Papel 3D

Nov 23, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13657 (2022) Citar este artículo

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La adulteración de la leche es un problema común en los países en desarrollo y puede provocar enfermedades mortales en los seres humanos. A pesar de varios estudios para identificar diferentes adulterantes en muestras de leche, los efectos de múltiples adulterantes siguen sin explorarse. En este trabajo, se diseña y fabrica un dispositivo microfluídico tridimensional (3D) basado en papel para detectar simultáneamente múltiples adulterantes químicos en la leche. Este dispositivo comprende una cubierta superior, una cubierta inferior y una capa intermedia compuesta por una zona de transporte y una de detección. Al realizar cortes en el soporte de la capa intermedia, la trayectoria del flujo del dispositivo se caracteriza por una velocidad óptima y uniforme. Por primera vez, se detectan siete adulterantes (urea, detergentes, jabón, almidón, peróxido de hidrógeno, hidrogenocarbonato de sodio y sal) en la muestra de leche simultáneamente con una evaluación de especificidad y un análisis detallado de interferencia de color. Solo se requieren 1–2 ml de volumen de muestra para detectar 7 adulterantes a la vez. Hemos usado solo 10 \(\upmu\)L del volumen del reactivo para la reacción colorimétrica y encontramos los resultados en unos pocos segundos. La observación revela que el límite de detección (LOD) de los adulterantes se encuentra en el rango entre \(0.05\%\) (vol./vol.) a \(0.2\%\) (vol./vol.) utilizando el colorimétrico tecnica de deteccion La cantidad desconocida de los adulterantes agregados se mide usando las curvas de calibración obtenidas de los resultados de los experimentos. La repetibilidad y reproducibilidad del proceso, la sensibilidad y el rango lineal de detección de las curvas de calibración y el estudio estadístico de los datos de intensidad de color se analizan a fondo en este documento. En cualquier entorno con recursos limitados, se espera que este dispositivo de microfluidos 3D simple, portátil y fácil de usar se use para probar alimentos líquidos antes de su consumo.

La adulteración de alimentos es un problema grave en todo el mundo y ha recibido mucha atención por parte de las autoridades de seguridad alimentaria porque es peligrosa para la salud de las personas. La leche es uno de los alimentos más adulterados en los países en desarrollo, que representan aproximadamente la mitad de la producción total de leche en todo el mundo, incluidos India, Pakistán, China y Brasil. La disponibilidad de leche per cápita aumenta año tras año, pero existe una brecha significativa entre la tasa de crecimiento actual y la tasa de crecimiento requerida de la producción de leche. El consumo de leche es alto porque es un alimento nutritivo de bajo costo enriquecido con proteínas, grasas, carbohidratos, vitaminas, minerales, etc. Agregar adulterantes hace que el negocio lácteo sea rentable al cerrar la brecha entre la oferta y la demanda. La contaminación parece ser uno de los medios accesibles para satisfacer las necesidades de los consumidores de leche al producir más leche sintética1.

La leche está contaminada con urea2,3,4, melamina5,6, detergentes7, ácido bórico8, formalina9, sulfato de amonio, jabones, sal, neutralizantes10, maltodextrina11, almidón, azúcares12, clenbuterol13, tetraciclina14, peróxido de hidrógeno15, caramelo, agua16,17 y muchas otras sustancias nocivas18. Estos productos químicos son baratos y están ampliamente disponibles. La falta de leyes estrictas de aplicación y la falta de técnicas de detección rápidas y fáciles son los principales cuellos de botella para mantener este problema bajo control. La calidad de la leche, por lo general, está determinada por el porcentaje de grasa, el valor SNF (sólido no graso), el contenido de proteínas y otros factores19. Para mejorar estos parámetros, por lo general, se agregan adulterantes a la leche1. Se agrega agua a la leche para aumentar el volumen. Por el contrario, la urea y la melamina aumentan el contenido de nitrógeno no proteico de la leche. Los detergentes y jabones aumentan la blancura de la leche y emulsionan el aceite añadido. El peróxido de hidrógeno, la sal y la formalina se utilizan para la conservación de la leche. El azúcar y el almidón se utilizan para aumentar la densidad de la leche diluida, mientras que el hidrogenocarbonato de sodio y el carbonato de sodio se utilizan para neutralizar la acidez de la leche. Las directrices de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y otras autoridades de seguridad alimentaria especifican el límite seguro de consumo de estos productos químicos20. El límite de seguridad de la urea en la leche es de 70 mg/100 mL21. Para el peróxido de hidrógeno y el almidón, los límites máximos de residuos (LMR) son \(0,05\%\) v/vy \(0,15\%\) v/v respectivamente22. Para detergente y jabón, el límite de seguridad es inferior a 0,002 mg/kg23. Según la Autoridad de Normas y Seguridad Alimentaria de la India (FSSAI), la leche no debe contener ninguna cantidad añadida de sal y carbonatos24. El consumo de estos contaminantes por encima del límite seguro puede provocar enfermedades nocivas como insuficiencia renal, muerte infantil, complicaciones gastrointestinales, diarrea, insuficiencia renal e incluso cáncer en humanos21.

