kla en E. coli y descubrimos que los lisados ​​​​de células enteras frescas exhiben actividad catalítica para la conversión de lactato en lactil-CoA (Fig. 2e complementaria). Además, identificamos a YdiF como una transferasa para la producción de lactil-CoA en E. coli (Fig. 2a-c).

YiaC y CobB regularon Kla en E. coli e influyen en el crecimiento bacteriano al regular la actividad de PykF.

Para comprender las redes reguladoras endógenas, realizamos proteómica cuantitativa e identificamos 79 sitios candidatos de Kla regulados por YiaC y 446 sitios candidatos de Kla dirigidos por CobB. Cabe señalar que YiaC y P300 pertenecen a diferentes familias de proteínas, mientras que esta última tiene actividad lactilasa en células humanas11, y CobB es una delactilasa, que también es distinta de HDAC1-3, que sirven como delactilasas en eucariotas25. Este hallazgo indica que puede haber otras lactilasas y delactilasas potenciales en eucariotas. Además, YiaC se informó anteriormente como lisina y acetilasa N-terminal59,60, y CobB se informó como lisina acetilasa, succinila y 2-hidroxiisobutiriltransferasa8,33,34. Por lo tanto, ampliamos la comprensión de las enzimas reguladoras de la acilación en diversidad funcional y reguladora. La acilación de lisina depende de la dosis del metabolismo de acil-CoA y los ácidos orgánicos correspondientes61,62, y los cambios en el metabolismo pueden movilizar enzimas reguladoras para regular los niveles de acilación. El lactato se acumula en E. coli bajo la fermentación de glucosa63, y el aumento del nivel de lactato puede movilizar YiaC y CobB para mantener el equilibrio de Kla.

Aquí, informamos un análisis global de los lactilomas de lisina en bacterias. Se identificaron un total de 1047 sitios Kla en 478 proteínas en E. coli. Esta modificación está muy extendida pero está principalmente enriquecida en enzimas metabólicas. Como se muestra en la Fig. 4c, casi todas las enzimas en la glucólisis y TCA están lactiladas; en particular, estas enzimas también se identifican como candidatas a las que se dirige CobB, lo que sugiere que CobB puede borrar Kla para regular las actividades de las enzimas metabólicas. De hecho, nuestros resultados muestran que CobB y YiaC pueden mediar en Kla para ejercer efectos sobre sus sustratos. Por ejemplo, CobB regula negativamente K106la de GpmA y K382la de PykF para mejorar las actividades de las enzimas correspondientes, y YiaC regula positivamente K381la de PncB para disminuir la actividad de PncB. Es importante destacar que demostramos que CobB borra K382la de PykF para promover la glucólisis y el crecimiento bacteriano. Nuestro estudio revela que Kla tiene un amplio efecto regulador sobre el metabolismo en bacterias, distinto de la transcripción reguladora de Kla en eucariotas11,15. Como producto final de la glucólisis anaeróbica en bacterias (Fig. 7)55, el lactato puede catalizarse para producir lactil-CoA, que es un sustrato necesario para la generación de Kla11. Por lo tanto, los metabolitos pueden influir eficazmente en el nivel de Kla de las enzimas metabólicas intracelulares. Por el contrario, nuestro estudio revela que Kla mediada por CobB regula las actividades de las enzimas metabólicas e influye aún más en la glucólisis, lo que sugiere una cascada de señalización de metabolismo-PTM-metabolismo que regula el equilibrio del metabolismo y PTM.

En resumen, originalmente identificamos el sistema regulador procariótico Kla en el que YiaC es una lisina actilasa y CobB sirve como una delactilasa. Posteriormente, perfilamos los candidatos endógenos de YiaC y CobB, proporcionando un marco para investigar las diversas funciones de Kla reguladas por YiaC y CobB en procariotas. Además, describimos las características del lactiloma en E. coli que contiene 1047 sitios Kla en 478 proteínas. Es importante destacar que demostramos que CobB puede aumentar la actividad de PykF al borrar K382la, mejorando la glucólisis y el crecimiento bacteriano. Nuestro trabajo presenta el sistema regulador y la red molecular de Kla y ofrece una nueva visión del mecanismo mediado por Kla para la regulación del metabolismo en bacterias.

Las células E. coli MG1655 y E. coli MG1655 ΔcobB se obtuvieron de nuestro estudio anterior8, E. coli BL21 (λDE3) era de TIANGEN, E. coli MG1655 ΔyiaC y los genes de la familia GNAT que sobreexpresan las cepas de E. coli BL21 (λDE3) fueron obtenido de nuestro estudio previo9. Todos los anticuerpos anti-acillisina se adquirieron de PTM Biolabs Inc. Todos los péptidos sintéticos fueron generados por SciLight Biotechnology, LLC. Los anticuerpos (todos diluidos 1:1000) y otros reactivos se enumeran en Datos complementarios 7.

Este método se realizó como se describió anteriormente9. En detalle, se construyeron plásmidos para expresar proteínas en E. coli. Utilizamos pEASY®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit (TRANS) para construir los plásmidos de las etiquetas pET28a-cisY, pET28a-pncB, pET28a-gpmA, pET28a-mdh, pET28a-pykF y pBR322-pykF-His. Para la mutación, utilizamos el Sistema de mutagénesis rápida (TRANS) para construir los vectores que contenían genes mutados puntualmente. Todos los cebadores utilizados para PCR se enumeran en Datos complementarios 7. Los vectores construidos de pET28a se transformaron en E. coli BL21 (λDE3) para sobreexpresar cepas. Los vectores construidos de pBR322 se transformaron en E. coli MG1655 y se cultivaron en medio LB con ampicilina (Amp, 50 μg ml–1), a 37 °C en frascos agitados a 220 rpm. durante la noche.

