Transformación de hojas para una integración aleatoria eficiente y una modificación del genoma específica en maíz y sorgo

Nov 12, 2023

Nature Plants volumen 9, páginas 255–270 (2023)Citar este artículo

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La transformación en especies de gramíneas se ha basado tradicionalmente en embriones inmaduros y, por lo tanto, se ha limitado a unos pocos cultivos importantes de Poaceae. Se han explorado otros explantes de transformación, incluido el tejido de la hoja, pero con bajas tasas de éxito, que es uno de los principales factores que obstaculizan la amplia aplicación de la edición del genoma para la mejora de cultivos. Recientemente, la transformación de hojas utilizando los genes morfogénicos Wuschel2 (Wus2) y Babyboom (Bbm) se ha utilizado con éxito para la mutagénesis mediada por Cas9, pero las aplicaciones complejas de edición del genoma, que requieren la detección de un gran número de plantas regeneradas, siguen siendo difíciles de alcanzar. Aquí demostramos que la expresión mejorada de Wus2/Bbm mejora sustancialmente la transformación de hojas en maíz y sorgo, lo que permite la recuperación de plantas con deserciones de genes mediadas por Cas9 e inserción de genes específicos. Además, utilizando una construcción Wus2/Bbm optimizada para maíz, se produjeron con éxito callos embriogénicos y plántulas regeneradas en ocho especies que abarcan cuatro subfamilias de gramíneas, lo que sugiere que esto puede conducir a un método familiar universal para la transformación y la edición del genoma en las Poaceae.

La transformación genética y la regeneración de plantas con nuevos fenotipos fue un gran avance en la biotecnología vegetal temprana y generó grandes expectativas entre los científicos de plantas. Sin embargo, poco después del primer informe de transformación exitosa de Nicotiana tabacum utilizando la infección por Agrobacterium1, se hizo evidente que el tabaco es la excepción y que el aprovechamiento del potencial de esta tecnología en los principales cultivos se vería impedido por una mala transformación y/o regeneración2. Las mejoras graduales en la transformación han continuado para varias especies de plantas, pero para muchas de ellas este proceso se ha visto limitado por la obstinación en la manipulación in vitro. Encontrar la mejor combinación de método de transformación y sistema de cultivo para cada cultivo ha requerido la evaluación de diferentes explantes que van desde células individuales como protoplastos; a tejidos embrionarios como meristema, escutelo o cotiledones; a tejidos derivados de plántulas tales como meristemos apicales/axilares, hipocótilo u hojas; y finalmente a las alternativas in planta.

El desarrollo reciente de tecnologías de edición del genoma basadas en CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas)-Cas (asociadas a CRISPR) exacerba aún más la necesidad de procesos de transformación mejorados y eficientes3. Las nucleasas Cas guiadas por ARN generan roturas de doble cadena específicas en el genoma, que se reparan a través de vías de unión de extremos no homólogos (NHEJ) o de reparación dirigida por homología (HDR). NHEJ es propenso a la reparación imperfecta y, a menudo, da como resultado pequeñas inserciones o eliminaciones, mientras que HDR se puede usar para introducir modificaciones predefinidas al proporcionar una plantilla de ADN donante con regiones de homología con el sitio de ruptura de doble cadena.

Desde los primeros informes de edición del genoma mediada por Cas9 en tabaco, Arabidopsis y arroz, la lista de especies de plantas editadas ha seguido ampliándose4,5,6,7. Sin embargo, mientras que la mutagénesis mediada por NHEJ y las eliminaciones de genes ahora son una práctica común, otros tipos de ediciones del genoma (como inserciones de genes mediadas por HDR, eliminaciones a gran escala, inversiones y translocaciones) ocurren con frecuencias mucho más bajas, lo que requiere una gran cantidad de plantas. para ser regenerado y examinado para encontrar uno con la modificación deseada. Esta limitación es válida para la mayoría de las especies de Poaceae (por ejemplo, arroz, maíz, trigo, cebada, sorgo y mijo perla de indica), donde los métodos de transformación se basan en embriones inmaduros y, en general, siguen siendo muy dependientes de la especie y/o el genotipo. limitando su despliegue a gran escala. Además, un suministro constante durante todo el año de embriones inmaduros como un explante de transformación requiere una infraestructura de invernadero que hace que sea prohibitivo en cuanto a recursos y costos para la mayoría de las instituciones académicas. En consecuencia, las instalaciones de servicios de transformación se han convertido en una necesidad8. Por lo tanto, los procesos de transformación mejorados con altas frecuencias de regeneración se convierten en un requisito previo para estas complejas aplicaciones de edición del genoma9.

Un gran avance en la transformación basada en embriones inmaduros se produjo con el uso de los genes morfogénicos Wuschel2 (Wus2) y Babyboom (Bbm), que permiten la regeneración de plantas a altas frecuencias a partir de genotipos de maíz recalcitrantes10,11. El uso de Wus2/Bbm también mejoró la transformación en tres variedades de sorgo, Tx430, Tx623 y P898012 (refs. 12,13), y dos líneas públicas de maíz, FFMM14 y B104 (ref.15). Además, se ha demostrado que la expresión de Wus2 sola es eficaz para mejorar la transformación en maíz16 y la edición del genoma en sorgo17. Tras estos informes, se han identificado y utilizado con resultados similares otros genes que estimulan la división celular y la formación de tejido embriogénico. Por ejemplo, Grf4/Gif1 (ref. 18) y Wox5 (ref. 19) han mejorado la transformación y regeneración de embriones inmaduros en una amplia gama de cultivares de trigo. Sin embargo, para algunas especies de gramíneas (como el bambú, la setaria, el teff y el mijo pequeño), las semillas y los embriones inmaduros son simplemente demasiado pequeños para aislarlos de manera eficiente, mientras que otros cultivos (como la caña de azúcar y el banano) se propagan vegetativamente.

Varios grupos de investigación han explorado explantes de partida alternativos para la transformación de especies de gramíneas. A excepción del arroz japonica, que se transforma fácilmente a través de la infección por Agrobacterium de semillas maduras20, estos grupos han utilizado embriones derivados de semillas maduras21,22 o bases de hojas derivadas de plántulas23,24,25,26 para establecer primero cultivos de callos, que luego se utilizan como objetivo de la infección por Agrobacterium. El uso de Wus2 y Bbm amplió la lista de explantes alternativos para la transformación, como lo demuestra la regeneración de plantas transgénicas fértiles utilizando rebanadas de embriones maduros y segmentos de tejido de la base de la hoja en maíz10. Utilizando construcciones desarrolladas por Lowe et al.10, informes recientes han demostrado la transformación de la base de la hoja en switchgrass27 y la mutagénesis génica exitosa en Eragrostis tef28. Sin embargo, se necesitan más mejoras para aumentar la frecuencia de transformación, expandir el método dentro de la familia de las gramíneas y, finalmente, habilitar aplicaciones de edición del genoma más complejas.

Aquí describimos una nueva combinación de promotores que regulan la expresión de Wus2 y Bbm que estimulan la formación rápida directa de embriones somáticos y la regeneración de plantas T0 después de la infección por Agrobacterium del tejido foliar temprano derivado de plántulas de maíz y sorgo. También demostramos que este método mejorado de transformación de hojas permite modificaciones del genoma mediadas por Cas9, incluida la eliminación de genes y la inserción de genes específicos en el maíz. Finalmente, utilizando un diseño de vectores, un medio y un protocolo de transformación de hojas optimizado para maíz, demostramos la transformación de hojas en una variedad de especies de pastos, incluido el arroz (tanto índica como japonica), teff, pasto varilla, mijo perla, mijo cola de zorra, cebada y centeno.

Nuestro trabajo anterior con Wus2/Bbm estableció tanto el punto de partida como nuestro nuevo objetivo para la optimización de la transformación de hojas. Lowe et al.10 determinaron que el uso de Wus2 regulado por el promotor Nopaline synthase (Nos) y Bbm regulado por Ubiquitin (Ubi) produjo un callo embriogénico que después de 10-12 semanas podría producir plantas transgénicas para genotipos de maíz recalcitrantes (nuestro punto de partida) . Más tarde, Lowe et al.11 demostraron que al proporcionar un pulso morfogénico utilizando un conjunto diferente de promotores que regulan la expresión de Wus2 y Bbm (Axig1 y Pltp, respectivamente), los embriones inmaduros producirían rápidamente (en 7 a 14 días) embriones somáticos que podrían ser regenerado en plantas T0. Por lo tanto, nuestro nuevo objetivo para la transformación de hojas fue la identificación y evaluación de promotores y condiciones de cultivo de tejidos que permitieran una rápida transformación de hojas y regeneración de plantas con eficiencias que permitieran aplicaciones complejas de edición de genomas, como la inserción de genes dirigidos. Los componentes genéticos utilizados en los casetes de expresión dentro del ADN de transferencia (T-DNA) en diferentes plásmidos se enumeran en la Tabla complementaria 1.