Diferentes técnicas de laboratorio como la prueba de densidad lactómetro, prueba de punto de congelación, prueba de proteína Kjeldahl25, prueba de grasa de Gerber y otras26 se han utilizado durante mucho tiempo para caracterizar diferentes propiedades de la leche. Sin embargo, estos procesos no pueden detectar la mayoría de los adulterantes químicos. Los investigadores han desarrollado varias técnicas de detección para diversos adulterantes, como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), espectroscopia infrarroja, espectrometría de masas, análisis de señales electroquímicas, fluorescencia, admitancia y detección colorimétrica con nanopartículas27,28,29,30,31 ,32,33, entre otros. Por otro lado, estas pruebas de laboratorio basadas en instrumentos son costosas y, en muchos casos, consumen mucho tiempo. Además, estos métodos tienen desventajas, que incluyen peso, disponibilidad, consumo de energía y requisitos de habilidad. Por lo tanto, la motivación de este trabajo es diseñar y fabricar un dispositivo34 accesible y de bajo costo que se pueda usar en una variedad de entornos, incluidos los escenarios domésticos.

Las técnicas de microfluidos en papel podrían ser la alternativa potencial para abordar las desventajas mencionadas anteriormente en el contexto de la detección de adulterantes en la leche35,36,37,38. Se informa que los enfoques microfluídicos basados ​​en papel se han utilizado para detectar metales pesados39,40, anticuerpos41, dióxido de azufre42, ácido benzoico43, D-glucosa44, formaldehído9 y otros compuestos en varias muestras de alimentos líquidos basados ​​en la detección colorimétrica. Whitesides et al.45 crearon un dispositivo basado en papel para detectar glucosa y proteínas en muestras de orina. Para dar una dirección adecuada al flujo, los autores recubrieron los papeles de cromatografía con agentes hidrofóbicos (SU-8 2010), seguido de la exposición a la luz ultravioleta para volver hidrofílicos los canales. Sin embargo, la técnica de fotolitografía adoptada en su estudio es costosa y complicada. Por lo tanto, los investigadores han desarrollado métodos más simples para crear barreras hidrofóbicas46, como la impresión de cera47, la impresión de tinta de tóner usando una impresora láser48, el tratamiento con plasma de papel hidrofóbico49, la impresión 3D50, el patrón de humectabilidad usando \(TiO_2\)51,52, usando un lápiz hidrofóbico53, e incluso utilizando un lápiz corrector54. Se fabrica una tarjeta de prueba de papel para detectar urea, almidón, glucosa y otros adulterantes en la leche mediante el análisis de prueba puntual al hacer puntos de detección hidrofílicos12,55. Utilizando la técnica de impresión de cera56,57,58, revestimiento de PDMS59,60, etc., se fabrican barreras hidrofóbicas para almacenar los reactivos químicos en la zona circular hidrofílica. Después de unos minutos, las reacciones colorimétricas se capturan en los teléfonos celulares y se utilizó el análisis de imágenes para determinar la cantidad de adulterantes agregados39,43,44,61,62. Estos métodos tienen inconvenientes como la baja resolución, el alto costo, la falta de disponibilidad de la impresora de cera, la fuerza de la barrera hidrofóbica, la falta de detección simultánea, etc. Por otro lado, el método de impresión por chorro de tinta63 es simple, rápido y económico, pero la fuerza de la barrera es insuficiente para restringir el flujo de reactivos dentro de la zona de detección para diferentes muestras líquidas. Estos diversos métodos de fabricación de barreras hidrofóbicas demuestran la importancia de la investigación para desarrollar una técnica de fabricación simple. A pesar de varias ventajas mencionadas anteriormente, los dispositivos basados ​​en papel sufren varios problemas. La estructura porosa del papel a menudo disminuye el transporte de líquido a la ubicación deseada debido a la dispersión del líquido en todas las direcciones. Otras desventajas relacionadas con los dispositivos de microfluidos basados ​​en papel son la pérdida de muestra debido a la evaporación, el paso de pretratamiento de la muestra, baja sensibilidad, alto LOD, menor vida útil de los reactivos almacenados y, lo que es más importante, falta de comercialización64.

Aquí, hemos creado un diseño novedoso para un dispositivo de microfluidos basado en papel de bajo costo, portátil y 3D que puede detectar múltiples adulterantes simultáneamente en una muestra líquida utilizando un pequeño volumen de muestra líquida (1-2 ml). El flujo de líquido se produce en los sustratos de papel poroso debido a la acción capilar inherente. Como no se utilizan recubrimientos (super)hidrofóbicos, el dispositivo es duradero y se puede utilizar para la detección de adulterantes en muchos alimentos líquidos. El diseño patentado (aplicación n.º 345721-001) del dispositivo 3D garantiza que el caudal de líquido siga siendo el mismo que el del sustrato de papel puro. Se realizan algunos cortes en la capa de soporte intermedia para reducir la resistencia del flujo de líquido sobre el sustrato de papel, y la velocidad del flujo de líquido sigue siendo la misma que en la caja de papel puro. La técnica de detección colorimétrica identifica los adulterantes en las zonas de detección, y se ha realizado un análisis cuantitativo mediante un test de intensidad de color. Por primera vez, demostramos que el dispositivo podía detectar urea, detergentes, jabón, almidón, peróxido de hidrógeno, carbonato ácido de sodio y sal simultáneamente en muestras de leche. La técnica de detección de adulterantes simultánea patentada (aplicación n.º 202141024502) para muestras de leche es mejor que la detección convencional basada en una sola tira, en la que se requieren varios experimentos para identificar un adulterante. La cantidad de adulterantes añadidos en la leche se cuantifica mediante la prueba de intensidad de color, con límites de detección que van desde \(0,05\%\) (vol/vol) a \(0,2\%\) (vol/vol) para diferentes adulterantes utilizando la dispositivo. Una técnica de fabricación rápida y sencilla hace que el dispositivo sea adecuado para su uso en entornos con recursos limitados. El diseño del dispositivo es escalable, lo que permite modificar fácilmente el número de puntos de detección. Además, utilizando el diseño actual del dispositivo, descubrimos que el límite de detección se acerca a las técnicas de detección basadas en instrumentos existentes. Por lo tanto, este dispositivo cumplirá con los criterios ASSURED (asequible, sensible, específico, fácil de usar, rápido y robusto, sin equipos, entregado a quienes los necesitan) al abordar tanto los aspectos técnicos (ASSR) como los de aceptación del usuario (UED). juntos.