La E. coli BL21 (λDE3) construida y transformada con vectores gen-pET28a se cultivó en medio LB que contenía kanamicina (Kana, 50 μg ml–1), a 16 °C en matraces agitados hasta una densidad óptica de 0,6–0,8 a 600 nm . A continuación, las células se indujeron con IPTG 0,05 mM a 16 °C durante la noche, seguido de la recolección de lisados ​​de células completas para inmunotransferencia o purificación de proteínas. Las proteínas se recogieron de las células cultivadas mediante tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, MgCl2 10 mM, lisozima 1 mg ml–1, nucleasa 50 U ml–1). Luego, las proteínas se mezclaron con la resina HisPur Ni-NTA y se lavaron con tampón de lavado (Na3PO4 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 25 mM, pH 7,4), las proteínas sobreexpresadas se eluyeron con tampón de elución (Na3PO4 20 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, PH 7,4). La elución se recogió y se concentró utilizando un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra-0,5 en tampón de almacenamiento (HEPES 100 mM, MgCl2 10 mM, KCl 7,7 mM, pH 7,0).

Sintetizamos lactil-CoA como se describió anteriormente8. En detalle, se añadió diciclohexilcarbodiimida a una solución de mezcla de dimetilformamida que contenía ácido láctico y tiofenol, se agitó a 4 °C y se detuvo la reacción añadiendo agua fría. La solución se extrajo con éter y se lavó tres veces con cloruro de sodio saturado y se secó el extracto de éter con sulfato de sodio anhidro, luego se purificó el residuo por cromatografía en columna de gel de sílice (eluida con una mezcla 20:1 de acetato de etilo y hexano) seguido de cromatografía en capa fina de sílice (eluida con una mezcla 1:4 de acetato de etilo y hexano). La purificación se disolvió en bicarbonato de sodio 0,1 M, luego se añadió a tampón de bicarbonato de sodio que contenía sal de sodio de CoA a 0 °C. Después de colocar durante la noche, la reacción se detuvo con HCl a pH 7,0. El producto final se evaporó con agua a 30 °C y se extrajo con éter y acetato de etilo.

Este método se realizó como se describió anteriormente64. En detalle, los Acs o PrpE purificados con una concentración final de 0,3 μM se añadieron al tampón de reacción [HEPES 50 mM, MgCl2 10 mM, ATP 2,5 mM, HSCoA 0,5 mM, fosfoenolpiruvato 3 mM, NADH 0,1 mM, piruvato quinasa 1 U , 1,5 U de lactato deshidrogenasa, 5 U de mioquinasa, 10 mM de DTT y 0,2 mM de sustrato de ácido orgánico (acetato, lactato y propionato), PH 7,5] a 25 °C durante 30 min. Después de extinguir la reacción añadiendo un volumen igual de ácido trifluoroacético al 10 % (v/v) y limpiando con C18 ZipTips, los productos de actil-CoA se analizaron mediante LC-MS/MS. Cada reacción se realizó tres repeticiones biológicas.

Este método fue descrito previamente37. En detalle, se cultivó E. coli MG1655 en medio LB a 37 °C en matraces agitados durante la noche y se recogieron las células por centrifugación, luego se añadió tampón de lisado [50 mM NaH2PO4, 50 mM NaH2PO4 y 5 mM MgCl2, PH 7,0] y se rompieron las células. por ultrasonido en hielo, el sobrenadante se extrajo por centrifugación de alta velocidad como el lisado de proteína completo. Luego se midió la concentración de proteína por BCA y se ajustó la concentración de proteína a 2 mg/ml. Al agregar ATP 5 mM, HSCoA 2 mM, DTT 10 mM y lactato 0,5 mM en el lisado de proteína completo como sistema de reacción, la reacción se realizó a 25 °C durante 30 min, después de apagar la reacción agregando un volumen igual de 10% (v/ v) ácido trifluoroacético y centrifugación, el sobrenadante se limpió con C18 ZipTips y los productos de lactil-CoA se analizaron por LC-MS/MS. Cada reacción se realizó tres repeticiones biológicas.

El ensayo de la actividad de YdiF CoA-transferasa se realizó como se describió previamente40, con ligeras modificaciones de la siguiente manera: las reacciones enzimáticas se llevaron a cabo en tampón de fosfato [50 mM NaH2PO4, 50 mM Na2HPO4 y 5 mM MgCl2, PH 7.0] que contenía 1 mM de acetoacetil- CoA y L-lactato o acetato 10 mM a 35 °C durante 20 min, y se inicializó añadiendo 7,5 μg de YdiF purificado. El volumen total de la mezcla de reacción fue de 50 μL. Las mezclas se preincubaron a la temperatura de reacción designada durante 5 min antes del inicio. Las reacciones se terminaron agregando un volumen igual de ácido trifluoroacético al 10 % (v/v) y centrifugando, el sobrenadante se limpió con C18 ZipTips y los productos de lactil-CoA se analizaron mediante LC-MS/MS. Cada reacción se realizó tres repeticiones biológicas.

