Nanoclusters de carbonato de calcio amorfo paramagnético altamente hidratado como agente de contraste de MRI

Apr 04, 2023

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5088 (2022) Citar este artículo

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El carbonato de calcio amorfo juega un papel clave como precursor transitorio en las primeras etapas de la formación de carbonato de calcio biogénico en la naturaleza. Sin embargo, debido a su inestabilidad en solución acuosa, todavía es raro utilizar carbonato de calcio amorfo en biomedicina. Aquí, informamos el efecto mutuo entre los iones de gadolinio paramagnético y el carbonato de calcio amorfo, lo que da como resultado nanoclusters de carbonato amorfo paramagnético ultrafino en presencia de un entorno similar al carbonato altamente hidratado ocluido con gadolinio y poli(ácido acrílico). Se confirma que el gadolinio mejora el contenido de agua en el carbonato de calcio amorfo, y el alto contenido de agua de los nanoclusters de carbonato amorfo contribuye a la eficiencia de contraste de la resonancia magnética mucho mayor en comparación con los agentes de contraste basados ​​en gadolinio disponibles en el mercado. Además, el rendimiento mejorado de la resonancia magnética ponderada en T1 y la biocompatibilidad de los nanoclusters de carbonato amorfo se evalúan más a fondo en varios animales, incluidos ratas, conejos y perros beagle, en combinación con una seguridad prometedora in vivo. En general, los nanoclusters de carbonato amorfo de producción en masa excepcionalmente fáciles exhiben un excelente rendimiento de imagen y una estabilidad impresionante, lo que proporciona una estrategia prometedora para diseñar un agente de contraste de resonancia magnética.

El carbonato de calcio amorfo (ACC), que existe ampliamente en la naturaleza, juega un papel clave como precursor transitorio en las primeras etapas de la formación de biominerales1,2,3,4. Mediante una estrategia bioinspirada se pueden lograr diversos materiales con propiedades físicas, químicas y de fase controladas5,6. El contenido altamente hidratado es una característica distintiva de ACC y juega un papel fundamental en su estabilización6,7,8,9,10,11,12. Como fase metaestable del carbonato de calcio, el ACC es inestable en solución acuosa y se transformará rápidamente en fases cristalinas debido a la deshidratación, la unión de iones y otros factores6,7,8,13. Por lo tanto, la aplicación potencial de ACC altamente hidratado se ignora en gran medida y hay pocos ejemplos exitosos para utilizar ACC en biomedicina.

Un parámetro importante para mejorar el rendimiento de contraste de los agentes de contraste T1 MRI basados ​​en gadolinio es su hidratación14. Con siete electrones no apareados, el ion de gadolinio posee un gran momento magnético y un largo tiempo de relajación del espín del electrón, lo que da lugar a numerosos agentes de contraste extracelulares basados ​​en gadolinio clínicamente disponibles para T1 MRI14,15. En virtud de la funcionalización versátil para interactuar con biomoléculas in vivo y las menores tasas de fuga de iones de gadolinio que se benefician de una nanoestructura inorgánica, los nanoagentes inorgánicos basados ​​en Gd atrajeron una atención considerable15,16. Desafortunadamente, la hidratación de las nanopartículas a base de gadolinio se ve afectada por la síntesis a alta temperatura, aunque la fuga de iones consiguiente se minimiza debido a la nanoestructura confinada en comparación con los complejos de quelatos15.

Aquí, introducimos iones de gadolinio en el proceso de mineralización de ACC, que se ha demostrado que se integran en la fase final de carbonato de calcio amorfo. En este sistema amorfo, los iones de gadolinio junto con el ácido poli(acrílico) facilitan una mejor hidratación del agua y la estabilidad de los nanoclusters, mientras que el confinamiento de los iones de gadolinio por carbonato mejora la biocompatibilidad y el rendimiento, lo que indica que el producto resultante tiene propiedades notables de agente de contraste para IRM. Además, se descubre un efecto mutuo entre el ion de gadolinio de lantánido paramagnético y el carbonato de calcio amorfo, que contribuye al contenido hidratado maximizado en los nanoclusters compuestos amorfos preparados y a una alta relajación longitudinal. Los nanoclusters de carbonato amorfo paramagnético (ACNC) finales poseen una alta proporción de agua a Ca (agua/Ca = 7,2) en comparación con los ACC normales (las proporciones se mantuvieron constantes en alrededor de 0,4 a 1,9). La relajación longitudinal de ACNC (37,93 ± 0,63 mM−1 · s−1 bajo 3,0 T) también se ha beneficiado del alto contenido de agua, que es diez veces mayor que el del agente de contraste de RM comercialmente disponible ácido gadopentético (Gd-DTPA) y altamente resistente a la fuga de iones por lo que puede servir como un potencial agente de contraste de RM.