Se detectan diferentes adulterantes utilizando un sistema de microfluidos basado en papel a través de técnicas colorimétricas. La Tabla S1 muestra las variaciones de color de las zonas de detección en presencia de diferentes adulterantes. La figura 1 muestra el cambio de color a medida que aumenta la concentración de adulterantes agregados. La ilustración muestra que cuando aumenta la concentración de adulterantes, también aumenta la intensidad del color particular. La aparición de patrones de color no uniformes en la zona de detección se debe a la deposición de reactivos químicos después de la evaporación del solvente. El control del flujo de evaporación y el flujo interno de Marangoni/flotabilidad para crear un patrón de color uniforme en la zona de detección está más allá del alcance de esta investigación. Sin embargo, la variación de la intensidad del color a lo largo del radio de los puntos circulares se muestra en la Fig. S1. Es fácilmente visible que no hay mucha variación para la concentración más baja, mientras que para la concentración más alta, la variación de color es mayor. Encontramos que la intensidad del color disminuye desde el centro hacia la dirección radial para algunos adulterantes. Sin embargo, la intensidad aumenta desde el centro hacia la dirección radial para el peróxido de hidrógeno y la urea. Las pruebas de intensidad de color se utilizan para cuantificar la cantidad de adulterantes adicionales. Se producen pequeñas manchas hidrófilas circulares en el papel para mantener los productos químicos en la plataforma de prueba puntual. Luego, la leche pura se mezcla con cantidades variables de adulterantes (\(\rho\)) y se vierte en el punto circular con una jeringa. Todos los puntos tienen 10 \(\upmu\)L de reactivos y 20 \(\upmu\)L de muestras. La urea, los detergentes, el almidón, la sal, \(H_2O_2\), \(NaHCO_3\) y los jabones se prueban a temperatura ambiente. Los puntos de detección cambiaron de color tan pronto como la muestra entró en contacto con los reactivos. No hay demora de tiempo para cambiar el color en los puntos de detección en presencia de los adulterantes. Para comprobar la repetibilidad de la intensidad del color para la misma concentración, realizamos la prueba Anova sobre los valores de intensidad. En la Tabla S2, mostramos un resumen de la prueba Anova unidireccional donde se acepta la hipótesis nula de considerar que todas las medias de los valores de intensidad de color son iguales.

El cambio de color después de la reacción colorimétrica para diferentes concentraciones de adulterantes se ha mostrado para todos los adulterantes.

Se muestran las curvas de intensidad de color para ocho adulterantes diferentes con concentraciones variables de \(0.05\%\) a \(1\%\) (v/v) agregados en la leche para (a) urea, (b) almidón, (c) sal, (d) detergente, (e) peróxido de hidrógeno, (f) jabón y (g) carbonato ácido de sodio. De la figura queda claro que con el aumento de la concentración, la intensidad del color también aumenta.

Las intensidades de color promedio (I) de las zonas de detección se determinan utilizando técnicas de procesamiento de imágenes. Utilizando la aplicación ImageJ se obtienen los valores de intensidad de rojo (R), verde (G) y azul (B)48. Los valores de intensidad de gris normalizados se calculan para todos los adulterantes excepto la sal usando la ecuación. (1) y para la sal utilizando la ecuación. (2).

Las curvas de intensidad de color para todos los diferentes adulterantes con concentraciones variables (\(\rho\)) se dan en la Fig. 2. En la mayoría de las situaciones (excepto en la sal, donde el cambio de color ocurre de baja (marrón) a alta (blanca) intensidad ), empleamos valores de intensidad inversa (\(I '=255-I\)) para representar el color específico en orden ascendente a medida que pasaba de un color de alta intensidad a uno de baja intensidad. Hicimos una investigación cuantitativa de una cantidad desconocida de adulterantes agregados en la leche utilizando estas curvas de intensidad de color. La tabla S3 contiene las curvas de calibración descubiertas a través del ajuste de curvas \((R^2>0.95)\) de los gráficos de intensidad de color. Sin embargo, para realizar el análisis cuantitativo, hemos utilizado las curvas de ajuste de regresión lineal clásicas que se muestran en la Fig. 2. Con cinco experimentos repetidos en cada concentración diferente, se forman las curvas de intensidad de color y las barras de error se representan como la desviación estándar de la múltiples experimentos. Más detalles sobre el análisis de la intensidad del color se describen en la subsección de análisis de errores.

La linealidad en el rango de trabajo previsto debe validarse para cualquier curva de calibración. Para la mayoría de los casos de nuestro estudio, el rango lineal es el mismo que el rango dinámico, por lo que este proceso proporciona datos más exactos y precisos65. En la mayoría de los casos, las curvas son lineales ya que los valores de regresión llegan a más de 0,9 en el rango de \(0,05\% (v/v)\) a \(1\% (v/v)\). La investigación detallada del estudio de rango lineal se muestra en la Fig. 2. Aquí, hemos mencionado cualitativamente el límite visible de detección (LOD) de la reacción colorimétrica. La intensidad de los cambios de color se identifica mediante ImageJ, que se muestra en la Fig. 2. El cambio mínimo perceptible en la intensidad de color de cada caso se considera como el LOD del dispositivo66. Descubrimos que el LOD de estos adulterantes usando la metodología de detección colorimétrica es casi idéntico al de los métodos convencionales. La sensibilidad de las respuestas lineales y la comparación de los LOD de los procesos existentes con el trabajo actual se resumen en la Tabla 1. Sin embargo, existe la necesidad de mejorar aún más el LOD para usar el dispositivo para ensayos de campo, como máximo. límite de residuos (MRL) es menor que el LOD del dispositivo basado en papel. Este dispositivo no es lo suficientemente sensible para detectar la cantidad muy baja de adulterantes en las muestras de leche. Para mejorar aún más la sensibilidad del dispositivo, se puede integrar con detección electroquímica y colorimétrica, que es el alcance futuro de este estudio.