Las muestras disueltas en agua se analizaron con un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) en modo ESI positivo utilizando los ajustes descritos anteriormente65,66. En detalle, las muestras se separaron con una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 μm), el gradiente de HPLC durante 15 min se estableció de la siguiente manera: flujo de 0,2 ml/min al 98 % de tampón A (agua con 5 mM acetato de amonio) y tampón B al 2 % (acetonitrilo al 95 % en agua con acetato de amonio 5 mM) durante 0 min, tampón A del 98 al 70 % durante 8 min, tampón A del 70 al 2 % durante 1 min, tampón A al 2 % durante 3 min, 2 a 98 % de tampón A durante 1 min, 98 % de tampón A durante 2 min. Se empleó un Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific) para el análisis de MS. El voltaje de pulverización se ajustó a 3,5 kV, el nivel de RF del embudo a 40 y la temperatura del tubo de transferencia de iones a 320 °C. Los datos fueron recopilados por Xcalibur (v.4.0.27.19). El analizador de masas orbitrap se utilizó como detector MS1 con una resolución de 120.000. El objetivo de AGC normalizado y el tiempo de inyección máximo se establecieron en 70 %/estándar para MS1. Se utilizó el detector MS2 con una resolución de 15.000. El ajuste de masa objetivo es lactil-CoA: 840.1436, acetil-CoA: 810.1330 y propionato CoA: 824.1487. La ventana de aislamiento de MS2 fue de 2 Da y la tolerancia de masa fue de 10 ppm, y se usó una energía de colisión HCD (disociación inducida por colisión de mayor energía) normalizada del 25 % para la fragmentación del precursor. La intensidad relativa de acil-CoA fue analizada por Xcalibur (v.4.0.27.19).

Este método fue descrito previamente8. En detalle, utilizando el calorímetro de titulación MicroCal PEAQ-ITC (Malvern Instruments) a 37 °C, la celda de reacción que contenía 50 μM de YiaC (o CobB) se tituló con 500 μM de actil-CoA diferente (o péptidos actilados). El volumen de la primera inyección fue de 0,5 μl de actil-CoA 500 μM (o péptidos actilados), y las siguientes 18 inyecciones fueron de 2,0 μl. La isoterma de unión se ajustó con el software Origin 8.0 (OriginLab). Cada grupo tuvo tres repeticiones biológicas.

La reacción de CobB se describió como anteriormente8. En detalle, los péptidos lactilados o acetilados (50 μM) con CobB 1 μM se incubaron en tampón de reacción CobB [Tris-HCl 50 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl2 1 mM, DTT 1 mM y NAD+ 1 mM (pH 8.5)] con o sin NAM 10 mM durante 2 h a 37 °C. Para la reacción de YiaC, se incubó el péptido no modificado (50 μM) con 5 μM de YiaC en tampón de reacción de YiaC [HEPES 100 mM, MgCl2 100 mM, KCl 10 mM y lactil-CoA o acetil-CoA 0,1 mM (PH = 7)] para 2 h a 37 °C. Después de la reacción de extinción con el mismo volumen de ácido trifluoroacético al 10 % (v/v), las muestras se centrifugaron durante 10 min a 18 000 × g para separar la enzima. Las muestras se separaron mediante un gradiente de HPLC de 28 min [gradiente lineal del 5 al 50 % de tampón B de HPLC (0,1 % de ácido fórmico en acetonitrilo) durante 3 min y luego al 100 % de tampón B durante 20 min y manteniendo el 100 % de tampón B durante 5 min].

Este método fue descrito previamente8. CobB se incubó con péptidos modificados (AETAEK(la)YGDEQVK o AETAEK(ac)YGDEQVK, de GpmA) en el tampón de reacción de CobB a 37 °C durante 2 min. Mientras tanto, YiaC se incubó con péptido no modificado (TICHDKAFVK, de PncB) en el tampón de reacción de YiaC. Las concentraciones de los péptidos fueron 5, 10, 16, 32, 60 y 285 uM y el tiempo de reacción fue de 1, 5, 15 y 30 min. Después de extinguir la reacción agregando un volumen igual de ácido trifluoroacético al 10 % (v/v) y limpiando con C18 ZipTips, los productos se analizaron con un espectrómetro de masas Autoflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics) con un modo reflejo de iones positivos equipado con iones retardados. extracción. Se analizaron por MS muestras de 0,1 μl mezcladas con ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB). Se utilizó un voltaje de aceleración de 20 kV. Los datos de MS se analizaron utilizando el software FlexAnalysis para el procesamiento espectral y la detección de picos. La cinética enzimática se analizó mediante el software Prism GraphPad 8.0.

Como se describió anteriormente8, E. coli MG1655, E. coli MG1655 ΔyiaC y ΔcobB se cultivaron a 37 °C en medio mínimo M9 con glucosa al 0,2 % y L-lisina (100 mg ml–1) o 13C6-lisina (100 mg ml–1). 1) que se muestra como la Fig. 3A. Las células se recolectaron durante la fase exponencial media y luego se sonicaron en hielo en PBS. Después de la centrifugación (20 000 g) a 4 °C durante 20 min, se recogió el sobrenadante. Se mezclaron cantidades iguales de proteínas de E. coli MG1655 y MG1655 ΔyiaC (o ΔcobB) y se precipitaron con ácido tricloroacético, los precipitados se disolvieron en NH4HCO3 100 mM con digestión durante la noche con tripsina (proporción de tripsina:proteína, 1:50). Los productos digeridos se incubaron con DTT 10 mM a 37 °C durante 1 h, seguido de alquilación con yodoacetamida 20 mM durante 45 min a temperatura ambiente en oscuridad. El exceso de yodoacetamida se bloqueó con cisteína 20 mM, se realizó una última digestión en una proporción de 1:100 durante 4 h. Los productos se desalinizaron con cartuchos SepPak C18 (Waters) y se secaron.