Para evaluar las combinaciones de promotores con el objetivo de mejorar y acelerar la respuesta embriogénica en las hojas, utilizamos la cepa LBA4404 TD THY de Agrobacterium tumefaciens que alberga el plásmido auxiliar PHP71539 (pVIR9; ref. 29) y un vector donante binario (ver PHP96037 como ejemplo general; Fig. 1a) para transformar tejido foliar de la parte inferior de plántulas de la línea de maíz Pioneer PH1V69. La cantidad de callos o embriones somáticos directos producidos a partir de fragmentos de hojas se usó como criterio para evaluar varias combinaciones de promotores que regulan la expresión de Wus2 y Bbm (la puntuación se describe en la Fig. 2). Los resultados de estos experimentos se resumen para PH1V69 consanguíneo de maíz en la Tabla 1. En general, la expresión más débil de Wus2/Bbm no produjo embriogénesis en el tejido de la hoja, mientras que diferentes combinaciones de promotores más fuertes y/o constitutivos produjeron una respuesta de embriogénesis creciente.

a, vectores de ADN-T utilizados en experimentos de integración aleatoria: PHP86491 es un vector de control que contiene solo genes marcadores visibles (ZsGreen1) y seleccionables (Hra); PHP96037 y PHP97334 son vectores que contienen genes morfogénicos (Wus2 y Bbm), Cre recombinasa, un gen marcador visible (ZsGreen1) y Hra o NptII como gen marcador seleccionable, respectivamente. b, vector de ADN-T utilizado para el abandono de Wx1 mediado por Cas9 que contiene genes morfogénicos (Wus2 y Bbm), recombinasa Cre, Cas9 y dos casetes de expresión de ARNg, genes marcadores visibles (ZsGreen1) y seleccionables (NptII). c, Representación del experimento de inserción de genes dirigidos mediado por Cas9, que incluye (i) el vector T-DNA que contiene los genes morfogénicos (Wus2 y Bbm), Cre recombinase, Cas9 y casetes de expresión de gRNA, un gen marcador seleccionable (Hra), el donante casete que comprende el segundo gen marcador seleccionable (NptII), brazos de homología (HR1 y HR2) flanqueados por sitios de corte Cas9 (o sitios diana (TS)) y un gen marcador visible (ZsGreen1); (ii) la inserción del gen dirigido a través de HDR tras la escisión Cas9 del sitio objetivo genómico y ambos sitios objetivo dentro del T-DNA para liberar la secuencia del donante y (iii) el locus de inserción del gen objetivo con las posiciones de los pares de cebadores de PCR utilizados para detectar el uniones HR1 (1) y HR2 (2), y el producto de PCR larga en toda la inserción (3). RB y LB = las secuencias de los bordes derecho e izquierdo del T-DNA de Agrobacterium.

Se sabía por trabajos anteriores que la combinación de los promotores Axig1 y Pltp produce un pulso de expresión de Wus2 y Bbm, respectivamente, que era lo suficientemente fuerte en el epitelio escutelar del embrión inmaduro para estimular los embriones somáticos en un plazo de 7 a 14 días11. Sin embargo, en el tejido de la hoja, esta combinación (PHP83652) solo produjo pequeños grupos de células fluorescentes sin crecimiento adicional. Del mismo modo, dos construcciones que utilizan promotores regulados diurnamente (Sweet 11 o Diurnal 10) que impulsan la expresión de Wus2 junto con Ubi::Bbm no produjeron una respuesta de crecimiento (PHP96730 y PHP96731, respectivamente). Se observó una respuesta de crecimiento débil (+) con una variedad de combinaciones de promotores, que incluían un promotor inducible por auxina (8xDR5 en PHP81855 y PHP94636); promotores fotosintéticos tales como PepC1 (PHP95073), Rubisco Ssu (PHP95205) y Cab (PHP95394); promotores diurnos tales como Diurnal 12 (PHP95074) y Diurnal 11 (PHP96032); o dos promotores virales, el virus del mosaico de las venas de la mandioca (CSVMV) (PHP95393) y el virus baciliforme de la caña de azúcar (SCBV) (PHP95987), que en general son demasiado transitorios o demasiado débiles para provocar un rápido crecimiento embriogénico. Se observó una respuesta de crecimiento de callo más consistente (++) con (1) Wus2 expresado constitutivamente con expresión Bbm transitoria (PHP81857), (2) Wus2 transitorio con Bbm constitutivo (PHP94715, PHP98564 y PHP98565) o (3) nuestros números originales: Combinación :Wus2/Ubi::Bbm (PHP81858 o PHP97978). Tres combinaciones de promotores para impulsar la expresión respectiva de Wus2 y Bbm (Actin/Ubi en PHP95385, Gos2/Ubi en PHP96031 o Ubi/3xEnh–Ubi en PHP97417; 3xEnh, tres potenciadores virales consecutivos de Figwart Mosaic Virus (FMV), Peanut Chlorotic Streak (PCSV) y el virus del mosaico de Mirabilis (MMV); Tabla complementaria 1) dieron como resultado un crecimiento embriogénico más rápido con cierta formación de embriones somáticos dentro de los 14 días. Finalmente, varios promotores constitutivos para Wus2 (Ubi, Actin y Nos) junto con 3xEnh–Ubi::Bbm (PHP93925 a PHP103735) (Tabla 1) produjeron una rápida formación de embriones somáticos en 60–80% de los fragmentos de hojas. La presencia del promotor 3xEnh-Ubi que impulsa la expresión de Bbm (PHP97334 y PHP96277) aumentó significativamente los niveles de transcripción no solo de Bbm sino también de Wus2 en comparación con PHP97978 y PHP95385 con Ubi :: Bbm (Tabla complementaria 2). También observamos que tener cualquier casete de expresión aguas arriba de Wus2 redujo la respuesta de crecimiento, como se indica en dos ejemplos específicos. En primer lugar, PHP97335 con Ubi::NptII (neomicina fosfotransferasa II) corriente arriba de Nos::Wus2 produjo una respuesta de crecimiento moderada, mientras que PHP97334 (donde Ubi::NptII está corriente abajo) generó una fuerte respuesta embrionaria somática rápida; en segundo lugar, PHP93738 con un promotor Heat Shock Protein17 (Hsp17) que impulsaba Cre corriente arriba de Actin::Wus2 dio como resultado una respuesta de callo moderada, mientras que PHP95385 (donde Hsp17::Cre está corriente abajo) produjo una respuesta embrionaria somática rápida. De todas las construcciones probadas, PHP96037 y PHP97334, ambas con Nos::Wus2 y 3xEnh–Ubi::Bbm pero con dos marcadores seleccionables diferentes, demostraron consistentemente una respuesta de crecimiento fuerte y rápida y fueron elegidas para experimentos posteriores.

Las imágenes muestran ejemplos de puntuación del crecimiento de células fluorescentes y embriones somáticos 14 días después de la infección por Agrobacterium. Las imágenes son representativas de tres experimentos independientes. Barra de escala = 1 mm. NA = no aplicable ya que no creció ningún tejido resultante.

Para evaluar el proceso general de transformación del tejido de la hoja (incluida la regeneración de la planta T0), los vectores binarios que contienen Wus2, Bbm, Cre, un gen marcador fluorescente (ZsGreen1) y un gen marcador seleccionable (Highly-Resistant ZmAls (Hra) (PHP96037) o NptII (PHP97334)) se compararon con un vector de control (PHP86491) que carecía de Wus2/Bbm (Fig. 1a). Se introdujeron sitios LoxP, lo que permitió la escisión de los casetes de expresión Wus2/Bbm y Cre antes de la regeneración de la planta T0. La preparación de las plántulas y el proceso de transformación se muestran en la Fig. 3. La semilla esterilizada superficialmente se hizo germinar en un medio solidificado con agar durante 14 días (Fig. 3a–c), y luego aproximadamente 3 cm de tejido foliar por encima del mesocotilo (Fig. 3d ) se seccionó longitudinalmente y se cortó mecánicamente en un procesador de alimentos mientras se sumergía en la suspensión de Agrobacterium (Fig. 3e). Los fragmentos de hojas se distribuyeron en papeles de filtro y se colocaron en medio de cocultivo durante 24 horas y luego en medio de reposo (RM) durante 7 días (Fig. 3f). Se observó la formación de embriones somáticos de color verde fluorescente a partir de los fragmentos de hojas aproximadamente 7 a 10 días después de la infección (Fig. 3g). Después de tres semanas de selección en los papeles de filtro (Fig. 3h), las placas que contenían el tejido se trasladaron a una incubadora a 45 °C durante dos horas para inducir la escisión mediada por Cre, y luego se transfirieron piezas individuales de tejido embriogénico sano a la maduración. (Fig. 3i) y finalmente en medio de enraizamiento (Fig. 3j), donde se completó el desarrollo de las plántulas antes de transferirlas al suelo en el invernadero.

a, Esterilización superficial de semillas de maíz. b, Semillas de maíz en medio de germinación. c, Plántulas de maíz de catorce días de edad utilizadas como fuente de explante. d, Preparación de segmentos de 3 cm del verticilo de la hoja directamente encima del mesocotilo seguido de corte longitudinal del tejido (no se muestra). e, El tejido se colocó en 100 ml de suspensión de Agrobacterium en el mezclador mini-Cuisinart y se sometió a diez pulsos breves para cortar aún más el tejido de la hoja. Después de una incubación de 20 minutos en la suspensión de Agrobacterium, el líquido se vertió a través de un tamiz de metal para recolectar los fragmentos de hojas, que se secaron brevemente sobre papel de filtro seco para eliminar el exceso de Agrobacterium (no se muestra). f, Fragmentos de hojas distribuidos en papel de filtro en el RM sólido. g, crecimiento de embrión somático fluorescente observado entre 7 y 10 días después de la infección por Agrobacterium (la imagen es representativa de más de 100 experimentos independientes; barra de escala, 1 mm). h, Después de cultivar en el RM, el tejido de la hoja se transfirió al medio de selección. i, Después de tres semanas en papeles de filtro en medio de selección, el tejido se sometió a 45 °C/70 % de HR durante dos horas (no se muestra), se transfirió a medio de maduración y se cultivó durante tres semanas más. j, Formación de regenerantes T0 después de dos semanas en medio de enraizamiento.