La intensidad del color también se prueba para la estabilidad en el tiempo. Las diferencias de intensidad de color para todas las zonas de detección se muestran en la Fig. 3 al principio y al final de 30 min. En el intervalo de tiempo de 30 min, observamos que la diferencia máxima entre las intensidades de color al inicio y al final se encuentra \(4.8\%\) para el adulterante de peróxido de hidrógeno. Está claro a partir de estos resultados que los usuarios pueden tomar imágenes después de un tiempo para realizar la prueba y, por lo tanto, la ausencia de imágenes instantáneas no tiene efecto en los resultados.

Los valores de intensidad de color de las zonas de detección se muestran aquí para 1 min y 30 min.

La representación esquemática de (a) el dispositivo compacto. La muestra se agrega al dispositivo a través del orificio en la tapa superior, para la prueba. (b) Vista detallada del dispositivo. Aquí se han mostrado tres capas como la cubierta superior \((L_1)\), el dispositivo microfluídico basado en papel 3D y la cubierta inferior \((L_2)\). (c) Aquí se muestra el dispositivo de microfluidos basado en papel 3D de doble capa. Esta es una estructura de sándwich donde un soporte sólido se intercala entre dos capas de papel de filtro. \(L_3\) representa la zona de transporte, \(L_4\) representa la capa de plástico sólido y \(L_5\) representa la zona de detección. (d) Diseño en la parte trasera de la cubierta inferior. Se da el nombre de los adulterantes y una banda de color para la identificación cualitativa y cuantitativa. ( e ) Se muestra la imagen de la detección simultánea de los siete adulterantes utilizando el dispositivo de microfluidos basado en papel 3D (solo la capa intermedia).

Se realiza un diseño 3D y se fabrica el dispositivo para realizar simultáneamente la prueba de adulteración múltiple. El esquema del dispositivo 3D se muestra en la Fig. 4. La Figura 4a muestra el esquema del dispositivo compacto, mientras que las Fig. 4b, c muestran la vista detallada del dispositivo y la capa intermedia de la estructura tipo sándwich, respectivamente. La Figura 4d muestra el diseño de la cubierta inferior. En la Fig. 4e se muestra la imagen experimental donde se realiza la detección simultánea de siete adulterantes en la capa intermedia. Estudiar la especificidad de los reactivos y el efecto de la interferencia en la intensidad del color de diferentes adulterantes es fundamental para la detección simultánea de adulterantes en el dispositivo 3D. Agregamos un adulterante específico a cada zona de reacción para el análisis de especificidad. Además de las zonas de detección, hemos creado una zona de control donde no se almacenan reactivos. Descubrimos un cambio casi insignificante en la intensidad del color en la zona de control para muestras puras y adulteradas. Como resultado, asumimos que el valor de intensidad de color de las muestras de leche en la zona de control es 255 porque aparece de color blanco puro. Se encuentra que hay un cambio de color en una ubicación específica solo para el adulterante específico. La Figura 5 muestra un estudio de especificidad detallado de todos los adulterantes. Todos los experimentos se llevan a cabo a una temperatura de \(25 \pm 2\) \(^\circ\)C. Preparamos las muestras adulteradas en agua destilada utilizando cada uno de los adulterantes por separado y luego los agregamos a todos los puntos de detección del dispositivo. Con base en estos resultados, podemos concluir que los reactivos son específicos para un solo adulterante o un grupo de adulterantes, ya que no cambian de color en presencia de otros químicos. También usamos leche pura para ver si había algún cambio de color en los puntos de detección. Sin embargo, los reactivos no afectan el color de la leche pura. Estos reactivos no reaccionan con ningún ingrediente de leche pura y reaccionan solo cuando los adulterantes están presentes, seguidos por el cambio de color. Por lo tanto, la prueba de interferencia de color se lleva a cabo considerando solo esos pocos adulterantes. Determinamos a partir de la prueba de interferencia que hay poco cambio en la intensidad del color durante la detección simultánea debido al efecto de interferencia de múltiples adulterantes. Para la prueba de interferencia, se preparan dos muestras de leche diferentes del mismo volumen con la misma cantidad de adulterantes añadidos. En una muestra, se mezclan todos los adulterantes, mientras que en otra solo se agrega un adulterante. Luego se realiza la detección colorimétrica de la mezcla y el adulterante único para determinar el cambio en la intensidad del color. La Figura S2 revela la detección colorimétrica de adulterantes tanto para una mezcla de adulterantes como para un solo adulterante. La Figura 6 muestra la diferencia en los valores de intensidad de color del adulterante único y la mezcla de los adulterantes. La interferencia de color se define como la diferencia en la intensidad del color entre la intensidad del analito individual y la mezcla de adulterantes. La comparación de las intensidades de color muestra que el efecto de interferencia de los adulterantes en la intensidad del color es significativamente menor. Como resultado de su especificidad razonable y cambio menor en la intensidad del color debido a la interferencia, es completamente posible la detección simultánea de adulterantes en la plataforma de microfluidos basada en papel.