Los péptidos trípticos se volvieron a disolver en tampón NETN (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, Nonidet P-40 al 0,5 %) y se incubaron con perlas de agarosa con proteína A conjugada con anticuerpo antilactilisina (PTM Biolabs) a 4ºC. °C durante la noche, con rotación suave. Las perlas incubadas se lavaron tres veces con tampón NETN, dos veces con tampón ETN (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM y EDTA 1 mM) y tres veces con agua. Los péptidos unidos se eluyeron tres veces con ácido trifluoroacético al 1%. Finalmente, los eluatos se secaron y limpiaron con C18 ZipTips (Millipore Corp) antes del análisis nano-HPLC-MS/MS.

Los péptidos enriquecidos se analizaron por HPLC-MS/MS. Las muestras se reconstituyeron en ácido fórmico al 0,1 % y luego se inyectaron en un sistema nano-LC (EASY-nLC 1200, Thermo Fisher Scientific). Los péptidos se resolvieron mediante una columna C18 de 75 µm de diámetro interno y 25 cm de largo (3 µm, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch, Alemania) a un caudal de 300 nL/min. La elución en gradiente se realizó con tampón B de HPLC al 2-45 % (ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo al 80 %) durante 90 min, luego se pasó a tampón B al 100 % durante 15 min y se mantuvo con tampón B al 100 % durante 5 min. Se empleó un espectrómetro de masas Orbitrap Eclipse Tribrid con una interfaz FAIMS Pro (Thermo Fisher Scientific) para el análisis de MS. El voltaje de pulverización se ajustó a 2,1 kV, el nivel de RF del embudo a 40 y la temperatura del tubo de transferencia de iones a 320 °C. El análisis espectrométrico de masas se llevó a cabo en el modo de adquisición dependiente de datos (DDA) de los precursores más intensos, y los datos fueron recopilados por Xcalibur (v.4.0.27.19). Se configuró una combinación de CV FAIMS de −40 V/−60 V/−80 V (voltaje de compensación) para ejecutar el modo DDA durante un ciclo de 1 s para construir un ciclo grande de 3 s. El analizador de masas orbitrap se utilizó como detector MS1 con una resolución de 60 000 y un rango de exploración de 350–1600 m/z. El objetivo de AGC normalizado y el tiempo máximo de inyección se establecieron en 100 %/20 ms para MS1 y 200 %/30 ms para MS2. El analizador de masas orbitrap se utilizó como detector MS2 con una resolución de 17.500. Los iones precursores con cargas de +2 a +5 se aislaron para MS2 y el tiempo de exclusión dinámica se fijó en 50 s. La ventana de aislamiento de MS2 fue de 1,6 Da, y se utilizó una energía de colisión HCD (disociación inducida por colisión de mayor energía) normalizada del 30 % para la fragmentación del precursor.

Los criterios de búsqueda y filtro de la base de datos se realizaron como se describió anteriormente8. En detalle, MaxQuant (v.1.5.5.1) buscó datos sin procesar con la base de datos de proteínas UniProt E. coli K12 (Proteome ID: UP000474145) y una tasa general de descubrimiento falso para péptidos de menos del 1%. La búsqueda de secuencias peptídicas se estableció como especificidad de tripsina, dos escisiones perdidas para la longitud máxima del péptido y siete para la longitud mínima del péptido. La carbamidometilación en Cys se especificó como modificación fija. La lactilación de la lisina, la oxidación de la metionina y la acetilación del péptido N terminal se fijaron como modificaciones variables. Las tolerancias de masa se establecieron en ±10 ppm para iones precursores y ±0,02 Da para MS/MS. Se excluyeron además los péptidos lactilados con una puntuación <40 y una probabilidad de localización <0,75. Normalizamos todas las proporciones de péptido Kla por las proporciones de los niveles de proteína correspondientes.

La función GO (Ontología génica) en tres categorías BP (Procesos biológicos), CC (Componente celular) y MF (Funciones moleculares) enriquecimiento de la ruta analizada a través del paquete R/Bioconductor "clusterProfiler" (versión: 4.0)67. El valor de corte p = 0,05 y el valor de corte q = 0,2 se seleccionaron como criterios de corte. La significancia estadística se calculó con una prueba exacta de Fisher no apareada de dos caras. Se utilizó la corrección de Benjamini y Hochberg para ajustar los valores de p.

La YiaC recombinante purificada (15 μM) y las proteínas sustrato candidatas (GltA, PncB, 20 μM) se incubaron en tampón de reacción YiaC a 25 °C durante 10 h. El CobB recombinante purificado (15 μM) y los sustratos candidatos (GpmA, Mdh, PykF, 20 μM) se incubaron en tampón de reacción CobB a 25 °C durante 10 h. Los productos de reacción se analizaron mediante transferencia Western con antilactilación.

La actividad de PncB, PncBK381Q y PncBK381R purificados se midió como se describe68. En detalle, las proteínas purificadas se añadieron en el tampón de reacción [Tris-HCl 50 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 2,5 mM, ATP 1 mM, 25 g de albúmina de suero bovino, ácido nicotínico 1 mM y 5-fosforribosil-1 mM -pirofosfato (pH 7,5)] a 37 °C durante 2 h. Las reacciones se midieron por HPLC-MS/MS para detectar la producción de ácido nicotínico. La separación se realizó en un sistema Vanquish UHPLC (Thermo Fisher Scientific) con una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 μm). La fase móvil A fue ácido fórmico al 0,1% en agua. La fase móvil B fue ácido fórmico al 0,1% en metanol. La elución en gradiente (0,0 min, 0 % B; 2 min, 15 % B; 4 min, 100 % B; 5 min, 0 % B) se llevó a cabo con un caudal de 0,2 ml/min y una temperatura de columna constante de 20ºC. ºC El volumen de inyección fue de 2 μl. La detección de ácido nicotínico se realizó en un espectrómetro Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) operado con una sonda ESI. Los datos se adquirieron bajo los siguientes parámetros: gas envolvente ((N2), 35 Arb; gas auxiliar (N2), 10 Arb; voltaje de aspersión, 3500 V (modo positivo); y en temperatura del tubo de transferencia, 320 °C. Se tomó un SIM aplicado para la adquisición de datos.

