Validación de métodos analíticos para la determinación de ensayo de cannabidiol y tetrahidrocannabinol en productos infundidos con aceite de cáñamo por RP

Mar 09, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12453 (2022) Citar este artículo

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Se ha desarrollado y validado un método de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa cuantitativa simple (RP-HPLC) para la determinación de cannabidiol y tetrahidrocannabinol en productos infundidos con aceite de cáñamo. El método RP-HPLC se desarrolló y optimizó para la composición de la fase móvil, el caudal, la selección de la columna y la longitud de onda del detector. Se realizó una elución isocrática de las muestras en una columna SOLAS 100 Å C18 de 150 mm × 4,6 mm y 5 μm con una fase móvil que contenía 75/25 de acetonitrilo/agua v/v, con un caudal de 1,5 ml/min mediante el uso de un ultravioleta– detector visible (UV/Vis) que funciona a 214 nm. El método RP-HPLC fue validado para cumplir con los requisitos reglamentarios que cubren especificidad, exactitud, rango, linealidad, precisión, idoneidad del sistema y solidez. El método de prueba de ensayo validado se aplicó con éxito para cuantificar cannabidiol y tetrahidrocannabinol en productos comerciales infundidos con aceite de cáñamo, como tabletas, cápsulas de gelatina blanda, aceites de extracto de plantas, gotas orales, tintura y potenciadores de bebidas. Todos los resultados de las pruebas se consideraron aceptables según las pautas de ICH, y esto confirmó la viabilidad de este método para su uso previsto en el control de calidad regular y el análisis de cannabidiol y tetrahidrocannabinol en productos infundidos con aceite de cáñamo.

A medida que crece el mercado de productos con infusión de cáñamo, los consumidores son cada vez más conscientes de los estándares de calidad con los que se prueban estos productos. Además, para el cannabis medicinal, las pruebas precisas son importantes ya que los pacientes exigen efectos terapéuticos específicos. Es por esta razón que la industria del cáñamo/cannabis se esfuerza por realizar cada vez más pruebas activas para cuantificar la fuerza y ​​la pureza de estos productos. El cannabis es una planta que pertenece a la familia Cannabaceae y contiene varios constituyentes naturales. Se han aislado e identificado un total de 565 compuestos de la especie C. sativa, de los cuales 120 pertenecen a la categoría de cannabinoides1,2. Los cannabinoides pertenecen a un grupo de compuestos terpenofenólicos con 21 átomos de carbono y se dividen en 11 subgrupos según su estructura química. Esto constituye 7 compuestos de Cannabidiol (CBD), 16 compuestos de Cannabigerol (CBG), 23 compuestos de ∆9-tetrahidrocannabinol (∆9-THC), 5 compuestos de ∆8-tetrahidrocannabinol (∆8-THC), 11 compuestos de Cannabinol (CBN), 9 compuestos de Cannabichromene (CBC), 5 compuestos de Cannabielsoin (CBE), 2 compuestos de Cannabinodiol (CBND), 3 compuestos de Cannabicyclol (CBL), 9 compuestos de tipo Cannabitriol (CBT) y los 30 compuestos restantes pertenecen a miscelánea type3. CBD, THC, CBG, CBN y CBC son cannabinoides neutros y se sintetizan mediante una reacción de descarboxilación de sus respectivas formas ácidas naturales (CBDA, THCA, CBGA, CBNA y CBCA). De los 120 cannabinoides, el CBD y el THC son los dos principales biomarcadores en las muestras comerciales de aceite de cáñamo4. CBD (Fig. 1a), el ingrediente farmacéutico activo (API) que se encuentra en los productos de aceite de cáñamo medicinal y muestra varias propiedades curativas, como antipsicótico, ansiolítico, antiemético, estimulante del apetito, analgésico y relajante muscular. efectos5. Por otro lado, el THC (Fig. 1b) es el principal componente psicoactivo del cannabis, y es la razón por la cual el cannabis se usa como droga recreativa5. Según el US Farm Bill 2018, el cáñamo se define como 'la planta Cannabis sativa L. y cualquier parte de esa planta, incluidas sus semillas y todos los derivados, extractos, cannabinoides, isómeros, ácidos, sales y sales de isómeros, ya sea en crecimiento o no, con una concentración de delta-9 tetrahidrocannabinol de no más del 0,3 por ciento en peso seco'6. Esto hace que la necesidad de un método cuantitativo para la determinación simultánea de CBD y THC en productos de cáñamo sea de vital importancia. La composición de los niveles de CBD y THC tiene una fuerte influencia en la legalidad y los efectos fisiológicos del producto final.