El origen de los embriones somáticos dentro de las hojas transformadas (Datos extendidos Fig. 1a,b) se infirió sobre la base de las observaciones histológicas del tejido, que mostraban claramente grupos multicelulares que parecían iniciarse a partir de las células internas de la hoja (Datos extendidos Fig. 1d-f ). Estos grupos continuaron creciendo a medida que los embriones somáticos finalmente salían a través de la superficie de la hoja (Datos extendidos Fig. 1c, f).

Los resultados de la transformación del tejido de la hoja para PH1V69 consanguíneo de tallo rígido (SS) de maíz de cuatro experimentos que utilizan el vector PHP96037 se muestran en la Tabla 2a. En cuatro repeticiones, cada una de las cuales comenzó con diez plántulas utilizadas para generar los fragmentos de hojas, la cantidad de plantas T0 transgénicas recuperadas varió de seis (Experimentos 1 y 4) a 14 (Experimento 2), lo que resultó en una frecuencia de transformación promedio de 98 ± 43 %. (calculado sobre la base del número de regenerantes T0 por plántula inicial). En tres tratamientos repetidos con el vector de control PHP86491 (Fig. 1a), se observó una entrega de ADN-T comparable a la de otros plásmidos que contenían Ubi::ZsGreen1, pero no se produjo formación de embriones somáticos con fluorescencia verde en estas piezas de hoja, y no se produjo T0 transgénico. las plantas se recuperaron usando el mismo protocolo de transformación.

Estos experimentos de transformación de hojas produjeron un alto porcentaje (del 0 % al 57 % con una media de 36 ± 25 %) de regenerantes T0 de alta calidad con una sola copia del T-DNA integrado (que contiene genes marcadores seleccionables y fluorescentes) sin secuencias de la columna vertebral insertadas en otro lugar, según lo determinado por PCR cuantitativa (qPCR). La comparación de esta cantidad de eventos transgénicos de alta calidad con la cantidad de plántulas iniciales utilizadas en estos experimentos proporcionó una medida clara de la eficiencia general para producir plantas T0 de copia única, con una frecuencia media de 40 ± 29 %.

Los regenerantes transgénicos de una sola copia se cultivaron hasta la madurez en el invernadero. El fenotipo de la planta T0 fue comparable al de las plantas derivadas de semillas de tipo salvaje (no transgénicas). Luego, las plantas T0 se autopolinizaron o se cruzaron con plantas de tipo salvaje y produjeron en promedio 172 (11 mazorcas) y 195 (17 mazorcas) semillas por mazorca, respectivamente (Tabla complementaria 3). Treinta y seis plantas T0 de copia única también se analizaron utilizando la tecnología Southern-by-Sequencing (SbS)30 (Tabla complementaria 4). Veintisiete plantas (75 %) fueron 'SbS-pass', lo que indica que estaba presente una sola copia intacta del T-DNA integrado con Wus2, Bbm y Cre extirpados, sin que se detectaran pequeños fragmentos de ADN segregados independientes y no vinculados. El 25 % restante falló debido a una variedad de problemas que incluyen polimorfismos de un solo nucleótido, fragmentos vinculados o no vinculados, columna vertebral del plásmido o secuencias fronterizas no coincidentes (Tabla complementaria 4).

Durante el rápido crecimiento de las plántulas, las hojas a menudo entraban en contacto con la tapa del recipiente de crecimiento, lo que provocaba necrosis tisular y producción de fenoles. Para mitigar este problema, agregamos ancymidol, un antagonista de la elongación regulada por giberelina31, al medio de germinación y crecimiento de plántulas para producir plántulas más cortas y compactas. Además, observamos que el pretratamiento con ancymidol de las plántulas mejoró la frecuencia de transformación, como se demostró usando el vector PHP97334, que contenía un T-DNA con los mismos casetes de expresión Wus2, Bbm, Cre y ZsGreen1 que en PHP96037, excepto por un SiUbi::NptII que reemplazó al SbAls::ZmHra como gen marcador seleccionable (Fig. 1a).

Para tres réplicas de este experimento realizadas usando tres plantaciones separadas de plántulas en tres medios diferentes (Tabla 2b), las plántulas cultivadas en ausencia de ancymidol (control) produjeron una frecuencia de transformación media de 103 ± 6 %, mientras que las plántulas cultivadas en 2 mg l-1 o 4 mg l-1 de ancymidol dieron como resultado frecuencias de transformación medias de 299 ± 50 % y 246 ± 9 %, respectivamente. Los dos tratamientos con ancymidol no difirieron significativamente entre sí (P = 0,32), pero fueron sustancialmente más altos que el control (P < 0,02). Los tres tratamientos (con pretratamientos de 0, 2 y 4 mg l-1 de ancymidol) produjeron plantas T0 en las que una proporción similar contenía una sola copia del T-DNA integrado.

Como se observó anteriormente para los embriones inmaduros32,33, el tratamiento con temperatura podría tener un impacto positivo en los resultados de transformación aguas abajo. Sobre la base de esta idea, un subconjunto de plántulas PH1V69 cultivadas en medios suplementados con 2 mg l-1 de ancymidol a 28 °C se incubaron a 45 °C y 70 % de humedad relativa (HR) durante tres horas, seguido de la recolección de tejido foliar. y fragmentación mecánica en presencia de suspensión de Agrobacterium. Como se muestra en la Tabla 2c, el tratamiento de control dio como resultado una frecuencia de transformación media de 260 ± 101 %. El pretratamiento de plántulas a 45 °C durante tres horas resultó en una frecuencia de transformación significativamente mayor de 560 ± 85 % (P = 0,002).

Para evaluar si este método funciona en el maíz endogámico B104 de uso común, se usaron plántulas cultivadas en 2 mg l-1 de ancymidol con el pretratamiento de tres horas a 45 °C/70 % de HR como fuente de tejido, y la transformación se llevó a cabo como se describe para PH1V69. Para dos réplicas que comenzaron con siete plántulas para cada experimento, el número de plantas T0 producidas fue de 12 y 13 para frecuencias de transformación de 171 % y 186 %, respectivamente (Tabla complementaria 5). De estas 12 y 13 plantas T0 en total, 8 y 7 tenían inserciones de T-DNA de una sola copia, respectivamente, y un análisis posterior mostró que cuatro de ocho y cinco de siete eventos no tenían una secuencia de plásmido extraño (Tabla complementaria 5).

El método de transformación de hojas desarrollado para nuestro SS PH1V69 también se probó en cuatro consanguinidades de maíz no SS (NSS) de Pioneer usando PHP97334 (que contiene Nos::Wus2 + 3xEnh–Ubi::Bbm), comenzando con 21–24 plántulas por genotipo sin replica Los PH4257 y PNSS01 endogámicos produjeron menos embriones somáticos dentro de los primeros 14 días después de la infección con Agrobacterium, lo que resultó en una clasificación de respuesta de transformación más baja en comparación con el PH1V69 endogámico SS (Tabla complementaria 6). Como resultado, PH4257 no produjo plantas transgénicas y solo se regeneraron tres plantas T0 para PNSS01 (13 % en relación con el número de plántulas iniciales).

Por el contrario, los otros dos NSS endogámicos (1PYWK36 y 1PEEA63) demostraron fuertes respuestas tempranas de embriones somáticos similares a los PH1V69 endogámicos. Sin embargo, para estos dos endogámicos, la conversión de estos embriones somáticos en plantas T0 fue considerablemente menos eficiente, produciendo solo diez y ocho plantas T0 (48% y 38% de frecuencia de transformación, respectivamente). Sin embargo, cuando se usó una construcción diferente (PHP96277) que contenía Wus2 regulado por actina, el número de plantas T0 regeneradas aumentó a 20 y 40 (95 % y 190 %) para las plantas endogámicas 1PYWK36 y 1PEEA63, respectivamente. Si bien los resultados de estos cuatro consanguíneos no se replicaron y, por lo tanto, son preliminares, en conjunto demostramos que el método de transformación de hojas funcionó para seis de los siete consanguíneos de maíz probados.

Para probar el método de transformación de hojas de maíz en otro cultivo, utilizamos la misma cepa de Agrobacterium, construcciones, crecimiento de plántulas, preparación de material foliar, infección, cocultivo, cultivo en reposo, selección, escisión de Wus2/Bbm, maduración de embriones somáticos y enraizamiento. medios para la transformación de hojas de sorgo. Aunque PHP96037 contenía el gen Hra, no se utilizó selección en este conjunto de experimentos porque no se observó regeneración de fondo del tejido de la hoja en las observaciones iniciales en ausencia de Wus2/Bbm. Además, en este conjunto de experimentos comparamos dos medios de reposo (RM): medio 13266P más 50 mg l-1 de meropenem y RM + CB (sulfato cúprico 100 μM y 0,5 mg l-1 de bencilaminopurina).

Los resultados de cuatro experimentos con sorgo (variedad Tx430) se muestran en la Tabla 2d. La transformación de hojas de sorgo utilizando el vector PHP96037 resultó en altas frecuencias de regeneración, calculadas sobre la base del número de plantas T0 transgénicas recuperadas por plántula inicial, con una frecuencia media de 166 ± 96 % y 297 ± 126 % para RM y RM + CB, respectivamente. , sin diferencia significativa entre los dos medios (P = 0,15). El tratamiento de control sin Wus2/Bbm en el T-DNA (PHP86491) no produjo plantas regeneradas. La frecuencia media de plantas de sorgo T0 de alta calidad (copia única de ADN-T/sin columna vertebral) cuando se transformaron con PHP96037 estuvo entre el 35 % y el 37 %, sin diferencias significativas entre los dos medios (P = 0,87).