Resultados experimentales de la prueba de especificidad. (a) Solo los reactivos se muestran en las diferentes zonas de detección donde el número representa las zonas de detección para urea (2), \(H_2O_2\) (3), jabón (4), sal (5), \(NaHCO_3\) (6), detergente (7), almidón (8) y control (1). Se ha demostrado la especificidad de los reactivos para (b) almidón, (c) urea, (d) \(NaHCO_3\), (e) \(H_2O_2\), (f) detergente, (g) jabón y (h) sal.

Aquí se muestra la diferencia en la intensidad del color de la mezcla adulterante y el adulterante único. La interferencia máxima se encuentra en aproximadamente \(30\%\) para el peróxido de hidrógeno, pero para todos los demás casos es menor que \(10\%\).

Los experimentos se llevan a cabo utilizando el 3D \(\mu\)PAD para la detección simultánea de múltiples adulterantes en un solo paso. La Figura 4e muestra la detección colorimétrica de múltiples adulterantes en un solo dispositivo. Para un volumen submicrónico de muestra, la dispensación requiere una configuración dedicada, lo que puede aumentar el costo del dispositivo. Además, aumentará el costo operativo y puede ser útil para usuarios expertos. Por otro lado, la detección colorimétrica requiere un volumen específico de reactivos. El cambio de color distintivo esperado no será apreciable en el caso de un volumen bajo de muestra o reactivo. Por lo tanto, después de varias pruebas, hemos utilizado reactivos de 10 \(\upmu\)L en todos los puntos de detección de este estudio. Para la detección simultánea de adulterantes en la muestra de leche se utiliza un volumen promedio de 1.5 mL de leche en diferentes experimentos. Sin embargo, se requieren estudios futuros para optimizar el volumen de muestras/reactivos, y debemos implementar las modificaciones de diseño correspondientes para medir y dispensar fácilmente la cantidad exacta de muestras. Se encuentra que el cambio de color ocurre típicamente tan pronto como la muestra ingresa a la zona de detección. Usando las curvas de calibración mencionadas anteriormente que se muestran en la Fig. 2, determinamos la cantidad agregada de adulterantes en las muestras de leche para el análisis cuantitativo. Antes de dispensar la leche en el dispositivo, se añaden diferentes cantidades de adulterantes a la muestra de leche. Después de la reacción colorimétrica, se toman imágenes con una cámara. Las intensidades de color se extraen de estas imágenes y se introducen en ecuaciones de calibración para calcular la cantidad añadida. En las curvas de calibración mencionadas en la Fig. 2, X representa los porcentajes (v/v) de adulterantes detectados en la leche, e Y representa los valores de intensidad de color de los puntos de detección después de las reacciones colorimétricas. La Tabla 2 muestra una comparación de la cantidad real de adulterantes agregados, los resultados de las curvas de calibración y la precisión del dispositivo. Hemos obtenido la tasa de recuperación (RT) del dispositivo de papel usando la relación 14,40,71,72, \(RT = \frac{\text {Cantidad recuperada}}{\text {Cantidad añadida}}\times 100\% \). Usando el dispositivo, los porcentajes de recuperación de los adulterantes agregados están en el rango de 85 a 107 % con una buena reproducibilidad de 0,50 a 3,51 % (RSD = Desviación estándar relativa) después de varios experimentos. Usando el método de detección de intensidad de color, logramos una precisión de detección de más de \(80\%\). El documento complementario muestra la imagen real de un dispositivo compacto usado en la Fig. S3. También hemos agregado un video de detección simultánea de adulterantes en muestras de leche utilizando el dispositivo de microfluidos basado en papel 3D en el video complementario S1.

Finalmente, se lleva a cabo una estimación de costos para fabricar el dispositivo microfluídico basado en papel 3D. Se conocen los precios de los químicos, papeles y solventes para una cantidad específica. Por lo tanto, dividimos el costo total de la cantidad específica para determinar el costo de la cantidad utilizada. El precio de una caja de 100 papel de filtro Whatman (grado 4) es Rs. 1300 (\(16.39\$\)), y usamos un papel para hacer un dispositivo. Como resultado, costará Rs. 13 (\(0,16\$\)). De manera similar, se usa una cierta cantidad de reactivos para hacer una solución de 10 mL con diferentes solventes, y solo se usan 10 \(\upmu\)L de esa solución para hacer el dispositivo. El precio para crear un dispositivo se enumera en la Tabla S4. El precio del disolvente está incluido en el precio del reactivo. Según el análisis de costos, el precio aproximado de un dispositivo es Rs. 17,70 (\(0,23\$\)). En el documento complementario de la Secc. S8.

En el presente trabajo, se fabrica y utiliza un dispositivo basado en papel (papel de filtro Whatman grado 4) para la detección simultánea de múltiples (siete) adulterantes en muestras de leche basado en la técnica colorimétrica. La observación revela que solo se requieren 1–2 ml de volumen de muestra para cada prueba y el tiempo de prueba es inferior a 30 s. Se llevan a cabo análisis cualitativos y cuantitativos, con un rango de recuperación de 85 a 107 % y un rango de RSD de 0,50 a 3,51 % utilizando las curvas de calibración desarrolladas. El rango lineal, la sensibilidad y el LOD de los adulterantes están cerca de los métodos existentes. El costo de la prueba de siete adulterantes es de aproximadamente \(0.23\$\) solamente. El método es confiable para detectar adulterantes en la leche en el acto. Además, el método ligero, económico, fácil de usar y respetuoso con el medio ambiente hace que este dispositivo sea adecuado para inspeccionar muchos alimentos líquidos. Se infiere de la investigación que el reactivo solo reacciona con el adulterante específico en este método y no con ningún ingrediente de la leche. Por lo tanto, esta herramienta analítica puede ayudar a monitorear la seguridad de los alimentos líquidos y, por lo tanto, aumenta la trazabilidad de la leche contaminada en áreas remotas de los países en desarrollo.