(a) Cannabidiol y (b) Tetrahidrocannabinol: representación estructural de CBD y THC. Fórmula: C21H30O2; Peso molecular: 314,464 g/mol.

Una extensa encuesta bibliográfica reveló que ha habido varios métodos analíticos para cuantificar los cannabinoides en extractos de plantas de cannabis y los métodos más utilizados utilizan cromatografía de gases (GC) junto con detectores de espectrometría de masas (MS)7,8,9,10,11,12,13 ,14. El método GC limita la cuantificación de análogos ácidos como resultado de la descarboxilación debido a las condiciones de entrada y horno calientes. Además, se encontró que el proceso de descarboxilación es incompleto y genera dificultades en el análisis cuantitativo. En GC, la determinación de cannabinoides ácidos requiere extensos pasos de derivatización15 que pueden llevar mucho tiempo y ser costosos para los laboratorios comerciales. Para la cuantificación de cannabinoides tanto ácidos como neutros, se utilizan métodos basados ​​en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)16, cromatografía en capa fina (TLC)17, HPLC acoplada a espectrometría de masas (HPLC/MS)18, cromatografía de fluidos supercríticos de ultra alta resolución ( UHPSFC)19, cromatografía líquida acoplada con MS (LC-MS)20,21,22,23 y técnicas cromatográficas de partición centrífuga24. Los métodos que muestran la determinación cuantitativa de CBD en aislado puro también se publicaron anteriormente25. De todos los métodos, los métodos de HPLC se identificaron como los más simples, ya que permiten la determinación de formas tanto ácidas como neutras e incluso el sistema no requiere costosos detectores de MS. Se publicaron varios métodos que utilizan HPLC26,27,28,29,30,31 y la mayoría de estos métodos emplean fases móviles tampón y técnicas de elución en gradiente32,33. Además, estos métodos demuestran la separación de la mezcla de cannabinoides cuando incluye varios cannabinoides además del CBD y el THC28,34,35,36,37. También se informaron los métodos de HPLC más simples que utilizan técnicas de elución isocrática en las que la fase móvil consiste únicamente en modificadores orgánicos38,39. La industria del cáñamo exige el desarrollo de metodologías analíticas simples, sólidas, precisas y eficientes para la cuantificación de los principales componentes, como el CBD y el THC, con el fin de mantenerse al día con los requisitos regulatorios de esta industria que cambian rápidamente. El aceite de cáñamo se usa actualmente para formular varios bienes de consumo y complementos alimenticios novedosos. Los ejemplos de dichos productos incluyen potenciadores de bebidas, chocolates, cápsulas, tópicos, productos horneados y también medicamentos sin receta en forma de tabletas, tinturas, cápsulas, gotas orales y gotas sublinguales.

Aquí, demostramos la viabilidad del método HPLC de fase inversa (RP-HPLC) para la determinación cuantitativa confiable y rápida de CBD y THC en productos de aceite de cáñamo. Este método utiliza elución isocrática que hace que el método sea factible de realizar en cualquier sistema de HPLC estándar. Además, el método funciona bien en condiciones de temperatura ambiente y utiliza únicamente una fase móvil de modificador orgánico. La especificidad, la linealidad, la exactitud, el rango, la precisión y la solidez del método analítico se determinaron de acuerdo con los requisitos de validación del método de ensayo especificados en la directriz de calidad Q2(R1) del consejo internacional para la armonización (ICH), "Validación de procedimientos analíticos: prueba y metodología". " para la cuantificación de CBD y THC por cromatografía líquida40.

El análisis de RP-HPLC se realizó en un Jasco Extrema (JASCO, Inc., 28600 Mary's Court, Easton, Maryland 21601, EE. UU.) conectado con un automuestreador incorporado (AS-4150), bomba cuaternaria (PU-4180) con un desgasificador de línea, horno de columna (CO-4061), detector UV/Vis (UV-4075) y una caja de interfaz LC-NetII/ADC. Los datos cromatográficos se recopilaron y analizaron utilizando el software ChromNAV Ver.2. Un segundo sistema de HPLC (serie Agilent 1100) equipado con detector de longitud de onda variable (G1314A VWD), muestreador automático (G1313A) y sistema de bomba isocrática (G1310A). Este sistema se automatizó con un software Chemstation (Agilent technologies) y se usó para pruebas de precisión intermedia (repetibilidad) y recopilación de datos. Las separaciones cromatográficas se lograron utilizando la columna SOLAS 100 Å C18 de 150 mm × 4,6 mm y 5 µm (Glantreo limited, Irlanda). Diferentes columnas de HPLC como SOLAS ODS C18 150 mm × 4,6 mm 5 µm, SOLAS ODS C18 150 mm × 4,6 mm 3 µm, SOLAS BDS C18 150 mm × 4,6 mm 5 µm, SOLAS BDS C18 150 mm × 4,6 mm 3 µm y EIROSHELL C18 150 mm × 4,6 mm 2,6 µm (Glantreo limited) se utilizaron para el desarrollo de este método. Cada sustancia química y las muestras de prueba se pesaron con precisión utilizando una balanza analítica (Adventurer Pro AS214, Ohaus Corporation, Pine Brook, NJ, EE. UU.).