Veintitrés plantas de sorgo T0 de copia única producidas a través de la transformación rápida de hojas se cultivaron hasta la madurez en el invernadero. Estas plantas estaban sanas y mostraban un fenotipo general similar al de las plantas Tx430 de tipo salvaje. El análisis SbS demostró que de 23 plantas T0, 17 contenían una sola copia del T-DNA integrado (Tabla complementaria 4). Veintiuna plantas T0 (91%) fueron fértiles, con conjuntos de semillas que oscilaron entre 667 y 3255 semillas por cabeza y una media de 2057 ± 900 semillas por cabeza (Tabla complementaria 3).

Para evaluar la eficiencia de la eliminación de genes en tejido foliar derivado de plántulas de maíz PH1V69 consanguíneo, utilizamos un vector T-DNA (PHP98784, Fig. 1b) que contenía los componentes descritos anteriormente complementados con Cas9 y dos casetes de expresión de ARN guía (ARNg). apuntando a dos sitios que flanquean el gen endógeno Wx1 como se describió previamente por Gao et al.34. Para estos experimentos, se usaron 2 mg l-1 de ancymidol en el medio de germinación para PH1V69 consanguíneo, y se aplicó un pretratamiento térmico de plántulas de tres horas antes de la infección por Agrobacterium.

Los resultados de tres experimentos de eliminación de Wx1 se resumen en la Tabla 3. Se observaron frecuencias de transformación altas de 636 %, 544 % y 363 % para una media de 514 ± 139 %. El análisis de PCR cuantitativo realizado en plantas T0 demostró frecuencias de abandono del 4,4 %, 8,1 % y 8,0 % para estos tres experimentos, respectivamente, para una media de 6,8 ± 1,7 %.

Para probar la inserción de genes dirigidos mediada por HDR en células de hoja de maíz, se construyeron dos vectores de ADN-T casi idénticos (PHP99721 y PHP103735). Ambos vectores contenían Wus2, Bbm, Cre, Cas9, gRNA, una plantilla de donante que contenía un gen marcador seleccionable (NptII) flanqueado con brazos de homología y secuencias idénticas al sitio de destino genómico (a 53,66 cM en Chr1 (ref. 35)), un segundo gen marcador seleccionable (Hra) y ZsGreen1 (PHP99721; Fig. 1c (i)). Los dos vectores diferían en las secuencias del brazo de homología específicas para los dos genotipos usados ​​(PHP99721 para PH1V69 y PHP103735 para el PHR03 consanguíneo de Pioneer NSS). Como se informó anteriormente36, la presencia de sitios diana flanqueantes conduce a la liberación de la plantilla donante de T-DNA tras la expresión de gRNA y Cas9 (Fig. 1c (ii)). El uso de dos genes marcadores seleccionables diferentes, NptII y Hra, presentes dentro y fuera de la plantilla del donante, respectivamente, permitió la comparación de las frecuencias de inserción específicas según la posición del gen marcador seleccionable (Fig. 1c (i)).

Para estos experimentos, las plántulas se cultivaron en un medio de germinación con ancymidol. Se realizaron un total de cinco experimentos utilizando dos genotipos patentados diferentes de Pioneer. Los experimentos 1 a 4 se realizaron en PH1V69 consanguíneo, mientras que el experimento 5 se realizó con PHR03 endogámico. En el Experimento 1, no hubo pretratamiento térmico de plántulas, mientras que en los Experimentos 2 y 3, la mitad de las plántulas se expusieron a 45 °C a 70 % de HR durante tres horas antes de la infección por Agrobacterium y la otra mitad no recibió pretratamiento térmico. En los Experimentos 4 y 5, todas las plántulas se sometieron al pretratamiento térmico. En los Experimentos 1, 2, 3 y 5, se usó NptII (dentro de la plantilla del donante) como gen marcador seleccionable. En el Experimento 4, se regeneró un grupo de plantas T0 utilizando G418 como agente de selección (para NptII), mientras que el segundo grupo de plantas se regeneró en medio que contenía etametsulfurón (para Hra).

Los resultados de los cinco experimentos se resumen en la Tabla 4. En los Experimentos 1 a 3, cuando no se aplicó pretratamiento con calor, la frecuencia de transformación (el número de plantas T0 por plántula) fue del 140 %, 262 % y 230 %, respectivamente, con un media de 211 ± 63%. Por el contrario, en los Experimentos 2 a 4, cuando se utilizó el pretratamiento de temperatura, las frecuencias de transformación aumentaron significativamente (P = 0,001) al 560 %, 570 % y 524 %, respectivamente, con una media de 551 ± 24 %. La tasa de escape (el número de regenerantes sin un gen marcador seleccionable detectado) osciló entre el 9,0 % y el 10,9 %. Las plantas T0 se analizaron primero en busca de eventos de inserción mediados por HDR mediante qPCR de unión HR1 y HR2 de diagnóstico (Fig. 1c (iii)) como se describe en los Métodos. Las plantas T0 que dieron positivo mediante qPCR para una unión HR1 o HR2 sola oscilaron entre el 5 % y el 12,6 %. Las plantas T0 que fueron positivas para ambas uniones (columna HR1 y HR2 en la Tabla 4) demostraron que las frecuencias de inserción objetivo fueron similares (P = 0,71) en los cuatro experimentos; 4,5%, 6,8% y 5,2% sin pretratamiento térmico y 7,0%, 5,6% y 5,0% con pretratamiento.

Usando PCR larga que abarca todo el sitio de inserción (desde la secuencia genómica fuera del brazo HR1 a través del donante integrado hasta la secuencia fuera del brazo HR2; Fig. 1c (iii)), pudimos detectar la frecuencia de putativos eventos de inserción perfectos . Tanto para las réplicas sin pretratamiento térmico como para las pretratadas térmicamente en los Experimentos 1 a 4, las frecuencias fueron muy similares: 3,2 %, 2,8 % y 3,0 % y 2,7 ​​%, 2,5 % y 2,6 %, respectivamente. Estos resultados demuestran claramente que aunque el pretratamiento con calor resultó en un aumento sustancial en la recuperación inicial de las plantas T0, las frecuencias de inserción de genes objetivo fueron muy consistentes. Además, el número de eventos positivos de PCR larga en relación con el número total de plantas T0 con uniones HR1 y HR2 positivas proporciona una indicación del desgaste asociado con inserciones incompletas y/o complejas que ocurrieron a través de una combinación de HDR y Vías NHEJ. Estas frecuencias en los Experimentos 1–3 fueron 72 %, 41 % y 58 % para las réplicas sin tratamiento térmico previo, mientras que para ambas réplicas pretratadas térmicamente los valores fueron 40 % y 45 %.

Las frecuencias de inserción dirigidas también se compararon usando dos genes marcadores seleccionables diferentes ubicados dentro de la plantilla del donante (NptII), por lo tanto, integrándose en el sitio objetivo, o fuera de la plantilla del donante (Hra), en cuyo caso el gen marcador seleccionable se deja en el sitio aleatorio. ADN-T integrado (Experimento 4). Comparando estos dos tratamientos, la frecuencia de transformación inicial fue similar: 524 % (con una frecuencia de escape de 9,8 %) cuando se seleccionó en medio con G418 y 579 % (con una frecuencia de escape de 12,6 %) cuando se seleccionó en medio con etametsulfuron. Para el tratamiento con el gen marcador seleccionable dentro de la plantilla del donante, la frecuencia de eventos positivos para HR1 y HR2-qPCR fue del 5,0 %, similar a las frecuencias observadas en los primeros tres experimentos. En comparación, cuando el gen marcador seleccionable estaba fuera de la plantilla del donante, la frecuencia de los eventos de inserción del gen objetivo fue menor al 2,9 %. Las frecuencias de eventos positivos de PCR larga para los dos grupos fueron 2,6 % y 1,5 %, respectivamente.

El Experimento 5 se llevó a cabo para evaluar la frecuencia de inserción del gen objetivo en el PHR03 consanguíneo de NSS (Tabla 4). Usando el mismo diseño de T-DNA y NptII como el gen marcador seleccionable (ubicado dentro de la plantilla del donante), la frecuencia de transformación fue del 205 % (con una frecuencia de escape del 9,6 %), mientras que la tasa combinada de HR1 y HR2 fue del 2,2 % y la tasa final de larga duración. La frecuencia de PCR fue del 1,2%.

Para evaluar los patrones de transmisión y segregación de las integraciones dirigidas basadas en HDR, analizamos 32 plantas T1 de tres eventos de inserción T0 del Experimento 1 (Tabla 4) usando qPCR para la presencia de inserción de genes y componentes de ADN-T (Cas9, gRNA, Bbm , Wus2, Hra y NptII). Los resultados de este análisis se resumen en la Tabla complementaria 7. Las tres plantas T0 mostraron transmisión de la inserción a la generación T1 con una relación de segregación de aproximadamente 1:1 (40 %, 44 % y 56 %), consistente con una herencia mendeliana estable. de un locus monoalélico. Como era de esperar, aproximadamente el 50 % de las plantas T1 con inserción estaban libres de transgén.

Las plantas con inserción positiva de T1 se analizaron adicionalmente mediante secuenciación de Sanger para verificar la calidad y la integridad de la inserción. Los productos de PCR largos de diez plantas T1 seleccionadas (tres o cuatro plantas para cada uno de los tres eventos T0) se secuenciaron y ensamblaron en contigs. La comparación de los diez contigs no mostró variación de secuencia, lo que confirma que cada planta tenía una inserción de gen mediada por HDR precisa.