Hasta el momento, además de diferentes tipos de aditivos orgánicos como biomoléculas y polímeros, el magnesio es el único catión inorgánico del que se ha informado que es capaz de estabilizar el ACC6,17. El ion gadolinio, cuyo radio iónico es más cercano al del ion calcio que al del magnesio, puede considerarse como un análogo del ion calcio más pequeño con mayor valencia y energía de hidratación18,19. De manera similar a la quelación entre poli(ácido acrílico) (PAA) y calcio para mejorar la estabilidad de ACC7,20, los grupos carboxilato en PAA tienen el potencial de quelar iones de gadolinio, lo que permite que el complejo unido se solidifique posteriormente en carbonato21.

Como se muestra en la Fig. 1a, el cloruro de calcio y el cloruro de gadolinio se mezclaron con PAA, y luego se agregó una solución de carbonato de sodio equimolar con agitación intensa. Esta síntesis eficiente a temperatura ambiente demostró producir ACNC en presencia tanto de gadolinio como de PAA. Se pueden producir fácilmente dos litros de producto acuoso, lo que indica la escalabilidad y reproducibilidad del método informado aquí (Fig. 1b). La presencia de grupos dispersos en solución salina normal se reflejó en el efecto Tyndall (Fig. 1c). Como se muestra en la Fig. 1d, la morfología esférica se investigó más a fondo mediante microscopía electrónica de criotransmisión (cryo-TEM) y demostró ser comparable con ACC como se informó anteriormente22. Los nanoclusters observados por STEM (Fig. 1 complementaria) estaban de acuerdo con las observaciones TEM de escaneo de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF-STEM) y el carácter amorfo de los clusters fue validado por el análisis SAED (Fig. 1e). Los datos de EDS mostraron distribuciones uniformes de gadolinio y calcio en los agregados del grupo (Fig. 2a, b complementarias).

un esquema del proceso de síntesis de ACNC. b Imagen digital del ACNC preparado a gran escala con un volumen total superior a 2 litros. c Imagen digital del efecto Tyndall de cuatro litros de ACNC dispersos en solución salina normal y se insertó una botella de agua desionizada (segundo desde la derecha). d crio-TEM y e imagen HAADF-STEM de ACNC dispersado en solución salina normal. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos individuales. El recuadro en (e) muestra SAED de ACNC. Los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente. EXAFS con ponderación f k2 y transformada de Fourier ponderada con g k2 de EXAFS para el estándar ACNC y ACC. Las líneas negras punteadas son sus mejores ajustes. h Patrones SAXS de ACNC dispersos en solución salina normal. Partículas de esfera de ajuste de línea sólida roja. i Distribución a distancia recibida por SAXS de ACNC disperso en solución salina normal. j TGA de polvo ACNC en atmósfera de N2 con una velocidad de calentamiento de 10 °C min−1. k Espectros TG-FTIR de polvo ACNC en atmósfera de N2 con una velocidad de calentamiento de 10 °C min−1.

ACNC no mostró un pico cristalino en el patrón de difracción de rayos X en polvo (XRD), incluso después de estar disperso en una solución acuosa durante 6 meses (Fig. 3 complementaria). La espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) de ACNC exhibió los picos característicos, correspondientes al oxígeno (O 1s), carbono (C 1s), gadolinio (Gd 4d) y calcio (Ca 2p), respectivamente. De acuerdo con la observación anterior de ACC7, los picos con energías de enlace de 350,8 y 347,3 eV se atribuyeron al estado Ca 2p1/2 y Ca 2p3/2, respectivamente. En el espectro de nivel central de Gd 4d, se observaron dos picos a 142,6 eV y 150,6 eV, que correspondían al estado de Gd 4d5/2 y Gd 4d3/2, respectivamente (Fig. 4 complementaria). El ACNC se estudió más a fondo mediante espectroscopía de absorción de rayos X (XAS) y análisis de estructura fina de absorción de rayos X extendidos (EXAFS), y se reveló que el entorno de corto alcance Ca-O dentro de ACNC se relaciona estrechamente con los del estándar ACC y ACC informados anteriormente10,11,23 (Fig. 1f, g, Tablas complementarias 1, 2). La distribución de tamaño de ACNC recibida del análisis de ajuste SAXS mostró un radio promedio de 1, 3 nm (Fig. 1h, i).

Los resultados del análisis termogravimétrico (TGA) y del calorímetro diferencial de barrido (DSC) para ACNC mostraron una pérdida superior al 20% en peso al calentar a 300 °C debido a la deshidratación del ACC, lo que indica un alto contenido de agua de ACNC. Además, la pirólisis de PAA ocurrió entre 300 y 500 ° C, y el carbonato se descompuso por encima de 550 ° C (Fig. 1j y Fig. 5 complementaria). Según el resultado de TGA, la composición de ACNC incluía ~20 % de contenido de agua, 40 % de PAA y 40 % de carbonato amorfo. La absorbancia observada en FTIR acoplado a TGA (TG-FTIR) en ACNC a 2358 y 2322 cm−1 por encima de 550 °C correspondía a la vibración de estiramiento asimétrica del CO2 de la descomposición del carbonato (Fig. 1k). Como se muestra en la figura complementaria 6, la banda dividida en 1415 y 1454 cm−1 en la espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR) se puede asignar a la vibración de estiramiento asimétrica de los iones de carbonato en entornos típicos de ACC20. Un pico ancho centrado en 1086 cm-1 atribuido al estiramiento interno simétrico de CO32 se confirmó aún más mediante espectroscopia Raman (Fig. 7 complementaria).