Se utilizaron todos los reactivos y productos químicos de HPLC o de grado analítico, incluido el acetonitrilo de Alfa Aesar (Thermo Fisher Scientific, Lancashire, Reino Unido) y agua destilada de nuestras instalaciones. Los estándares de referencia de cannabidiol (CBD) y Δ9-tetrahidrocannabinol (Δ9-THC o THC) se adquirieron comercialmente de Cerilliant (Cerilliant Corporation, Round Rock, Texas, Estados Unidos). La mezcla de fitocannabinoides 10 se adquirió de Cayman Chemical (Cayman Chemical Company, 1180 East Ellsworth Road, Ann Arbor, Michigan 48108 EE. UU.). Prism Science LLC, 30403 Kings Valley Dr., Conifer, CO 80433 proporcionó amablemente tabletas de CBD (Santeer LUV 5 mg CBD Tablets-Medium) y tabletas de placebo para la prueba. Los filtros de membrana Millex-LCR PTFE de 0,45 um se adquirieron de Merck Millipore Ltd., Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, Irlanda.

Se utilizó una fase móvil de acetonitrilo y agua 75/25 v/v con flujo isocrático de 1,5 mL/min. La temperatura de la columna se mantuvo a 25 °C y la detección se realizó a 214 nm. Se inyectaron 10 µL de soluciones estándar y de muestra en el sistema de HPLC, donde se utilizó un tiempo de ejecución de 10 min para el estándar de CBD y 20 min para la idoneidad del sistema y las muestras de ensayo. Para el desarrollo del método, se inyectaron 20 µL de solución estándar de trabajo de la mezcla de fitocannabinoides 10 en el sistema de HPLC.

Se prepararon soluciones estándar madre de 100 µg/ml de CBD y 100 µg/ml de THC disolviendo 1,0 ml de estándares de referencia de CBD y THC en 10 ml de acetonitrilo en matraces volumétricos por separado. Se diluyó 1,0 ml de solución estándar madre de THC con 10 ml de acetonitrilo y se usó como solución madre estándar final que contenía 10 µg/ml de THC.

Para optimizar los parámetros del método cromatográfico, solución estándar de trabajo de 10 µg/ml de CBD, preparada diluyendo 1,0 ml de estándar madre de CBD a 10 ml con acetonitrilo. Se utilizó una mezcla de fitocannabinoides de 25 µg/ml-10 solución estándar de trabajo, preparada diluyendo 1,0 ml de solución estándar de 250 µg/ml a 10 ml con acetonitrilo. Se consideró una fase móvil que variaba de 60/40 v/va 80/20 v/v de acetonitrilo/agua y se estudió un caudal de 1,5 ml/min y 2,0 ml/min. Después de optimizar los parámetros de velocidad de flujo y fase móvil, se realizaron pruebas en diferentes longitudes de onda (214 nm, 228 nm, 230 nm, 240 nm, 280 nm y 305 nm). Se probaron columnas cromatográficas de 150 × 4,6 mm con diferente tamaño de partícula y química de columna. Las columnas consideradas fueron SOLAS C18 5 µm, SOLAS ODS 5 µm y 3 µm, SOLAS BDS 5 µm y 3 µm y EIROSHELL C18 2.6 µm. La columna cromatográfica que mostró una mejor eficiencia de separación se eligió para la prueba final.

Se diluyeron 1,0 ml de soluciones estándar madre de CBD y THC con 10 ml de acetonitrilo en un matraz volumétrico (mezcla estándar de concentración de 10 µg/ml de CBD y 1 µg/ml de THC cada una) y se usaron para el método de ensayo. Esta solución se utilizó para las pruebas de idoneidad del sistema en las que se realizaron seis inyecciones en HPLC y se determinó el recuento de placas, el factor de cola, la resolución y la reproducibilidad (porcentaje RSD del tiempo de retención, área del pico y altura para seis inyecciones).