Cabe señalar que modificando adecuadamente los reactivos químicos, el dispositivo actual puede usarse no solo para leche sino también para agua, batidos de proteínas, jugos de frutas, etc. Además, el objetivo futuro es utilizar una aplicación móvil para realizar análisis cuantitativos. para determinar la concentración de adulterantes. También se hará hincapié en abordar la posible limitación del dispositivo desarrollado, por ejemplo, el efecto de evaporación del reactivo, una plataforma común para encontrar la intensidad del color en diferentes brillos, detectar cualquier adulterante desconocido utilizando inteligencia artificial, etc.

Sigma Aldrich proporciona productos químicos como para-dimetilaminobenzaldehído (p-DMAB), fenolftaleína, púrpura de bromocresol, solución de yodo, dicromato de potasio, nitrato de plata, yoduro de potasio, ácido rosólico, ácido clorhídrico y etanol, así como diferentes adulterantes como urea, peróxido de hidrógeno, hidrogenocarbonato de sodio y papel filtro Whatman grado 1 y 4 (forma rectangular y circular). Jabón, detergentes, almidón en polvo, sales, diferentes muestras de leche (muestras de leche tonificada disponibles comercialmente que contienen \(3\%\) grasa), papel fotográfico, láminas de PVC y otros artículos se adquieren en las tiendas locales. Todos los productos químicos se utilizan sin ninguna purificación adicional.

Todos los reactivos se disuelven en agua destilada o en etanol, según su solubilidad. Mediante técnicas de detección colorimétrica, se detectan todos los adulterantes en diferentes muestras líquidas. Para la detección de urea, se prepara una solución de p-DMAB \(1,6\%\) (p/v) disolviéndola en una solución concentrada de ácido clorhídrico \(10\%\) (v/v) en etanol. Para la detección de jabones y detergentes se utilizan \(1\%\) (p/v) solución reactiva de fenolftaleína disuelta en etanol y \(0.5\%\) (p/v) solución de púrpura de bromocresol disuelta en agua, respectivamente. \(1\%\) (p/v) yodo añadido a una solución de yoduro de potasio \(10\%\) (p/v) disuelta en agua para detectar almidón. Para la detección de sal, hemos utilizado la precipitación producida al mezclar una gota de solución de dicromato de potasio 0,1 N y una solución de nitrato de plata 1 N disuelta en agua. Se utiliza una solución saturada de yoduro de potasio disuelta en agua-etanol (3 : 1 v/v) para detectar \(H_2O_2\). Los neutralizadores como el hidrogenocarbonato de sodio se detectaron usando una solución de ácido rosólico \(1\%\) (p/v) disuelta en etanol. Hemos añadido una gota de leche contaminada a las zonas de detección después de adulterarla con diferentes químicos para comprobar las reacciones colorimétricas. La urea interactúa con p-DMAB en un medio ácido para producir una sustancia química amarilla (Fig. 7a). La Figura 7 muestra una ilustración esquemática de reacciones químicas. Realizamos esta prueba con varias concentraciones de urea para ver si hay alguna diferencia en la intensidad del color, y encontramos que con un aumento en la concentración de urea se produce un aumento en la intensidad del color amarillo. También se introducen diferentes adulterantes a la leche y se realiza detección colorimétrica. La solución de yodo se combina con el almidón para producir un compuesto azul (Fig. 7b). En presencia de detergente, el indicador de bromocresol da un tono índigo en un medio menos ácido (Fig. 7d), y la sal reacciona con la precipitación de dicromato de plata para dar una precipitación de cloruro de plata blanca (Fig. 7c). Se forma un compuesto de yodo de tono marrón cuando el peróxido de hidrógeno se combina con una solución saturada de yoduro de potasio (Fig. 7e). En presencia de jabón, la fenolftaleína adquiere un color rosado en el medio menos ácido, y el carbonato ácido de sodio se combina con la solución alcohólica de ácido rosólico para generar una molécula de color rojo rosado (Fig. 7g). Todas las medidas se realizan utilizando una balanza de pesaje (Pioneer, Ohaus) de 1 mg de precisión, un vaso medidor y una pipeta. Para el análisis de muestras de alimentos líquidos se ha utilizado agua destilada y leche tonificada. Para el análisis de prueba puntual, se agregan diferentes concentraciones de un adulterante a 10 ml de muestras líquidas. Para la detección simultánea de múltiples adulterantes, agregamos diferentes adulterantes a una muestra de leche de 10 ml. Debido a la adición de compuestos más sólidos en la leche, su densidad aumenta y, por lo tanto, se encuentra un valor mucho más alto en la lectura del lactómetro en comparación con la leche pura. Por lo tanto, agregamos agua destilada a la muestra para diluirla y que la lectura del lactómetro se mantuviera comparable a la de la leche pura. Los detalles de la preparación de la muestra se describen en el documento complementario en la Fig. S4.

Representación esquemática de las reacciones colorimétricas de (a) urea73, (b) almidón74, (c) sal75, (d) detergente76, (e) \(H_2O_2\)77, (f) jabón78 y (g) \(NaHCO_3\ )79.