La actividad de GpmA, GpmAK106Q y GpmAK106R purificados se midió como se describe69. En detalle, las GpmA, GpmAK106Q o GpmAK106R recombinantes purificadas se incubaron en tampón de reacción [Tris-HCl 100 mM, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, ADP 1 mM y NADH 0,2 mM (PH 7,0)] con enolasa 0,5 U, 0,5 U U piruvato quinasa, 0,1 U Ldh y 3-fosfoglicerato 2 mM durante 1 h a 30 °C, y las muestras sin GpmA sirvieron como blanco. La oxidación de NADH se midió como actividad GpmA por autofluorescencia en 340 nm.

La actividad de PykF, PykFK382Q y PykFK382R purificados se midió como se describe70. En detalle, PykF, PykFK382Q y PykFK382R recombinantes purificados se incubaron en tampón de reacción [Tris-HCl 50 mM, KCl 200 mM, MgCl2 15 mM, glicerol al 25 %, NADH 175 μM, fosfoenolpiruvato 5 mM, ADP 5 mM y 5 fructosa 1,6-bisfosfato mM (PH 8,0)] con 1 U de lactato deshidrogenasa durante 10 min a 32 °C, y las muestras sin PykF sirvieron como blanco. La oxidación de NADH se midió como actividad PykF por autofluorescencia en 340 nm.

Se recogieron E. coli en 5 ml de medio de cultivo. El ensayo se realizó con el kit de ensayo de actividad de piruvato quinasa (Sigma–Aldrich, MAK072) siguiendo el protocolo del fabricante.

Como se describió anteriormente8, las cepas se cultivaron en medio LB durante la noche, luego se diluyeron 1:1000 en medio LB o M9 (con 1% de glucosa o 1% de piruvato) y se incubaron a 37 °C con placas de 96 pozos, y cada cepa se agregó a tres pozos. La absorbancia a 600 nm al inicio se fijó como blanco y se midió cada hora usando un espectrofotómetro. Todas las curvas dinámicas de crecimiento se dibujaron utilizando Origin 8.0.

Realizamos dos sistemas PykF/PykF K382la-FBP para simulaciones de dinámica molecular (MD) de 100 ns tres veces. Las coordenadas iniciales de los sistemas se obtuvieron a partir de estructuras cristalinas de rayos X con PDB ID 1PKY. Todas las simulaciones de MD se realizaron utilizando GROMACS 2019.6 (establezca los valores predeterminados como parámetros). El paquete de software con campo de fuerza Gromos 54A7 se aplicó para describir PykF, y el campo de fuerza Gromos 54A8 se usó para PykF K382la. Gromos 54A7 y Gromos 54A8 se descargaron de Vienna-PTM. Los campos de fuerza del ligando FBP se obtuvieron de la base de datos Automated Topology Builder (ATB) (Versión 3.0) (https://atb.uq.edu.au/molecule.py?molid=1134439#panel-md). Los sistemas complejos se analizaron mediante simulaciones MD en una caja cúbica con el modelo de agua SPC. Para neutralizar los sistemas, se agregaron aleatoriamente iones de cloruro y sodio a la caja de simulación. Durante las simulaciones MD, las interacciones culómbicas de largo alcance se manejaron utilizando el método Ewald de malla de partículas (PME). La minimización energética de todo el sistema se llevó a cabo durante 50.000 pasos con el método de descenso más pronunciado. Posteriormente, se realizaron 500 ps de NVT (temperatura de Berendsen acoplada con número de partículas, volumen y temperatura constantes) y 500 ps de NPT (presión de Parrinello-Rahman acoplada con número de partículas, presión y temperatura constantes) para mantener la estabilidad del sistema. (300 K, 1 barra). Después de estabilizar todas las propiedades termodinámicas, el sistema molecular se simuló durante 100 ns con un intervalo de tiempo de 2 fs, mientras que las coordenadas de todos los modelos se almacenaron cada 2 ps. Las desviaciones cuadráticas medias (RMSD) y las distancias entre el átomo de nitrógeno de la cadena lateral K382 y el átomo de carbono central de FBP se evaluaron utilizando las herramientas de análisis dentro de GROMACS 2019.6. Toda la visualización se realiza a través del software PyMOL y Xmgrace 2.3.7. Los archivos de códigos, los archivos de parámetros de entrada y los archivos de configuración inicial y final relacionados con dos sistemas de simulación MD (PykF-FBP y PykF K382la-FBP) se proporcionan como datos de origen de la simulación MD.

Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo y/o en los Materiales Complementarios. Se pueden solicitar a los autores datos adicionales relacionados con este documento. Los datos de proteómica de MS se han depositado en ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) a través del repositorio de socios de iProX con el identificador de conjunto de datos PXD030345 y PXD030346. Los campos de fuerza del ligando FBP se obtuvieron de la base de datos Automated Topology Builder (ATB) (Versión 3.0) (https://atb.uq.edu.au/molecule.py?molid=1134439#panel-md). Se usó la siguiente estructura cristalina para el análisis PDB ID 1PKY. Los archivos de códigos, los archivos de parámetros de entrada y los archivos de configuración inicial y final relacionados con dos sistemas de simulación MD (PykF-FBP y PykF K382la-FBP) se proporcionan como datos de origen de la simulación MD. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Sabari, BR, Zhang, D., Allis, CD y Zhao, Y. Regulación metabólica de la expresión génica a través de acilaciones de histonas. Nat. Rev Mol. Biol celular. 18, 90–101 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Choudhary, C., Weinert, BT, Nishida, Y., Verdin, E. & Mann, M. El panorama creciente de la acetilación de lisina vincula el metabolismo y la señalización celular. Nat. Rev Mol. Biol celular. 15, 536–550 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ren, J., Sang, Y., Lu, J. & Yao, YF Acetilación de proteínas y su papel en la virulencia bacteriana. Tendencias Microbiol. 25, 768–779 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, R., Chen, P., Gu, J. y Deng, JY La acetilación reduce la capacidad de CheY para autofosforilarse. FEMS Microbiol. Letón. 347, 70–76 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Liang, W., Malhotra, A. & Deutscher, MP La acetilación regula la estabilidad de una proteína bacteriana: modificación de la RNasa dependiente de la etapa de crecimiento R. Mol. Celda 44, 160–166 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Carabetta, VJ, Greco, TM, Cristea, IM & Dubnau, D. YfmK es una N(epsilon)-lisina acetiltransferasa que acetila directamente la proteína similar a histona HBsu en Bacillus subtilis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 116, 3752–3757 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, H. et al. Identificación sistemática de proteínas lisina 2-hidroxiisobutiriladas en Proteus mirabilis. mol. Proteoma celular. 17, 482–494 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Dong, H. et al. Des-2-hidroxiisobutirilación de proteína lisina por CobB en procariotas. ciencia Adv. 5, eaaw6703 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dong, H. et al. TmcA funciona como una lisina 2-hidroxiisobutiriltransferasa para regular la transcripción. Nat. química Biol. 18, 142–151 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zheng, Y. et al. Efectos de la lisina 2-hidroxiisobutirilación sobre la actividad FabI bacteriana y la resistencia al triclosán. Biochimie 182, 197–205 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, D. et al. Regulación metabólica de la expresión génica por lactilación de histonas. Naturaleza 574, 575–580 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Irizarry-Caro, RA et al. El adaptador de señalización TLR BCAP regula la transición de macrófagos inflamatorios a reparadores al promover la lactilación de histonas. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 117, 30628–30638 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dichtl, S. et al. El lactato y la IL6 definen caminos separables de adaptación metabólica inflamatoria. ciencia Adv. 7, eabg3505 (2021).

Cui, H. et al. Los miofibroblastos de pulmón promueven la actividad profibrótica de los macrófagos a través de la lactilación de histonas inducida por lactato. Soy. J. Respir. Mol celular. Biol. 64, 115–125 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, L. et al. Glis1 facilita la inducción de pluripotencia a través de una cascada de señalización epigenoma-metaboloma-epigenoma. Nat. metab. 2, 882–892 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jiang, J. et al. El lactato modula el metabolismo celular a través de la expresión génica mediada por la lactilación de histonas en el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Frente. oncol. 11, 647559 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Yu, J. et al. La lactilación de histonas impulsa la oncogénesis al facilitar la expresión de la proteína lectora m(6)A YTHDF2 en el melanoma ocular. Genoma Biol. 22, 85 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hagihara, H. et al. Lactilación de proteínas inducida por excitación neural. Rep. Celular 37, 109820 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, K. et al. El lactato promueve la lactilación, acetilación y liberación exosomal de macrófagos HMGB1 en la sepsis polimicrobiana. La muerte celular difiere. 29, 133–146 (2021).

Meng, X., Baine, JM, Yan, T. & Wang, S. Análisis completo de la lactilación de lisina en granos de arroz (Oryza sativa). J. Química alimentaria agrícola. 69, 8287–8297 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gao, M., Zhang, N. & Liang, W. Análisis sistemático de la lactilación de lisina en el patógeno fúngico vegetal Botrytis cinerea. Frente. Microbiol. 11, 594743 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhao, S., Zhang, X. y Li, H. Más allá de la acetilación de histonas: escritura y borrado de acilaciones de histonas. actual Opinión Estructura. Biol. 53, 169–177 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wang, M. & Lin, H. Comprender la función de las sirtuinas de mamíferos y la acilación de lisina de proteínas. año Rev. Bioquímica. 90, 245–285 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Narita, T., Weinert, BT y Choudhary, C. Funciones y mecanismos de acetilación de proteínas no histonas. Nat. Rev. Padre. mol. Biol celular. 20, 156–174 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Moreno-Yruela, C. et al. Las histonas desacetilasas de clase I (HDAC1-3) son histonas lisina desacetilasas. ciencia Adv. 8, eabi6696 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dancy, BM & Cole, PA Acetilación de proteína lisina por p300/CBP. química Rev. 115, 2419–2452 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. KAT2A junto con el complejo α-KGDH actúa como una histona H3 succiniltransferasa. Naturaleza 552, 273–277 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sabari, BR et al. El crotonil-CoA intracelular estimula la transcripción a través de la crotonilación de histonas catalizada por p300. mol. Celda 58, 203–215 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rardín, MJ et al. SIRT5 regula el succiniloma de lisina mitocondrial y las redes metabólicas. Metab. celular 18, 920–933 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wei, W. et al. Las histonas desacetilasas de clase I son las principales histonas decrotonilasas: evidencia de la función crítica y amplia de la crotonilación de histonas en la transcripción. Resolución celular 27, 898–915 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Christensen, DG et al. Mecanismos, detección y relevancia de la acetilación de proteínas en procariotas. mBío. 10, e02708-18 (2019).