La linealidad del ensayo se demostró mediante la preparación de cinco soluciones estándar dentro del rango de 50 a 150 % de la concentración nominal de la muestra (0,1 mg/mL). Cada solución se preparó por dilución en serie a partir de una única reserva (5–15 µg/mL para CBD y 0,5–1,5 µg/mL para THC) y se inyectó por triplicado. El análisis de regresión lineal se realizó sin considerar el origen como un punto de datos.

Para la especificidad, se prepararon soluciones de placebo no enriquecidas pesando el placebo equivalente al peso de una tableta de mezcla de placebo (pesaron 20 tabletas y calcularon el peso promedio) y se transfirieron a un matraz volumétrico de 50 ml, se agregaron 35 ml de acetonitrilo y se sonicaron durante 20 min. Diluido al volumen con acetonitrilo y mezclado bien (stock de placebo no enriquecido). Diluya 1,0 mL de esta solución a 10 mL con acetonitrilo, mezcle bien, filtre en un vial de toma de muestras automática después de descartar 2,0 mL de filtrado usando una unidad de filtro Millex PTFE de 0,45 µm. La preparación de placebo se inyectó por duplicado. Se prepararon dos soluciones enriquecidas separadas que contenían el activo al 100 % mediante la preparación de una solución madre de placebo no enriquecida por separado y se diluyeron en 1,0-10 ml con acetonitrilo, se agregaron 1,0 ml de solución estándar estándar de CBD y 1,0 ml de soluciones estándar estándar de THC, se mezcló bien y se filtró en vial del muestreador automático después de desechar 2,0 ml de filtrado utilizando una unidad de filtro Millex PTFE de 0,45 µm. (Concentración enriquecida: CBD—10 µg/mL y THC—1 µg/mL cada uno). Se inyectaron las muestras enriquecidas dos veces para confirmar la especificidad.

El rango para el método de ensayo se demostró mediante el análisis de soluciones de placebo enriquecidas en un rango entre el 50 y el 150 % de la concentración nominal de la muestra del método de CBD (10 µg/mL) y THC (1 µg/mL). Se prepararon tres pesos en cada uno de los cinco niveles de concentración y cada solución se analizó por triplicado. El análisis de regresión lineal se realizó sin considerar el origen como un punto de datos.

La precisión y la recuperación del método de ensayo se validaron mediante el análisis de los datos obtenidos de las soluciones de placebo enriquecidas durante la parte del rango de la validación. Se determinó el porcentaje de recuperación del peso de cada muestra individual y el promedio en cada nivel de concentración.

Para mayor precisión, las soluciones de muestra de ensayo se preparan de la siguiente manera:

Se pesaron con precisión cinco tabletas (mínimo), se calculó el peso promedio de las tabletas y luego se trituraron las tabletas hasta obtener un polvo fino. Se transfirió una muestra pesada equivalente a 5 mg de CBD a un matraz volumétrico de 50 ml. Se agregaron aproximadamente 35 ml de acetonitrilo y la solución resultante se sonicó durante 15 min con agitación intermitente. Luego, las muestras se diluyeron al volumen con acetonitrilo y se mezclaron bien. 1,0 ml de esta solución se diluyó a 10 ml con acetonitrilo, se mezcló bien y se filtró una porción a través del kit de filtración de muestra Millex PTFE de 0,45 µm en viales de HPLC después de desechar los 2 ml iniciales de solución de muestra. Siguiendo este procedimiento, se calculó que la muestra contenía 10 µg/ml de CBD. Posteriormente, se inyectaron 10 µl de las soluciones de muestra en el sistema de HPLC.

Para la precisión del método (repetibilidad), se prepararon seis muestras de ensayo y se determinó el porcentaje declarado de CBD y THC para cada muestra. La precisión intermedia del método se demostró realizando nuevamente el experimento de repetibilidad con un segundo analista. Este analista usó diferentes preparaciones de soluciones, reactivos, condiciones de operación, columnas y sistemas de HPLC y probó en días diferentes a los del primer analista.

La solidez del método se estableció mediante la variación de los parámetros cromatográficos para indicar la fiabilidad del método analítico propuesto durante el uso normal. Los parámetros cromatográficos considerados fueron la variación de la composición de la fase móvil, la temperatura del horno de la columna y el caudal de la fase móvil. En la fase móvil, la composición aumentó el componente principal en un 5 % y un 10 %, la temperatura del horno de la columna se incrementó y se redujo en 5 °C y la tasa de flujo aumentó y disminuyó en un 10 % y un 25 % con respecto a la condición del método propuesto. La solución estándar de idoneidad del sistema se inyectó por duplicado con cada cambio de parámetro.