Utilizamos análisis de prueba puntual para realizar la prueba de intensidad de color y determinar el límite de detección (LOD) de las mediciones. Los pequeños patrones circulares de 16 mm de diámetro se crean con el software de dibujo AutoCAD 2021 y se imprimen en una impresora láser comercial HP (Laser Jet Pro MFP M227fdn). El diámetro de la zona circular se calcula igualando el volumen disperso del líquido (40 \(\upmu\)L) con la altura y el área de la zona circular. Para que el papel impreso sea hidrofóbico, se deben bloquear los poros de ambos lados del papel. Entonces, el papel se calienta en una placa caliente (Spinot) durante 20 minutos a \(170 \pm 1\) \(^\circ\)C para bloquear los poros del otro lado48. La tinta se derritió y se extendió a través de los poros al otro lado del papel como resultado del calentamiento. Para estabilizar el recubrimiento, la hoja de papel se deja a temperatura ambiente durante 5 min. Medimos el ángulo de contacto de la barrera hidrofóbica con un goniómetro (Holmarc), que es \(120\pm 2^\circ\).

Hemos utilizado un sistema láser universal \(CO_2\) (10,6 \(\upmu\)m \(CO_2\) Laser, 60 W de potencia) (utilizado \(3\%\) de velocidad máxima, \(3\% \) de máxima potencia para papel, y \(11\%\) de máxima potencia y \(2\%\) de máxima velocidad para plástico) para cortar los papeles en las formas deseadas. El dispositivo microfluídico basado en papel 3D se compone de una cubierta superior e inferior (\(100 \times 100\) mm\(^2\)) y una capa intermedia de estructura tipo sándwich. Se proporciona un pequeño orificio de 10 mm de diámetro en la tapa superior para agregar la muestra. La cubierta inferior tiene múltiples orificios (16 mm de diámetro) para inspeccionar los resultados después de las pruebas. El dispositivo de papel con estructura tipo sándwich tiene una capa de plástico intercalada entre las dos capas de papel para mejorar la resistencia del dispositivo. En la capa de papel superior, hay un punto de entrada de muestra (10 mm de diámetro), pistas primarias (\(10 \times 6\) mm\(^2\)), pista anular (5 mm de ancho), pistas secundarias (\(5 \times 4\) mm\(^2\)), y una zona de transporte vertical (16 mm de diámetro). La capa de plástico soporta el papel y tiene varios cortes (\(10 \times 2\) mm\(^2\)) y orificios (12 mm de diámetro) para mejorar la velocidad y transmitir la muestra a la segunda capa del papel (Fig. . S5). La zona de detección (16 mm de diámetro) en la capa de papel inferior es donde se cargarán los agentes de detección. Se utilizan cinta de doble cara y pegamento para unir las zonas de transporte y detección a la capa de plástico, respectivamente. Este diseño 3D funciona bien para transportar líquidos más densos a una velocidad constante. El número de pruebas se puede aumentar modificando el tamaño de la pista del anillo. Durante las pruebas, las sustancias se vierten en la pequeña abertura de la tapa superior (1–2 mL) y se mueven a la zona de detección a través de las pistas de papel debido a la acción capilar. Se proporciona una cubierta transparente en el exterior del dispositivo para reducir la tasa de evaporación del reactivo. El papel se trata con reactivos y se deja secar. Ambas capas de papel se adhieren a ambos lados del soporte después del secado, y las cubiertas se adhieren con cinta de doble cara. Por un lado guardamos los reactivos y por el otro guardamos las muestras. La muestra entra en contacto con otra capa a través de los orificios de soporte debido a la movilidad vertical del líquido. Las imágenes de las zonas de detección son tomadas por una cámara DSLR (Nikon D750) con una lente de distancia focal de 105 mm, manteniendo una apertura de lente constante de f/4.5, ISO 1000 y una resolución de \(2624 \times 3936\) píxeles cada vez. Debido a su alta porosidad (tamaño de poro promedio de 25 \(\upmu\)m) y espesor (210 \(\upmu\)m), en este diseño se usa papel de filtro Whatman grado 4, que ayuda al flujo de líquido y permite para el almacenamiento de más reactivos. Comparamos las cualidades del papel de grado 4 con las del papel de filtro de grado 1 (utilizado principalmente en investigación, tamaño de poro de 11 \(\upmu\)m, espesor de 180 \(\upmu\)m) mediante la ejecución de múltiples experimentos de flujo de líquido a través de ambos tipos de papel Los resultados demuestran que el flujo es más rápido en el papel de filtro Whatman de grado 4 que en el de grado 1 (Fig. S6).

Utilizando este diseño, hemos superado ciertas desventajas de los estudios anteriores. La detección simultánea de múltiples adulterantes se realiza utilizando el dispositivo 3D propuesto. No hemos utilizado ningún material hidrofóbico para hacer la ruta hidrofílica y los diferentes puntos circulares en el diseño actual del dispositivo. Por lo tanto, no hay problema de fuga de reactivos del dispositivo debido a la débil resistencia de la barrera hidrofóbica. Nuestro método propuesto es fácil y escalable al eliminar el paso de recubrimiento hidrofóbico. Utilizando dos capas de papel para el transporte y la detección, hemos solucionado la contaminación cruzada de los reactivos. Otra ventaja de hacer una estructura 3D de dos capas de papel es que el flujo de líquido no se interrumpe debido al bloqueo de los poros del papel. Si se utiliza una capa de papel para realizar los experimentos, se producirá un reflujo de los reactivos a través de los canales de papel y, finalmente, se bloquearán los poros. Por lo tanto, hicimos un diseño 3D donde el flujo de muestras líquidas y el almacenamiento de reactivos se realizaron en dos capas separadas, y la muestra llegó a las zonas de detección desde la parte superior.