Alentados por nuestros resultados en maíz y sorgo, realizamos una evaluación preliminar de la transformación de la hoja utilizando nueve especies de Poaceae, incluidas Eragrostis tef, Panicum virgatum (pasto varilla), Cenchrus americanus (sinónimo Pennisetum glaucum, mijo perla), Setaria italica (cola de zorro mijo), Triticum aestivum (trigo Pioneer Spring), Secale cereale (centeno), Hordeum vulgare (cebada), Saccharum officinarum (caña de azúcar) y Oryza sativa (arroz) (Fig. 4a). Para esta evaluación se utilizó el método optimizado para el maíz, pero sin el ancymidol ni los pretratamientos térmicos de las plántulas. Se cosechó tejido foliar de la parte basal de la plántula y se cortó manualmente en fragmentos de 1,5 a 3 mm (Datos ampliados, Fig. 2). A continuación, los trozos de hoja se infectaron con Agrobacterium que contenía PHP97334 (Fig. 1a). Se usaron entre seis y 120 plántulas para diferentes especies/variedades (las pequeñas cantidades en algunas especies se debieron a la disponibilidad limitada de material de partida). Usando microscopía de fluorescencia para evaluar la expresión de ZsGreen1 cuatro a cinco días después de la infección, observamos una buena entrega de T-DNA en todas las especies analizadas (Fig. 4b, micrografías de la izquierda). El cultivo adicional del tejido de la hoja durante cuatro a cinco semanas dio como resultado callos embriogénicos fluorescentes (Fig. 4b, micrografías centrales). Después de la escisión de Wus2/Bbm, el tejido se cultivó durante tres semanas en medio de maduración de embriones y luego durante dos semanas en medio de enraizamiento, momento en el que se fotografiaron las plántulas en regeneración (Fig. 4b, fotografías de la derecha).

a, El árbol genealógico de las Poaceae indicando las especies utilizadas en el experimento y las subfamilias correspondientes. Las especies que se transformaron y regeneraron con éxito, produciendo plantas T0, se muestran en negro; las especies que se transformaron y produjeron tejido calloso pero que no se regeneraron se muestran en rojo. b, Resultados para todas las especies de gramíneas transformadas con éxito. Las imágenes de la izquierda muestran la expresión transitoria de ZsGreen1 tres o cuatro días después de la infección por Agrobacterium (barras de escala, 500 µm), lo que demuestra la entrega relativa de T-DNA en varios cultivos; las imágenes del centro muestran ejemplos de formación de callos embriogénicos de color verde fluorescente de tres a cuatro semanas después de la infección (barras de escala, 1 mm); y las imágenes de la derecha muestran plántulas recuperadas con brotes y raíces listas para ser transferidas al suelo de cinco a ocho semanas después de la infección. Las imágenes son representativas de tres experimentos independientes.

Se produjo callo embriogénico en todas las especies probadas (los experimentos individuales para cada especie se resumen en la Tabla complementaria 8), y se regeneraron plántulas T0 con brotes y raíces saludables en siete de nueve especies (Fig. 4b). Dos especies, el trigo y la caña de azúcar, no produjeron plantas T0 (Datos ampliados, Fig. 3). En el caso de la variedad de trigo Pioneer PH456D, aunque se produjeron embriones somáticos en los primeros 10 a 14 días (basado en el fenotipo de crecimiento temprano), el potencial embriogénico se deterioró y el callo se volvió no regenerable durante las siguientes 2 a 3 semanas. En el caso de la caña de azúcar, se produjo y mantuvo el callo embriogénico somático, pero la morfología embriogénica se perdió rápidamente después de la exposición al tratamiento térmico a 45 °C utilizado para estimular la escisión mediada por Cre. El experimento con caña de azúcar se repetirá en el futuro, reemplazando el promotor inducible por calor con un promotor Rab17 inducible por desecación/ácido abscísico que conduce a Cre para facilitar la escisión como se describe en Lowe et al.10.

El uso de genes morfogénicos para mejorar la transformación mediada por Agrobacterium y/o la edición de genes mediada por Cas9 en especies de gramíneas continúa cobrando impulso. La combinación de Wus2 y Bbm para mejorar la transformación de embriones inmaduros en el maíz se informó por primera vez para varios endogámicos de maíz recalcitrantes10. La aplicación de estos genes se amplió aún más a la transformación del sorgo10,12, la edición del genoma del sorgo37, la transformación endogámica pública del maíz14,15,38 y la edición del genoma del maíz15,35,36,39. Recientemente, también se ha demostrado que Wox5 mejora la transformación en numerosas variedades de trigo, con aplicaciones potenciales en otros cereales como Triticum monococcum, triticale, centeno, cebada y maíz19. De manera similar, se ha demostrado que Grf5 mejora la transformación en la línea endogámica de maíz A18840, y se ha demostrado que la combinación de genes Grf4/Gif1 estimula el crecimiento y la regeneración de eventos transgénicos en trigo, arroz y triticale18. Sin embargo, el progreso anterior sigue dependiendo de la transformación de embriones inmaduros, que ha sido una limitación para muchos cultivos de la familia de las gramíneas, lo que motiva a los investigadores a explorar explantes alternativos para el cultivo y la transformación de tejidos.

La base de la hoja ha sido un atractivo explante de cultivo de tejidos durante casi cuatro décadas, demostrándose la iniciación y regeneración de callos en numerosas especies de Poaceae, incluido el trigo41,42,43,44, la avena45,46, la cebada47,48, el centeno49, el maíz23, el arroz50 y varias pastos apomícticos51. En consecuencia, los investigadores han utilizado bases de hojas para generar callos embriogénicos como el explante objetivo para la infección por Agrobacterium y la regeneración de plantas transgénicas, por ejemplo, en maíz23, arroz indica24,52, bambú Ma25 y teosinte26. Sin embargo, a excepción de un informe en pasto de huerta (Dactylis glomerata)53 donde se produjeron plantas transgénicas, los estudios en los que se usó tejido de la base de la hoja como objetivo directo de transformación se limitaron a demostrar solo la expresión transgénica transitoria en arroz54, trigo55 y maíz56.

Lowe et al.10 han demostrado que el uso de genes morfogénicos Wus2 y Bbm facilitó la transformación directa mediada por Agrobacterium del tejido de la hoja basal y la recuperación de plantas de maíz con integración transgénica aleatoria. Recientemente, este método se ha extendido a la transformación aleatoria en Panicum virgatum27 y la mutagénesis mediada por Cas9 en Eragrostis tef28, lo que demuestra que Wus2/Bbm puede facilitar la transformación directa de la base de la hoja en otras especies de pastos. Sin embargo, para respaldar el verdadero potencial de la edición del genoma mediada por Cas9, aún se requieren tasas de transformación sustancialmente más altas para producir la gran cantidad de plantas necesarias para recuperar modificaciones complejas del genoma, como la inserción de genes mediados por HDR específicos y reordenamientos cromosómicos a gran escala9.

Para abordar esta necesidad, mostramos que la entrega de Wus2 y Bbm mediada por Agrobacterium regulada por nuevos promotores puede elevar significativamente la transformación de la base de la hoja en maíz y sorgo. Previamente, se han usado dos combinaciones de promotores para la transformación de embriones inmaduros mediada por Wus2/Bbm. En el primero, el uso de los promotores Nos y Ubi que impulsan la expresión de Wus2 y Bbm, respectivamente, estimuló el desarrollo del callo embriogénico pero requirió semanas de cultivo seguidas de la escisión del gen morfogénico antes de la regeneración de la planta10,12. La segunda combinación de promotores, Axig1 para Wus2 y Pltp para Bbm, estimuló la formación rápida de embriones somáticos y no requirió escisión posterior11,14,15,57. Lowe et al.10 demostraron que la transformación de la hoja de maíz usando Nos::Wus2 y Ubi::Bbm inicia un callo embriogénico débil que apenas se desarrolla dentro de las primeras dos semanas después de la infección (Tabla 1, PHP81858), y el uso de Axig1::Wus2 y Pltp::Bbm, aunque condujo a una fuerte expresión transitoria en explantes de hojas, no resultó en la formación posterior de embriones somáticos (Tabla 1, PHP83652). Esto nos llevó a probar muchas combinaciones diferentes de promotores, algunas de las cuales produjeron embriones somáticos a velocidades lentas (++) o más rápidas (+++) (Tabla 1). Aunque estas combinaciones de promotores no son óptimas para el maíz, pueden resultar útiles en otras especies de gramíneas con más experimentación. Los mejores resultados se obtuvieron para un grupo de construcciones cuando los promotores Nos, Actina o Ubi controlaron la expresión de Wus2 y Bbm fue regulado por un promotor FMV::PCSV::MMV::Ubi (tres potenciadores virales aguas arriba del promotor Ubi). Para el maíz y el sorgo, nos centramos en Nos::Wus2 y 3xEnh–Ubi::Bbm para seguir desarrollando métodos.