El método de ensayo se desarrolló y validó de acuerdo con las directrices de la ICH con respecto a la idoneidad del sistema, la linealidad, la especificidad, la exactitud, el rango, la precisión (repetibilidad y precisión intermedia) y la solidez.

El enfoque de nuestra investigación fue desarrollar un nuevo método analítico para la determinación simultánea de CBD y THC en productos infundidos con aceite de cáñamo. Además, el método propuesto aquí se puede utilizar en laboratorios de análisis de drogas comerciales, industrias farmacéuticas y laboratorios de investigación como un procedimiento de control de calidad estándar. La optimización de las condiciones cromatográficas desempeña un papel importante en la detección y cuantificación precisas de los analitos en las técnicas de HPLC. Se examinaron las fases móviles que contenían diferentes porcentajes de acetonitrilo (60, 70, 75 y 80 %, v/v) y se anotó el tiempo de elución para CBD y la resolución entre CBD y CBG. Durante la prueba de diferentes composiciones de fase móvil, se empleó una velocidad de flujo de 2,0 ml/min y una longitud de onda de detección de 214 nm. Se utilizó una longitud de onda de detección de 305 nm para identificar el CBN en la mezcla de fitocannabinoides porque el CBN genera un pico fuerte a 305 nm. Los resultados de la prueba nos llevan a recomendar una concentración de fase móvil de 75/25 v/v acetonitrilo/agua. Se compararon velocidades de flujo de 1,5 ml/min y 2,0 ml/min y se finalizó la velocidad de flujo como 1,5 ml/min, donde el CBD eluyó con mejor eficiencia. Se verificaron diferentes longitudes de onda (214 nm, 228 nm, 230 nm, 240 nm, 280 nm y 305 nm) y se anotó la intensidad máxima de CBD. Se probaron diferentes columnas cromatográficas con dimensiones de columna de 150 mm × 4,6 mm para determinar su capacidad para resolver el CBD y el THC de otros cannabinoides. Todas las columnas probadas fueron fabricadas por Glantreo limited utilizando su propia plataforma de tecnología de sílice e incluyen SOLAS 100 Å C18 5 µm, SOLAS ODS 5 µm y 3 µm, SOLAS BDS 5 µm y 3 µm, y EIROSHELL C18 2,6 µm. Todos los resultados de las pruebas se tabularon y se muestran en la Tabla 1a–c.

De la Tabla 1a, está claro que una fase móvil de 75/25 v/v de acetonitrilo/agua con un caudal de 1,5 ml/min permite que el pico de CBD eluya con mayor eficiencia y también con una separación comparativamente mejor de CBG. La Tabla 1b mostró que las longitudes de onda del detector de 214 nm y 228 nm eran adecuadas porque en longitudes de onda más altas se observó una reducción significativa en la fuerza de la intensidad máxima para el CBD. En este método, 214 nm se consideró como la longitud de onda óptima, ya que en esta longitud de onda, el CBD eluye con mayor intensidad máxima y mejor eficiencia (Tabla 1b). La Tabla 1c indicó que la columna SOLAS C18 de 150 mm × 4,6 mm y 5 µm demostró una buena separación para la mezcla de fitocannabinoides 10 con una resolución superior entre CBG y CBD en comparación con las columnas SOLAS ODS de 5 µm, BDS de 5 µm y EIROSHELL de 2,6 µm C18. Además, la columna SOLAS C18 de 150 mm × 4,6 mm y 5 µm demostró una mayor eficiencia en términos de número de placas teóricas para CBD y también, con simetría de pico de CBD ≤ 1,5.

Se realizó una prueba de idoneidad del sistema para una mezcla estándar que contenía 10 µg/mL de CBD y 1 µg/mL de THC y se realizaron seis inyecciones repetidas en ambos sistemas de HPLC (Agilent 1100 y Jasco Extrema HPLC). Los valores de RSD observados para el tiempo de retención, el área del pico y la altura del pico están dentro de los límites establecidos de los criterios de aceptación de menos del 1 %. Se determinaron para el ensayo las placas teóricas (N), el factor de cola de USP (T), el factor de capacidad, la resolución de USP (Rs) entre CBD y THC, y el tiempo de retención relativo (RRT) de THC. Los resultados se resumen en la Tabla 2a y todos los resultados están dentro del límite aceptable establecido mencionado en la Tabla 2a. En la Fig. 2 se muestra un cromatograma típico de idoneidad del sistema.

Cromatograma de idoneidad del sistema de la mezcla estándar de CBD y THC (10 µg/ml de CBD y 1 µg/ml de THC) para el ensayo.