Christensen, DG et al. Identificación de nuevas proteínas lisina acetiltransferasas en Escherichia coli. mBío. 9, e01905-18 (2018).

Starai, VJ, Celic, I., Cole, RN, Boeke, JD y Escalante-Semerena, JC Activación de acetil-CoA sintetasa dependiente de Sir2 por desacetilación de lisina activa. Ciencia 298, 2390–2392 (2002).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Colak, G. et al. Identificación de sustratos de succinilación de lisina y la enzima reguladora de succinilación CobB en Escherichia coli. mol. Proteoma celular. 12, 3509–3520 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Frye, RA Clasificación filogenética de proteínas similares a Sir2 procariotas y eucariotas. Bioquímica Biografía. Res. común 273, 793–798 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Weinert, BT et al. Acetil-fosfato es un determinante crítico de la acetilación de lisina en E. coli. mol. Celda 51, 265–272 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Megraw, RE, Reeves, HC & Ajl, SJ Formación de lactil-coenzima A y piruvil-coenzima A a partir de ácido láctico por Escherichia coli. J. Bacteriol. 90, 984–988 (1965).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prabhu, R., Altman, E. & Eiteman, MA Metabolismo de lactato y acrilato por Megasphaera elsdenii en condiciones de estado estacionario y por lotes. aplicación Reinar. Microbiol. 78, 8564–8570 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, JW & Trinh, CT Biosíntesis microbiana de ésteres de lactato. Biotecnología. Biocombustibles 12, 226 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhang, X. et al. Detección, expresión, purificación y caracterización de CoA-transferasas para la generación de lactoil-CoA. J. Ind. Microbiol. Biotecnología. 46, 899–909 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Dyda, F., Klein, DC & Hickman, AB N-acetiltransferasas relacionadas con GCN5: una descripción general estructural. año Rev. Biophys. Biomol. Estructura. 29, 81–103 (2000).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goncheva, MI, Chin, D. & Heinrichs, DE Biosíntesis de nucleótidos: la base de la patogénesis bacteriana. Tendencias Microbiol. 30, 793–804 (2022).

Sellés Vidal, L., Murray, JW & Heap, JT Presión evolutiva selectiva versátil usando defecto sintético en el metabolismo universal. Nat. común 12, 6859 (2021).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Q. et al. La acetilación de las enzimas metabólicas coordina la utilización de la fuente de carbono y el flujo metabólico. Ciencia 327, 1004–1007 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monahan, LG, Hajduk, IV, Blaber, SP, Charles, IG y Harry, EJ Coordinación de la división celular bacteriana con la disponibilidad de nutrientes: un papel para la glucólisis. mBio 5, e00935–00914 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Collins, RA, McNally, T., Fothergill-Gilmore, LA y Muirhead, H. Un mutante de interfaz de subunidad de piruvato quinasa de levadura requiere el activador alostérico fructosa 1,6-bisfosfato para la actividad. Bioquímica J. 310, 117–123 (1995).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siddiquee, KA, Arauzo-Bravo, MJ & Shimizu, K. Efecto de una mutación knockout de la piruvato quinasa (gen pykF) sobre el control de la expresión génica y los flujos metabólicos en Escherichia coli. FEMS Microbiol. Letón. 235, 25–33 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mattevi, A. et al. Estructura cristalina de la piruvato quinasa tipo I de Escherichia coli: base molecular de la transición alostérica. Estructura 3, 729–741 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Valentini, G. et al. La regulación alostérica de la piruvato quinasa. J. Biol. química 275, 18145–18152 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Donovan, KA et al. Dinámica conformacional y alostería en piruvato quinasa. J. Biol. química 291, 9244–9256 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rabinowitz, JD & Enerback, S. Lactato: el patito feo del metabolismo energético. Nat. metab. 2, 566–571 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Certo, M., Tsai, CH, Pucino, V., Ho, PC y Mauro, C. Modulación de lactato de las respuestas inmunitarias en microambientes inflamatorios versus tumorales. Nat. Rev. Inmunol. 21, 151–161 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, F. & Simon, MC Las células cancerosas no viven solas: comunicación metabólica dentro de microambientes tumorales. desarrollo Celda 54, 183–195 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Teusink, B. & Smid, EJ Estrategias de modelado para la explotación industrial de bacterias del ácido láctico. Nat. Rev. Microbiol. 4, 46–56 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jiang, T., Gao, C., Ma, C. y Xu, P. Utilización de lactato microbiano: enzimas, patogénesis y regulación. Tendencias Microbiol. 22, 589–599 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Brown, AJ, Brown, GD, Netea, MG & Gow, NA El metabolismo impacta sobre la inmunogenicidad y patogenicidad de Candida en múltiples niveles. Tendencias Microbiol. 22, 614–622 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Olive, AJ & Sassetti, CM Diafonía metabólica entre huésped y patógeno: detección, adaptación y competencia. Nat. Rev. Microbiol. 14, 221–234 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Oliphant, K. & Allen-Vercoe, E. Metabolismo de macronutrientes por el microbioma intestinal humano: principales subproductos de la fermentación y su impacto en la salud del huésped. Microbioma 7, 91 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Carabetta, VJ, Greco, TM, Cristea, IM & Dubnau, D. YfmK es una N-epsilon-lisina acetiltransferasa que acetila directamente la proteína similar a histona HBsu en Bacillus subtilis. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 116, 3752–3757 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parks, AR & Escalante-Semerena, JC Modulación de la actividad de la sirtuina desacilasa CobB bacteriana por acetilación N-terminal. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 117, 15895–15901 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weinert, BT et al. Dinámica de acetilación y estequiometría en Saccharomyces cerevisiae. mol. sist. Biol. 10, 716 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Gao, X. et al. El acetato funciona como un metabolito epigenético para promover la síntesis de lípidos en condiciones de hipoxia. Nat. común 7, 11960 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, H., Kang, J., Qi, Q. y Chen, G. Producción de lactato en Escherichia coli mediante regulación redox genética y fisiológicamente. aplicación Bioquímica Biotecnología. 164, 162–169 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jeter, VL & Escalante-Semerena, JC La acetilación de lisina reversible dependiente de sirtuina controla la actividad de la acetil coenzima A sintetasa en Campylobacter jejuni. J. Bacteriol. 203, e0033321 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Frey, AJ et al. La espectrometría de masas de alta resolución LC-quadrupole/Orbitrap permite la cuantificación simultánea resuelta con isótopos estables y el marcaje isotópico con ¹³C de tioésteres de acil-coenzima A. Anal. Bioanal. química 408, 3651–3658 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Varner, EL et al. Cuantificación de lactoil-CoA (lactil-CoA) mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida en células y tejidos de mamíferos. Abrir Biol. 10, 200187 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, T. et al. clusterProfiler 4.0: una herramienta de enriquecimiento universal para interpretar datos ómicos. Innovación 2, 100141 (2021).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Hara, N. et al. Elevación de los niveles de NAD celular por el ácido nicotínico y la participación de la fosforribosiltransferasa del ácido nicotínico en células humanas. J. Biol. química 282, 24574–24582 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hitosugi, T. et al. La fosforilación de Tyr26 de PGAM1 proporciona una ventaja metabólica a los tumores al estabilizar la conformación activa. Nat. común 4, 1790 (2013).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Dombrauckas, JD, Santarsiero, BD & Mesecar, AD Base estructural para la regulación y catálisis alostérica de la piruvato quinasa M2 tumoral. Bioquímica 44, 9417–9429 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 22074103 a KZ, 21874100 a KZ, 22274114 a KZ, 32101023 a HD, 21904097 a GZ y 22004091 a XB), Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (No. 2022A1515011810 a HD), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No. 2021M702067 a HD), Comisión Municipal de Ciencia y Tecnología de Tianjin (Nos. 19JCZDJC35000 a KZ y 19JCQNJC08900 a ST), y Beca de Equipo Innovador del Departamento de Educación de Guangdong (No. 2021KCXTD005 a EL).