Las frecuencias de transformación se mejoraron aún más al cultivar plántulas en ancymidol y proporcionar un pretratamiento térmico antes de la cosecha del explante de hojas y la infección por Agrobacterium. El beneficio de la exposición al calor inmediatamente antes de la infección es similar al observado para la transformación de embriones inmaduros en arroz58, maíz44,58 y sorgo32, donde se ha sugerido que la acumulación de proteínas de choque térmico puede mitigar el estrés de la infección por Agrobacterium. Un vínculo entre la exposición al ancymidol y la mitigación del estrés es menos claro. En cambio, una posible explicación para la respuesta embriogénica mejorada puede estar relacionada con la observación de que las bases de las hojas tratadas con ancymidol acumulan cantidades notables de almidón en las células del mesófilo en desarrollo (Datos extendidos Fig. 4). Se ha observado una correlación entre la acumulación de almidón y la embriogénesis somática mejorada en otros sistemas59,60,61, con la sugerencia de que el almidón es una fuente de energía fácilmente metabolizable para apoyar el desarrollo del embrión somático. Como resultado, para PH1V69 logramos frecuencias de transformación promedio (el número de regenerantes T0 por plántula inicial) de 260 % ​​con ancymidol y 560 % con una combinación de ancymidol y pretratamiento térmico (Tabla 2c). El protocolo desarrollado para PH1V69 también se utilizó con éxito para transformar Pioneer NSS PHR03 endogámico y la línea pública B104 con frecuencias de alrededor del 200 % y 180 %, respectivamente; otras líneas NSS probadas tenían frecuencias de transformación entre 13 y 190%. Actualmente, no tenemos una métrica común para comparar la eficiencia de la transformación de embriones inmaduros con la transformación de hojas derivadas de plántulas simplemente porque los explantes utilizados para la infección por Agrobacterium son muy diferentes. Además, cuando se usa el mini-Cuisinart para la fragmentación mecanizada de hojas, la población de hojas individuales producidas es demasiado variable en número y tamaño para proporcionar un punto de partida reproducible para calcular la eficiencia. Por lo tanto, hemos recurrido a utilizar el número de plántulas iniciales como nuestro denominador común al comparar las frecuencias de transformación de hojas entre experimentos, entre endogamia y entre especies de gramíneas. Sobre la base de esta medida, podemos decir inequívocamente que el maíz endogámico PH1V69 y la variedad de sorgo Tx430 produjeron un alto número de eventos transgénicos T0 por plántula inicial y que los otros endogámicos probados (como B104) produjeron resultados más bajos. Para B104 y otros endogámicos, las frecuencias de transformación de hojas probablemente seguirán mejorando a medida que más laboratorios trabajen con este tejido para la infección por Agrobacterium y nuevas mejoras (como un sistema de plásmido ternario modificado para la transformación de embriones inmaduros mediada por Agrobacterium desarrollado en B104 (ref. 62 ) se ejercen sobre el tejido de la hoja.

La transformación directa de hojas proporciona otras ventajas que permiten la automatización y una mejor manipulación del material de cultivo de tejidos. Específicamente, el tedioso procedimiento de aislamiento de embriones se reemplaza con una simple preparación de tejido foliar derivado de plántulas, la fragmentación se automatiza usando una licuadora (reduciendo potencialmente la variabilidad en la preparación de explantes) y la infección por Agrobacterium ocurre directamente en el recipiente de mezcla. Además, mientras que los embriones inmaduros se subcultivan transfiriendo cada embrión a un nuevo medio individualmente, los fragmentos de hojas transformadas se colocan en papel de filtro, que se puede mover fácilmente de un medio a otro, lo que reduce sustancialmente el tiempo y el trabajo. Combinadas con la eliminación de la necesidad de producción de embriones durante todo el año además de la variación estacional que ha plagado los métodos de embriones inmaduros durante años15, estas ventajas hacen que la transformación sea más fácil, más práctica, reproducible, ergonómicamente amigable y ampliamente aplicable a una amplia variedad de importantes especies de pastos.

Desde los primeros días del cultivo de embriones inmaduros y la transformación en especies de gramíneas, siempre estuvo muy claro que la formación de embriones somáticos se producía en el epitelio escutelar63,64. Sin embargo, para el cultivo de base foliar, el origen de la respuesta del cultivo permaneció sin resolver. A pesar de muchos informes sobre la respuesta del tejido de la base de la hoja a las manipulaciones de cultivos in vitro y la producción de callos en una variedad de especies de Poaceae24,25,43,47,50, los tipos de células específicos involucrados no estaban claros. Nuestro análisis histológico junto con las observaciones de grupos multicelulares fluorescentes de cinco a siete días después de la infección por Agrobacterium (Datos ampliados, Fig. 1) confirman las observaciones anteriores de Lowe et al.10 de que los embriones somáticos parecen formarse predominantemente a partir de las células del interior de la hoja, una observación que es consistente con crecimiento embrionario a partir de tejido foliar en pasto de huerto65 y con observaciones en hojas de arroz que expresan constitutivamente el gen OsBbm166. Sobre la base de la abundante formación temprana de grupos multicelulares fluorescentes (Datos extendidos, Fig. 1a-c) y nuestra frecuencia actual de recuperación de plantas transgénicas de solo una fracción de tales respuestas de crecimiento temprano, probablemente existe un potencial para mejorar aún más este método. simplemente reduciendo la tasa de desgaste durante el proceso de cultivo.

También demostramos que el nivel de transformación de la base de la hoja logrado en el maíz SS consanguíneo PH1V69 patentado de Pioneer respalda la recuperación de plantas con varias modificaciones del genoma mediadas por Cas9 (mutagénesis basada en NHEJ, abandonos de genes e inserciones de genes dirigidas facilitadas por HDR) a frecuencias que se acercan las obtenidas para embriones inmaduros35,36,39. Otro aspecto importante a considerar para la edición del genoma es la contribución de la estimulación del crecimiento por parte de genes morfogénicos, acelerando simultáneamente la progresión del ciclo celular y la división celular, lo que contribuye a la eficiencia general de las modificaciones mediadas por Cas9. En consecuencia, se ha demostrado la ventaja de usar Wus2/Bbm en embriones inmaduros en el maíz para facilitar la recuperación de los abandonos genéticos35,34 y los eventos de integración mediados por HDR36,39. Además, Wus2 aumenta la frecuencia de abandonos de genes recuperados en plantas de sorgo T0 más allá del nivel que puede explicarse simplemente produciendo más plantas T017. Como especularon Peterson et al.36, una ventaja adicional del uso de genes morfogénicos en los experimentos de modificación del genoma es la estimulación de la división celular, lo que proporciona un entorno celular propicio para formas complejas más eficientes de edición del genoma, incluidas las pérdidas de genes y las inserciones mediadas por HDR. Nuestros resultados con bases de hojas de maíz son consistentes con estas interpretaciones.

En resumen, nuestros resultados demuestran claramente las ventajas potenciales de utilizar bases foliares como explante inicial para la transformación y edición del genoma en maíz y sorgo. Para el maíz, hemos demostrado el potencial del método en términos de alta eficiencia tanto para la producción de plantas transgénicas T0 como para la edición del genoma. Además, se demostró la transformación exitosa de hojas y la regeneración de plántulas para múltiples endogamias de maíz y un grupo representativo de especies de gramíneas. Ahora se puede usar un solo método en un amplio espectro de pastos, lo que abre la posibilidad de expandir los métodos de transformación y edición del genoma en toda la familia Poaceae.

Se utilizaron semillas de las líneas PH1V69, PHR03, PH4257, PNSS01, 1PYWK36 y 1PEEA63 de Zea mays propiedad de Pioneer en los experimentos de transformación, además de la línea pública B104. Para Sorghum bicolor se utilizaron semillas de la línea Tx430. La transformación se llevó a cabo en especies adicionales de Poaceae: Eragrostis tef (variedad de teff DZ-01-354), Panicum virgatum (variedad de pasto varilla Performer), Pennisetum glaucum (sinónimo de Cenchrus americanus, variedad de mijo perla ICMB93333), Setaria italica (mijo cola de zorra), Triticum aestivum (trigo Pioneer Spring variedad PH456D), Secale cereale (centeno, variedades de invierno Emerald y Pierre), Hordeum vulgare (cebada, variedades Golden promise y Morex SPDL2), Saccharum officinarum (variedad de caña de azúcar CPCL02) y Oryza sativa (ambas variedad indica IRV95 y japonica variedad Kitaake).

Las semillas maduras se esterilizaron superficialmente en una solución de etanol al 80 % durante tres minutos, seguido de una incubación en una solución de lejía Clorox al 30 % que contenía Tween-20 al 0,1 % durante 20 minutos y finalmente se enjuagó tres veces durante cinco minutos cada una en agua esterilizada en autoclave. Las semillas esterilizadas se transfirieron a medio sólido 90O para germinar (Tabla complementaria 9). La germinación in vitro y el crecimiento de las plántulas se llevaron a cabo bajo una intensidad de luz de 80 μmol m-2 s-1 a 28 °C con un fotoperíodo de 16 horas de luz/ocho horas de oscuridad.

Las semillas esterilizadas en la superficie se sembraron en un medio de germinación que no contenía ancymidol (medio de control 90O que contenía 0 mg l-1 de ancymidol) o medio 90O más 2 o 4 mg l-1 de ancymidol (Sigma Aldrich, número de producto A9431). La germinación y el crecimiento de las plántulas se produjeron con una intensidad de luz de 80 μmol m-2 s-1 usando un fotoperíodo de 16 horas a 28 °C, y las plántulas se cosecharon para su transformación a los 14 días para todos los experimentos y tratamientos repetidos.

Las semillas esterilizadas superficialmente se sembraron en medio de germinación 90O más 2 mg l-1 de ancymidol. La germinación y el crecimiento de las plántulas se produjeron como se ha descrito anteriormente. Antes de la cosecha del explante, las plántulas de 12 a 18 días de edad se colocaron en una incubadora a 45 °C/70 % de HR durante tres horas.