La linealidad de la respuesta del área del pico para CBD y THC se determinó para el método de ensayo analizando la mezcla estándar con diluciones en serie del 50 al 150 % de la concentración del método (10 µg/mL para CBD y 1 µg/mL para THC). El análisis de regresión lineal se realizó sin considerar el origen como un punto de datos. Tanto para CBD como para THC, se encontró que el porcentaje de RSD para el área del pico para las inyecciones por triplicado era inferior al 1,0 % y muestra respuestas lineales con r2 > 0,999 (Tabla 2b). En la Fig. 3 se muestra un gráfico de la concentración frente a la respuesta del área del pico (intensidad). En la Fig. 3 se muestra un gráfico de los residuos frente a la concentración del analito.

Diagramas de linealidad y gráficos residuales para la validación del método de ensayo de CBD y THC (a) Gráfico residual para CBD (b) Gráfico residual para THC (c) Gráfico de linealidad de ensayo para THC y (d) Gráfico de linealidad de ensayo para CBD.

Las muestras de placebo se prepararon pesando una cantidad adecuada de placebo (el placebo sigue siendo el 100 % de la concentración del método), con respecto a la concentración especificada en el método que se está validando. La preparación de placebo se inyectó por duplicado. Se prepararon dos soluciones enriquecidas separadas que contenían el activo al 100 %. Las muestras enriquecidas se inyectaron dos veces para confirmar la especificidad. En la figura 4 se presentan ejemplos de cromatogramas de preparaciones de diluyente en blanco, placebo sin enriquecer y placebo enriquecido. La figura 4 demostró la selectividad de este método porque no se observaron picos de interferencia del diluyente y el placebo. Además, se inyectó un solvente de muestra en blanco (acetonitrilo) después de cada décima inyección de muestra (antes de la inyección de estándar de control) y al final de cada secuencia cromatográfica para evaluar la presencia de arrastre ya que este método sigue la elución isocrática. Estas inyecciones de solvente de muestra en blanco también se incorporaron en la secuencia cromatográfica del análisis de muestra infundido con aceite de cáñamo de rutina como precaución para minimizar el efecto de las impurezas acumuladas de elución tardía en la columna, si las hubiera. Los cromatogramas para estas inyecciones de disolvente de muestra en blanco mostraron la ausencia de picos relacionados con metabolitos de cannabinoides o impurezas desconocidas en los tiempos de retención de CBD y THC, lo que a su vez demuestra la ausencia de acumulación en la columna de cualquier compuesto no retenido.

Cromatogramas de especificidad de (a) blanco de diluyente (b) placebo no enriquecido y (c) muestras de placebo enriquecido del ensayo de CBD y THC.

Las soluciones de placebo enriquecidas con una concentración de muestra que oscilaba entre el 50 y el 150 % de la concentración del método se prepararon por triplicado. Se realizaron tres inyecciones de cada preparación y se realizó un análisis de regresión lineal sin considerar el origen como punto de datos. Tanto los estándares de CBD como los de THC muestran una excelente respuesta lineal (r2 > 0.999 (Tabla 2b). Además, el porcentaje de RSD para las respuestas de área promedio para las inyecciones por triplicado y para cada nivel de concentración (n = 9, donde n es el número de inyecciones realizadas) fue inferior al 2,0 % (Tabla 2b).En la Fig. 5 se muestra un gráfico de la concentración frente a la respuesta del área.En la Fig. 5 se muestra un gráfico de los residuos frente a la concentración del analito.

Gráfico de respuesta de concentración frente a área de (a) CBD y (b) THC para pruebas de precisión y rango para el ensayo.

Se calculó el porcentaje de recuperación en cada muestra individual de placebo enriquecida y el promedio en cada nivel de concentración. Los resultados se tabularon en la Tabla 2b. Se encontró que el porcentaje de recuperación de los placebos enriquecidos era del 100 al 105 % para el CBD y del 98 al 100 % para el THC (criterios de aceptación: del 90 al 110 % según las pautas de la ICH40) para el promedio de cada conjunto de tres pesos. La recuperación de cada muestra individual también se encontró dentro del rango de 90-110%. Los datos de recuperación muestran la alta eficiencia de extracción de CBD y THC de este método.