En el diseño 3D (Fig. 4c), la capa de papel superior está unida a un soporte de plástico en la parte inferior cuyo grosor es similar al grosor del papel. Entonces, el flujo de líquido debe interrumpirse debido a la fuerza de resistencia en la parte inferior del papel. Hemos comparado el flujo de líquido de tres casos diferentes y hemos considerado el caso óptimo para fuerza y ​​velocidad. Se toman tiras de papel (\(30 \times 6\) mm\(^2\)) y se realizan múltiples experimentos utilizando una configuración de sujeción de papel. Como el líquido fluye a través de toda la sección de papel horizontal en 30 s, en el caso de papel solo, se aplica el modelo analítico convencional de Lucas-Washburn (sin gravedad)16,80. En este modelo, el equilibrio de fuerzas se considera entre la fuerza capilar y la fuerza de resistencia viscosa, donde la altura capilar (L) está relacionada con el tiempo (t) como \(L \propto t^{0.5}\). Llamamos a este único caso de papel Tipo 1 y encontramos que satisface la relación convencional.

El tipo 1 es mejor que los otros casos posibles, ya que no hay fuerza de resistencia actuando en el reverso del papel. A continuación, analizamos dos casos más en los que el papel con soporte de plástico en la parte posterior se denomina Tipo 2 y el papel con soporte de plástico con un canal cortado en la parte posterior se denomina Tipo 3. La representación esquemática de los tres casos se ilustra en la Fig. 8a. En cada uno de los tres ejemplos, se llevan a cabo muchas pruebas de flujo de líquido. Los resultados de los experimentos se comparan en la Fig. 8b. Descubrimos que la velocidad del flujo es casi idéntica en el Tipo 1 y el Tipo 3, pero es ligeramente menor en el Tipo 2 debido a la alta resistencia. Como resultado, elegimos el Tipo 3 como el mejor escenario porque brinda resistencia debido a la capa de plástico y tiene una velocidad de flujo similar al Tipo 1 debido a la fuerza de resistencia reducida causada por los cortes.

Aquí se muestra la representación esquemática de la capa de soporte, (a) para los tres casos, Tipo 1, Tipo 2, Tipo 3. (b) Comparación de los experimentos de distancia recorrida por el líquido en los tres casos diferentes.

El esquema gráfico del análisis estadístico se muestra aquí. (a) Aquí se muestra el rango \(\pm \sigma\) bajo la curva de distribución gaussiana. (b) Aquí se muestra la gráfica Q-Q de un conjunto particular de experimentos para verificar la tendencia de distribución normal de los valores de intensidad de color.

Se realiza un análisis de error detallado y se enumera en la Tabla 3. Aquí mostramos la instrumentación y el error sistemático para medir el volumen, el peso, la longitud y la intensidad del color. El volumen se mide midiendo el frasco y la pipeta, que tienen incertidumbre de instrumentación. El peso se mide con una balanza que también tiene incertidumbre de instrumentación. Se consideró la incertidumbre de la instrumentación al medir la longitud con un cortador láser. Para experimentos repetidos, se considera la incertidumbre sistemática para medir la intensidad del color. Seleccionamos el punto con la barra de error máximo de todos los puntos de datos y encontramos el porcentaje de incertidumbre para el mismo.

Además, las intensidades de color de las zonas de detección para todos los adulterantes se analizan estadísticamente. Todos los datos de intensidad de color muestran la tendencia de distribución normal. Para obtener el valor promedio de las intensidades de color de los experimentos repetidos, hemos considerado los datos debajo del área \(67\%\) de la curva de distribución gaussiana. La representación esquemática de la curva de Gauss se muestra en la Fig. 9a. También realizamos el análisis gráfico Cuantil-Cuantil (Q-Q) para comprobar la tendencia gaussiana. En la Fig. 9b se muestra una representación de la gráfica Q-Q para el hidrógeno-carbonato de sodio, donde la cola no coincide con la línea recta. Descubrimos que la distribución gaussiana de la intensidad del color está sesgada hacia la derecha y hacia la izquierda, pero el cuerpo principal coincide con la distribución gaussiana. La gráfica de datos dispersos de algunos adulterantes para todas las diferentes concentraciones se muestra en la Fig. S7. También hemos realizado el análisis de regresión bayesiano con todos los puntos de datos. Una descripción detallada del análisis de regresión bayesiano para algunos adulterantes se describe en los documentos complementarios S1. La tabla de regresión bayesiana para los adulterantes se muestra en la Tabla S6.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado [y sus archivos de información complementarios]. Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual también están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Esta investigación cuenta con el apoyo del Instituto Indio de Tecnología de Madrás al Micro Nano Bio Fluidics Group bajo el financiamiento del esquema de Instituciones de Eminencia del Ministerio de Educación, Gobierno de la India [Sanción. No: \(9/11/2019-U.3(A)\)]. SP agradece la ayuda de Siddhant Mohapatra durante el análisis de los datos. PSM agradece las fructíferas discusiones con el Dr. Puja Dudeja y el Dr. Subarna Sinha Mahapatra por comprender la gravedad del problema de la adulteración de la leche en la India.

Grupo Micro Nano Bio-Fluids, Departamento de Ingeniería Mecánica, Instituto Indio de Tecnología Madras, Chennai, 600036, India

Subhashis Patari, Priyankan Datta y Pallab Sinha Mahapatra

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SP diseñó los experimentos, caracterizó las actuaciones y analizó los datos. PSM supervisó este estudio. Todos los autores escribieron y revisaron el manuscrito y discutieron los resultados.

Correspondencia a Pallab Sinha Mahapatra.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Información complementaria 2.

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Reimpresiones y permisos

Patari, S., Datta, P. & Mahapatra, PS Dispositivo de detección de adulteración de leche basado en papel 3D. Informe científico 12, 13657 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17851-3

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Recibido: 28 abril 2022

Aceptado: 02 agosto 2022

Publicado: 11 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17851-3

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