En estudios anteriores, la combinación del plásmido auxiliar pVIR9 (PHP71539) en la cepa de Agrobacterium LBA4404 THY- ha sido muy eficaz para su uso en la transformación del maíz29 y ha sido un componente integral en la optimización de los métodos Wus2/Bbm para embriones inmaduros10,11,16 y ahora tejido. La cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 TD THY- que alberga el plásmido auxiliar PHP71539 y un vector donante binario se rayó desde una alícuota congelada a -80 °C en un medio sólido 12R (Tabla complementaria 10a) y se cultivó a 28 °C en la oscuridad durante dos días para hacer una placa maestra. Se preparó una placa de trabajo sembrando cuatro o cinco colonias de la placa maestra cultivada con 12R en medio fresco 810K (Tabla complementaria 10b) e incubando durante la noche en la oscuridad a 28 °C antes de usarla para la infección por Agrobacterium. Inmediatamente antes de la preparación del tejido de la hoja de la plántula, Agrobacterium se suspendió y dispersó en un medio de infección de 700F (Tabla complementaria 11b).

Si las plántulas se diseccionaron manualmente (ver más abajo), se preparó un pequeño volumen de solución de infección (700F) mezclando 10 ml de medio 700J (Tabla complementaria 11a), 20 µl de acetosiringona (stock 100 mM) y 0.02% (v/ v) surfactante (BREAK-THRU S 233, Evonik Industries GmbH) en un tubo cónico de 50 ml. Se recogió Agrobacterium de la placa de trabajo, se transfirió al medio de infección en el tubo de 50 ml y luego se agitó hasta que se suspendió uniformemente. La densidad óptica (DO) de la suspensión se midió a 550 nm y se ajustó a una DO de 0,6. La suspensión final de Agrobacterium se dividió en alícuotas en placas Corning de seis pocillos que contenían insertos de cultivo permeables de 0,4 µm (Falcon, números de pieza 353046 y 353090, respectivamente) conteniendo cada pocillo aproximadamente 8 ml de la suspensión.

Para la fragmentación mecanizada de hojas en un procesador de alimentos Cuisinart Mini-Prep (ver más abajo), la mezcla de infección (700F) se preparó combinando 100 ml de medio 700J, 200 µl de acetosiringona y 0,02 % (v/v) de BREAK-THRU S 223. Aproximadamente la mitad de una placa de trabajo completa de Agrobacterium se transfirió a la mezcla de 100 ml y se ajustó a una DO de 0,6 a 550 nm.

Las plántulas se cultivaron como se ha descrito anteriormente. El segmento de la base de la hoja (una sección de aproximadamente 2,5 a 3,0 cm por encima del mesocotilo) se cosechó de cada plántula germinada in vitro de 12 a 18 días de edad con tijeras esterilizadas, y la hoja exterior se despegó y se descartó. Los cilindros restantes de la base de la hoja se dividieron longitudinalmente en dos mitades longitudinales utilizando un cilindro estéril no. 10 hojas de bisturí. A continuación, las mitades de verticilos de hojas bisectadas se diseccionaron adicionalmente manualmente o se procesaron mecánicamente en un mezclador.

Los segmentos de verticilos de hojas biseccionadas se seccionaron transversalmente en explantes de hojas más pequeñas (~ 3 mm), que se transfirieron a un inserto de cultivo permeable sentado en una placa de cultivo de seis pocillos que contenía 8 ml de suspensión de Agrobacterium prefabricada (medio 700F, Tabla complementaria 11b) y se infectaron durante 20 min a temperatura ambiente (Datos extendidos Fig. 2). Después de la infección, el inserto de cultivo que contenía los segmentos de hoja infectados con Agrobacterium se retiró de la placa de seis pocillos y se colocó en un papel de filtro seco esterilizado en autoclave para absorber y eliminar cualquier solución residual de Agrobacterium. Luego, los segmentos de hojas infectadas se transfirieron a un papel de filtro nuevo (VWR de 7,5 cm de diámetro) que descansaba sobre un medio de cocultivo sólido 710N (Tabla complementaria 12). Se usaron fórceps para dispersar uniformemente los segmentos de hojas en el papel de filtro y para asegurar que tuvieran suficiente espacio para crecer. Los tejidos de las hojas infectadas se incubaron a 21 °C en la oscuridad durante dos días.

Los verticilos de hojas bisectados se dejaron caer directamente en el recipiente de un procesador de alimentos Cuisinart Mini-Prep (MODELO DLC-1SSTG, preesterilizado usando etanol al 70%) que contenía 100 ml de medio de infección de Agrobacterium prefabricado (700F). Para cada repetición experimental, el número total de verticilos de hojas (que corresponde al número total de plántulas utilizadas para producir cada verticilo de hojas bisecado) varió; el número que aparece en la tabla de resultados es el número de plántulas iniciales en cada repetición. Los segmentos de hojas se cortaron a baja velocidad con diez pulsos rápidos. Los tejidos de las hojas picadas se dejaron en el recipiente con la suspensión de Agrobacterium durante 20 min y se agitaron suavemente dos o tres veces durante este período de infección. Después de la infección, todos los tejidos de hojas cortadas en la suspensión se vertieron en un tamiz de malla de acero inoxidable esterilizado en autoclave (Nº de artículo de Target.com 53142252) para drenar la suspensión de Agrobacterium. Los tejidos de hojas infectadas se transfirieron a dos capas de papeles de filtro esterilizados en autoclave en una placa de Petri vacía para secar la suspensión residual de Agrobacterium. Los tejidos de las hojas infectadas de aproximadamente una o dos semillas se transfirieron luego a un papel de filtro esterilizado en autoclave que se asentaba sobre la superficie del medio sólido de cocultivo 710N y se dispersaron uniformemente. Los tejidos de las hojas infectadas se incubaron a 21 °C en la oscuridad durante dos días.

Después de dos días de cocultivo, los papeles de filtro que soportan los segmentos de hojas se transfirieron de 710N a 13266P RM (Tabla complementaria 13) y se cultivaron durante una semana en la oscuridad a 28 °C sin selección. Los papeles de filtro que subtendían los fragmentos de tejido se transfirieron luego a un medio de selección (13266P más 150 mg l-1 G418 para la selección NptII o 0,1 mg l-1 de etametsulfuron para la selección Hra; consulte la Tabla complementaria 14a, b, respectivamente). Después de tres semanas de cultivo en medio de selección, las placas se colocaron en una incubadora de temperatura/humedad controlada (45 °C/70 % HR) durante dos horas para estimular el promotor Hsp17 e inducir la escisión mediada por Cre de Wus2, Bbm y Cre. casetes de recombinasa. Las placas se sacaron de la incubadora y se mantuvieron a temperatura ambiente durante una o dos horas hasta que las placas se enfriaron.

Después del tratamiento térmico y el equilibrio de la temperatura a temperatura ambiente, los segmentos de hojas con embriones somáticos recién desarrollados se transfirieron al medio de maduración 404 (Tabla complementaria 15) sin papeles de filtro, se cultivaron en la oscuridad a 28 °C durante dos semanas y luego se trasladaron a 26 °C cuarto de luz por una semana más. Los segmentos de hojas que ahora sostenían pequeños brotes se transfirieron al medio de enraizamiento 272M (Tabla complementaria 16) durante dos o tres semanas más hasta que se desarrollaron raíces bien formadas, momento en el que las plántulas estaban listas para transferirse al suelo en el invernadero. Para garantizar que cada planta T0 fuera un evento independiente, solo la plántula de crecimiento más vigoroso de cada hoja (que a menudo desarrollaba múltiples embriones somáticos) se transfirió al medio de enraizamiento y finalmente al invernadero.

Los análisis moleculares de las hojas transformadas para los niveles de transcripción de Wus2 y Bbm se llevaron a cabo como se describió anteriormente67 con algunas modificaciones. Brevemente, el ARN total se aisló triturando muestras en tampón de lisis RB (Omega Bio-tek), seguido de la adición de un volumen igual de etanol al 70 % y transfiriéndolas a una placa de purificación de unión de vidrio Nunc (Thermo Fisher Scientific) encima de una placa de 2 ml de profundidad. -buen plato. Las placas se cubrieron con una lámina Qiagen AirPore (Qiagen), se centrifugaron y se lavaron secuencialmente con tampón de lavado de ARN I y II (Omega Bio-tek). El ARN se eluyó con agua sin nucleasas calentada a 95 °C después de una incubación de dos minutos en la placa de unión Nunc Glass seguida de centrifugación para recoger el ARN en una placa de 96 pocillos. El ADN se eliminó de las muestras de ARN utilizando ADNasa I libre de ARNasa recombinante de Roche (Roche Diagnostics Corp.) y el ADN complementario se sintetizó utilizando kits de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR cuantitativa se realizó utilizando sondas de hidrólisis. Los cebadores y las sondas se diseñaron utilizando el software Primer Express de Applied Biosystems. La PCR basada en sonda de hidrólisis se realizó utilizando Bioline Sensi-fast mix (Bioline) en un instrumento de PCR en tiempo real Viia7 de Applied Biosystem utilizando las condiciones del fabricante. La expresión génica relativa se calculó mediante la normalización frente al gen del factor 4-gamma de iniciación eucariota de maíz (número de acceso de GenBank EU967723). En la Tabla complementaria 17 se proporciona una lista de cebadores y sondas utilizados para el análisis de la transcripción.