La precisión del método (repetibilidad) se realizó mediante la preparación de seis soluciones de muestra de las tabletas para una concentración de 10 µg/mL de CBD donde se pesó el equivalente a 5 mg de CBD. Cada preparación se inyectó dos veces y se calcularon los valores del ensayo. Los resultados que incluyen los valores porcentuales de RSD de CBD y THC tanto para la repetibilidad como para la precisión intermedia se presentan en la Tabla 2b. Los valores porcentuales de RSD para CBD y THC están por debajo del 2,0%. Los cromatogramas de un estándar típico y soluciones de muestra (5 mg) se muestran en la Fig. 6. El cromatograma de muestra se comparó con los cromatogramas de estándar, placebo y blanco. Como parecía que CBG se superponía ligeramente con CBD en el cromatograma de la muestra de aceite de cáñamo, aún así la separación era distinta para permitir una integración adecuada. La precisión intermedia del método se demostró repitiendo el experimento de repetibilidad con un segundo analista. Este analista usó diferentes preparaciones de soluciones, reactivos, condiciones de operación, columnas y sistemas de HPLC y probó en días diferentes a los del primer analista. Se cumplieron todos los criterios de aceptación (el porcentaje de RSD de los valores del ensayo no debe ser superior al 2,0 %. El porcentaje de RSD de los valores del ensayo combinados de ambos analistas no debe ser superior al 3,0 % según las directrices de la ICH).

(a) Cromatogramas estándar y (b) de muestra de pruebas de precisión para la validación del método de ensayo de CBD y THC.

La robustez del método se demostró mediante la variación de la composición, la temperatura y el caudal de la fase móvil a partir de los parámetros especificados en el método propuesto. Se preparó un estándar de idoneidad del sistema (10 µg/ml de CBD y 1,0 µg/ml de THC) y se inyectó por duplicado con cada cambio de parámetro. Esta solución se usó para determinar la solidez del ensayo y cada cambio de parámetro se probó un factor a la vez. El tiempo de retención (RT), las placas teóricas (N), el factor de cola (T), el factor de capacidad (k), la resolución entre CBD y THC (Rs) y el tiempo de retención relativo (RRT) para THC se informan en la Tabla 3. El examen de los resultados de la Tabla 3 sugiere que la variación en la concentración de la fase móvil es un parámetro crítico, ya que con una disminución del 5 % y el 10 % en el volumen del componente principal (acetonitrilo) en la composición de la fase móvil, la elución de THC no está dentro de la ejecución del método. tiempo. Además, un aumento del 5% y el 10% en el componente mayoritario en la composición de la fase móvil da como resultado una eficiencia pobre (valores de placa teóricos reducidos, véase la Tabla 3). Las variaciones en la temperatura del horno de columna no muestran variación en ninguno de los parámetros de eficiencia del sistema o de la columna.

Además, la estabilidad de la solución se estableció durante 48 h al probar la idoneidad del sistema de las soluciones estándar dos veces utilizando un estándar recién preparado, las soluciones se mantuvieron a temperatura ambiente durante 24 h, las soluciones se mantuvieron a 0–8 °C durante 24 h y la solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 48 h. Los resultados muestran una variación insignificantemente pequeña en los valores de absorbancia del área del pico y demostraron la estabilidad de la solución estándar de 48 h a temperatura ambiente. Además, se probó una columna antigua en la que se realizaron > 500 inyecciones y se encontró una mayor cola y contrapresión en comparación con la columna nueva, lo que indica que la vida útil aproximada de esta columna de HPLC (SOLAS 100 Å C18, 150 mm × 4,6 mm 5 µm) es inferior a 500 inyecciones. .

La idoneidad de este método validado se estudió utilizando una amplia gama de tabletas con infusión de aceite de cáñamo proporcionadas por Prism Science LLC, 30403 Kings Valley Dr., Conifer, CO 80433. Las muestras incluían tabletas de PET Santeer LUV de 2,5 mg, 5 mg y 10 mg. , Santeer FOCUS y RENEW tabletas de 5 mg de CBD, y Santeer DREAM tabletas de 10 mg de CBD. Luego, este método se aplicó para cuantificar el CBD y el THC en varios productos infundidos con aceite de cáñamo y se presentó en un artículo publicado por Analakkattillam et al.41. Las muestras analizadas consistieron en tabletas, cápsulas, tintura, gotas orales, potenciadores de bebidas y aceites de extractos de plantas. Además, se descubrió que este método es adecuado para cuantificar el CBD y el THC en matrices complejas, como en los chocolates con infusión de aceite de cáñamo, donde los cannabinoides se extrajeron mediante el método de extracción QuEChERS42,43. Además, Glantreo limited actualmente emplea este método de ensayo para probar muestras infundidas con aceite de cáñamo comercial como un procedimiento de control de calidad.