Estos autores contribuyeron igualmente: Hanyang Dong, Jianji Zhang.

La provincia y el ministerio copatrocinaron el Centro de Innovación Colaborativa para Epigenética Médica, Laboratorio Clave de Enfermedades y Microambientes Inmunitarios (Ministerio de Educación), Laboratorio Clave de Epigenética Médica de Tianjin, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Universidad Médica de Tianjin , 300070, Tianjín, China

Hanyang Dong, Jianji Zhang, Hui Zhang, Yue Han, Chen Chen, Xiaoxia Tan, Siyu Wang, Xue Bai, Guijin Zhai, Shanshan Tian, ​​Tao Zhang y Kai Zhang

Laboratorio Provincial Clave de Enfermedades Infecciosas e Inmunopatología Molecular de Guangdong, Instituto de Patología Oncológica, Facultad de Medicina de la Universidad de Shantou, 515041, Shantou, Guangdong, China

Hanyang Dong, Enmin Li y Liyan Xu

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Nankai, 300071, Tianjin, China

Congcong Lu

Jingjie PTM Biolab (Hangzhou) Co. Ltd, Hangzhou, 310018, Zhejiang, China

Zhongyi Cheng

El Laboratorio Clave de Biología Molecular para la Alta Incidencia de Cáncer Área Costera de Chaoshan, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Shantou, 515041, Shantou, Guangdong, China

Enmin Li

Laboratorio clave de funciones y enfermedades de la retina de Tianjin, Instituto del ojo y Escuela de optometría, Hospital oftalmológico de la Universidad médica de Tianjin, Universidad médica de Tianjin, 300070, Tianjin, China

kai zhang

Laboratorio Clave de Enfermedades Digestivas de Tianjin, Departamento de Gastroenterología y Hepatología, Hospital General de la Universidad Médica, Universidad Médica de Tianjin, 300070, Tianjin, China

kai zhang

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

Experimentos supervisados ​​KZ y LX. HD y KZ diseñaron experimentos, analizaron los datos y escribieron el manuscrito. HD y JZ llevaron a cabo cultivos celulares, ensayos enzimáticos, estudios de metabolómica y análisis de biología molecular. HD, JZ, CL, HZ y XB llevaron a cabo el estudio proteómico y el análisis de espectrometría de masas. GZ y CC prepararon reactivos para el estudio de las funciones de las proteínas. HD, JZ, YH, XT, SW, ST, ZC, TZ, EL, LX y KZ llevaron a cabo la recopilación, el análisis y la interpretación de datos. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Liyan Xu o Kai Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Dong, H., Zhang, J., Zhang, H. et al. YiaC y CobB regulan la lactilación de lisina en Escherichia coli. Nat Comun 13, 6628 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34399-y

Descargar cita

Recibido: 13 enero 2022

Aceptado: 20 de octubre de 2022

Publicado: 04 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34399-y

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.