Se llevaron a cabo análisis moleculares de los eventos de inserción de genes mediados por HDR y de abandono, como se menciona en Peterson et al.36. La PCR cuantitativa se realizó con QuantiTect Multiplex PCR Master Mix (Qiagen) según las instrucciones del fabricante (excepto para la detección de HR1/HR2) en un sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 (Thermo Fisher Scientific). La Tabla complementaria 18 enumera los cebadores y las sondas que se utilizan para detectar productos de abandono de Wx1, uniones HR1/HR2, componentes de T-DNA y mutaciones en el sitio objetivo de HDR. Para detectar los productos de abandono de Wx1 (110 pares de bases), los sitios diana endógenos de Wx1 (3,8 kilobases) se flanquearon con cebadores/sondas. Los cebadores y las sondas se usaron para caracterizar los componentes del casete de expresión de T-DNA (Wus2, BBM, Cas9, gRNA y Hra) para el número de copias de segregación T1, así como los componentes del producto de inserción mediados por HDR (promotor SiUbi, terminador NptII y SiUbi). La caracterización T1 qPCR proporciona la mejor comprensión de la integridad del evento cuando se combina con una PCR de expansión de inserción larga utilizando LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (New England Biolabs) seguido de electroforesis en gel de agarosa. Los cebadores genómicos (cebador directo 5′-GCGTGCGTGCTTACATGATG-3′ y cebador inverso 5′-GTGCGACATTAAACAGTGTTAGTTGTAGCC-3′) que flanquean el sitio objetivo de HDR se diseñaron para amplificar tanto el producto de inserción intacto (~5,0 kilobases) como el alelo sin inserción (1,0 kilobases). Existen varias inserciones o deleciones indicadas por tamaños de banda variados y pueden representar la reparación de roturas de doble cadena a través de la vía NHEJ36. La detección de uniones HR también se completó con la detección basada en sondas fluorogénicas. Aunque los ensayos (Tabla complementaria 18) se extendieron desde la región genómica hasta los productos de inserción (HR1 (600 pares de bases) y HR2 (586 pares de bases)), las modificaciones al protocolo de ciclo de qPCR estándar permitieron la detección digital de productos de HR. Se utilizaron los siguientes parámetros de ciclado en un enfoque de ciclado de tres pasos: desnaturalización a 95 °C durante 15 min seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C/20 s, recocido a 62 °C/60 s y extensión a 68 °C/30 s. La mezcla de reacción de qPCR contenía 50 ng de ADN molde, cebadores 900 nM y sonda 100 nM. Aunque el producto HR1 contenía fondo fluorescente adicional, el uso de un normalizador patentado (VIC) de tamaño similar proporcionó una predicción del número de copias basada en qPCR para ambas uniones. El fondo en la reacción HR1 se sustrajo sobre la base de valores de cuantificación más altos. Para los eventos de segregación positiva de PCR larga T1, los productos de inserción completos se secuenciaron con Sanger con los cebadores indicados en la Tabla complementaria 18. El análisis de SbS se realizó como se describe por Zastrow-Hayes et al.30.

La comparación de las medias para todos los pares se realizó mediante pruebas de diferencia significativamente significativas unilaterales de Tukey-Kramer utilizando JMP versión 16.0.0 (SAS Institute Inc.). El número de repeticiones utilizadas en cada experimento se describen en las leyendas de las figuras y tablas respectivas o se presentan como puntos de datos individuales en las tablas.

El tejido de hoja no transformado se recogió después de cortar el tejido en pequeños fragmentos y fijarlo para el examen histológico (ver más abajo). Se recogieron piezas de tejido de hojas transformadas a los cinco, diez y 15 días después de la infección y se colocaron en fijador recién preparado, glutaraldehído al 2,5% (Electron Microscopy Sciences) en tampón fosfato, pH 7,0, y se fijaron durante la noche a temperatura ambiente. El tejido se lavó en tres cambios de tampón de fosfato (de tres a cinco minutos por cambio), y las piezas de tejido se deshidrataron en una serie graduada de etanol hasta etanol al 100%. El material se infiltró con Technovit 7100 activado (Heraeus Kulzer GmbH), partiendo de una mezcla 1:1 de etanol al 100%:Technovit 7100 durante una hora, seguido de dos cambios de Technovit 7100 al 100%, el primero durante una hora y el segundo durante la noche. Las muestras se polimerizaron en moldes de politetrafluoroetileno después de la adición de 1 ml de endurecedor Technovit 7100 a 15 ml de Technovit 7100 activado. Se permitió que la polimerización prosiguiera durante la noche al vacío en un desecador al vacío.

Se cortaron secciones a 2,5 µm con un cuchillo de zafiro en un micrótomo (Leica 2050, Leica Biosystems). Las secciones se flotaron sobre gotas de agua destilada en portaobjetos de vidrio (Fisherbrand SuperFrost Plus) y se secaron sobre los portaobjetos en una placa caliente a 50 °C. Las secciones se tiñeron con reactivo de ácido peryódico de Schiff para polisacáridos68 seguido de una contratinción de cinco minutos para proteínas con anilina azul negro al 0,1 % (en ácido acético al 7,0 %)69. Las imágenes fueron capturadas en un microscopio Nikon E800 equipado con una cámara Nikon DS-Ri1 (Nikon).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el Artículo y sus archivos de Información Complementaria y Datos Extendidos. Corteva Agriscience proporcionará plásmidos a investigadores académicos para investigación no comercial en virtud de un acuerdo de transferencia de material aplicable sujeto a la prueba del permiso de cualquier tercero propietario de todo o parte del material y a las consideraciones de regulación gubernamental. También se requiere completar un plan de administración. Las líneas puras de maíz Pioneer PH1V69, PH4257, PNSS01, 1PEEA63 y 1PYWK36 descritas en esta investigación son patentadas.

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Los laboratorios de F. Altpeter (Universidad de Florida) y W. Parrott (Universidad de Georgia), respectivamente, proporcionaron brotes micropropagados de Saccharum officinarum (variedad de caña de azúcar CPCL02) y Panicum virgatum (variedad de pasto varilla Alamo) para su uso en la experimento de cribado de transformación de hojas.

Ajith Anand

Dirección actual: MyFloraDNA, Woodland, CA, EE. UU.

Corteva Agriscience, Johnston, Iowa, EE. UU.

Ning Wang, Larisa Ryan, Nagesh Sardesai, Emily Wu, Brian Lenderts, Keith Lowe, Ping Che, Ajith Anand, Andrew Worden, Daleen van Dyk, Pierluigi Barone, Sergei Svitashev, Todd Jones y William Gordon-Kamm

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NW, LR, NS, EW, AA, KL, PC, PB, SS, TJ y WG-K. diseñó los experimentos. NW, LR, BL, AW, DvD y TJ realizaron los experimentos. Todos los autores contribuyeron al análisis de los resultados, y NW, LR, NS, EW, BL, AW, DvD, PB, SS, TJ y WG-K. contribuido a escribir el manuscrito.

Correspondencia a William Gordon-Kamm.

NW, LR, NS, EW, BL, KL, PC, AA, AW, DvD, PB, SS, TJ y WG-K. tienen intereses contrapuestos debido a su empleo con Corteva Agriscience en el momento en que se llevó a cabo esta investigación. El empleador de los autores (Corteva Agriscience) ha solicitado y obtenido patentes que cubren uno o más aspectos de este trabajo.

Nature Plants agradece a Sadiye Hayta, Kirankumar Mysore y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Imagen de fluorescencia de la expresión transitoria de ZsGreen1 cuatro días después de la infección por Agrobacterium con PHP97334. b, Focos fluorescentes independientes en crecimiento a medida que los embriones somáticos comienzan a crecer nueve días después de la infección. c, Mayor aumento nueve días después de la infección que muestra embriones somáticos fluorescentes que emergen de la superficie de la hoja. df, micrografías de secciones transversales de tejido foliar teñido con PAS y contrateñido con anilina azul negro, mostrando d, pequeños grupos de células en división que representan embriones somáticos en desarrollo temprano (flechas) en segmentos de hojas cinco días después de la infección, e, grupo de células en división células listas para emerger a través de la capa epidérmica en segmentos de hojas diez días después de la infección, y f, embriones somáticos más grandes atravesando la superficie de la hoja (flechas) en segmentos de hojas 15 días después de la infección. Consulte el final de la sección Complementaria para conocer los métodos histológicos. Las imágenes son representativas de más de diez experimentos independientes.

a, Suspensión de Agrobacterium dividida en alícuotas en insertos de cultivo permeables colocados en una placa de cultivo de seis pocillos. b, Plántula de maíz que representa la región cosechada para la preparación manual del explante. c, Explantes de tejido de hoja cortados manualmente en suspensión de Agrobacterium. d,e, Tejidos de hojas en un inserto de cultivo permeable con el exceso de suspensión de Agrobacterium que se elimina y tejidos de hojas cultivados en un papel de filtro que se asienta sobre la superficie de un medio sólido.

Expresión transitoria de ZsGreen1 tres o cuatro días después de la infección por Agrobacterium (paneles a la izquierda), lo que demuestra la entrega relativa de T-DNA. Formación de callo embriogénico verde fluorescente tres o cuatro semanas después de la infección (paneles a la derecha). Las imágenes representan tres experimentos independientes.

a,b, Secciones de tejido base de hojas de maíz de plántulas de 14 días de edad cultivadas en ausencia (a) o presencia (b) de 2 mg/l de ancymidol. Las secciones se tiñen con ácido peryódico de Schiff para los polisacáridos y anilina azul-negro para las proteínas. La flecha indica amiloplastos teñidos de magenta. Obsérvese la amplia presencia de amiloplastos en el mesófilo en desarrollo del tejido foliar tratado con ancymidol y la falta general de amiloplastos en el tejido cultivado en ausencia de ancymidol. Barra de escala = 50 µm.

Tablas complementarias 1 a 18, descripción de métodos histológicos y referencias.

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Reimpresiones y permisos

Wang, N., Ryan, L., Sardesai, N. et al. Transformación de hojas para una integración aleatoria eficiente y modificación del genoma dirigida en maíz y sorgo. Nat. Plantas 9, 255–270 (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-022-01338-0

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Recibido: 22 agosto 2022

Aceptado: 21 de diciembre de 2022

Publicado: 09 febrero 2023

Fecha de emisión: febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-022-01338-0

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