La idoneidad de la eficiencia de este método para cuantificar CBD y THC se comparó considerando los datos de recuperación de CBD y THC informados en diferentes artículos publicados en los que se empleó la técnica de HPLC (Tabla complementaria S1). La Tabla Suplementaria S1 mostró claramente que 10 de 17 métodos emplearon elución en gradiente4,26,28,29,30,31,32,35,36,37 y para los 7 métodos restantes mostraron elución isocrática, cuatro métodos usan un ácido o base o fase móvil que contiene sal16,27,33,34. Un método de elución isocrático utiliza una temperatura de horno de columna de 40 °C y originalmente era un método de cromatografía líquida de rendimiento ultra alto25 mientras que en el otro método isocrático se empleaba una temperatura de horno de columna de 55 °C y un termostato de muestreador automático de 4 °C39. El único método que resultó simple usó metanol al 85 % como fase móvil y con un tiempo de ejecución reducido de 10 min, pero el método mostró una recuperación de CBD del 97,1 % y una recuperación de THC del 99,3 %, mientras que nuestro método mostró una recuperación de CBD del 105,2 % y 100,2 % de recuperación para THC41. Además, mientras se realizaban las pruebas de ensayo para las muestras mencionadas en el artículo publicado41, inicialmente se utilizó acetonitrilo como disolvente de extracción. Para las muestras en las que se encontró que el contenido de CBD era muy bajo en comparación con lo declarado en la etiqueta, se realizó el análisis utilizando metanol como solvente de extracción. Para las muestras en las que no se detectó CBD, se realizó una extracción adicional utilizando el método de extracción QuEChERS42,43 para confirmar la eficiencia de extracción de acetonitrilo y/o metanol. Los resultados de la prueba de ensayo fueron comparables para las extracciones con acetonitrilo y metanol, en las que se encontró que el acetonitrilo era más adecuado.

La cuantificación precisa de compuestos como los cannabinoides donde los productos contienen moléculas psicóticas como el THC, exige que los laboratorios cuenten con procedimientos validados asequibles y de fácil aplicación. La cantidad de THC dentro de un producto determina la restricción legal para dicho producto. El método de prueba de ensayo validado y presentado aquí permite la determinación cuantitativa y simultánea de CBD y THC en productos infundidos con aceite de cáñamo en un tiempo de ejecución de 20 minutos. El método utiliza una sola longitud de onda de 214 nm, y la prueba se puede realizar con cualquier detector estándar tradicional de RP-HPLC y UV-visible. Además, el método utiliza solo disolventes orgánicos para el estándar y la preparación, y para la fase móvil se utilizó un único modificador orgánico sin ajuste de pH y la prueba sigue una elución isocrática. Debido a su simplicidad y consistencia, cualquier analista con conocimientos básicos de HPLC puede emplear este método. Se demostró que el método es selectivo, preciso, lineal y preciso dentro del rango del 50 % al 150 % de la concentración nominal para las concentraciones de las tabletas. Se demostró que el método es sólido con los parámetros críticos establecidos, como los cambios de concentración de la fase móvil y el caudal.

Los autores confirman que los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente, el Dr. Eric Moore ([email protected]).

Cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa

cannabidiol

tetrahidrocannabinol

Desviación estándar relativa

Control de calidad

consejo internacional para la armonizacion

farmacopea de estados unidos

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por el Irish Research Council bajo la beca del programa de posgrado basado en el empleo (ID del proyecto: EBPPG/2019/38). S. Analakkattillam agradece a Glantreo limited, ERI Building, Lee Road, Cork, Irlanda por permitirle realizar la investigación en su organización.

Glantreo Limited, edificio ERI, Lee Road, Cork, T23 XE10, Irlanda

Sandhyarani Analakkattilam, Victor K. Langsi y John P. Hanrahan

Escuela de Química, University College Cork, Cork, T12 YN60, Irlanda

Sandhyarani analakkattilam, victor k. langsi y eric moore

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Todos los autores contribuyeron a la concepción y el diseño del estudio. Contribución del autor según la taxonomía CRediT que se describe a continuación: SA: Metodología, validación, análisis formal, investigación, redacción: borrador original, visualización, curación de datos, adquisición de fondos. EM: Supervisión, redacción-revisión y edición. JH: Conceptualización, supervisión (mentor laboral), redacción—revisión y edición, administración de proyectos. VL: Metodología, validación, recursos.

Correspondencia a Eric Moore.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Analakkattillam, S., Langsi, VK, Hanrahan, JP et al. Validación de métodos analíticos para la determinación de cannabidiol y tetrahidrocannabinol en productos infundidos con aceite de cáñamo mediante RP-HPLC. Informe científico 12, 12453 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13737-6

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Recibido: 17 enero 2022

Aceptado: 04 mayo 2022

Publicado: 21 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13737-6

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