Con el fin de investigar la contribución de cada componente al contenido altamente hidratado y al entorno similar a ACC, se sintetizó una serie de muestras de control con composición variable como se enumera en la Tabla complementaria 3, incluido un compuesto ACC ocluido con Gd (ACC-Gd), ACC estabilizado con PAA (ACC-PAA), carbonato de gadolinio amorfo (AGC), AGC estabilizado con PAA (AGC-PAA) y dos quelatos libres de carbonato (PAA-Ca y PAA-Ca/Gd). Se realizaron patrones XRD y espectros Raman para identificar la fase amorfa (Figura complementaria 8a, b)12. Los resultados de la estructura fina de absorción de rayos X extendidos (EXAFS) confirmaron aún más la presencia de entornos similares a ACC (Fig. 2a, b).

un EXAFS ponderado en k2 y b Transformada de Fourier ponderada en k2 del EXAFS para el estándar ACNC, ACC, ACC-PAA, ACC-Gd, PAA-Ca y PAA-Ca/Gd. Las líneas negras punteadas son su mejor ajuste. c Curva termogravimétrica de polvo liofilizado de ACC y ACC-Gd aislado con agua desionizada y luego expuesto al aire seco durante más de 6 meses. La pérdida de peso antes de los 300 °C podría atribuirse a la pérdida de agua. d El contenido de agua de ACC, ACC-PAA, ACC-Gd, AGC, AGC-PAA y ACNC según el análisis termogravimétrico (TG) y las mediciones de titulación volumétrica de Karl Fischer (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medios ± SD. e Relación molar de moléculas de agua por mol de CaCO3 en ACC, ACC-PAA, ACC-Gd y ACNC en comparación con los rangos de valores informados de ACC sin aditivos (región rosa) y ACC estabilizado con PAA (región naranja) (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medios ± SD. f Relación molar de moléculas de agua por mol de Gd en AGC, AGC-PAA, ACC-Gd y ACNC (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medios ± SD.

En ausencia de PAA, ACC-Gd mostró una morfología típica para nanopartículas de ACC agregadas con una distribución uniforme de Gd y Ca (Fig. 9 complementaria). El resultado de la resonancia magnética nuclear (NMR) de 13C de ACC-Gd mostró una vibración característica a 168 ppm, lo que indicó la fase precursora de ACC en ACC-Gd (Fig. 10 complementaria). El espectro FT-IR mostró una consistencia en comparación con la fase de carbonato de calcio amorfo, y la vibración v2 cambiada a un valor más bajo indicaba la formación de la fase de carbonato de gadolinio amorfo (AGC) (Fig. 11 complementaria)24. El pico de oxígeno (O 1s) del resultado XPS de ACG fue bastante similar a la curva de ACC (Fig. 12 complementaria)7. El espectro XPS de AGC-PAA exhibió un perfil similar al de ACNC (Fig. 13 complementaria).

Las transformaciones de ACC-Gd se investigaron en diferentes medios (etanol, agua) para explorar más a fondo cómo Gd afectaba la estabilidad de ACC. Los resultados de XRD de las muestras se recopilaron en diferentes puntos de tiempo (Fig. 14 complementaria). Después de 6 meses, la calcita, el aragonito y la vaterita estaban todos contenidos en ACNC disperso en etanol. En marcado contraste, ACC-Gd fue estable en etanol durante 6 meses. El ACC sin aditivos recién preparado cristalizó rápidamente después de la dispersión en agua, mientras que ACC-Gd pudo mantener la fase amorfa durante decenas de minutos. En general, Gd debería desempeñar un papel razonable en el retraso de la cristalización de ACC. De manera más atractiva, todavía había un mayor contenido de agua en ACC-Gd en comparación con ACC puro durante mucho tiempo. Según el resultado de TGA, la pérdida de peso antes de los 300 °C de ACC-Gd y polvo de ACC expuestos al aire durante 6 meses fue superior al 10 % y solo al 0,1 %, respectivamente (Fig. 2c). Tenga en cuenta que ACC ha perdido completamente su agua de hidratación en estas condiciones.

Tanto en los resultados de la medición de TGA como de la titulación volumétrica de Karl Fischer, la pérdida de peso antes de los 300 °C podría asignarse a la pérdida de agua, y ACNC exhibió el contenido de agua más alto del 20% en peso calculado entre los productos con diferente composición (Fig. 2d) . Según informes anteriores, los contenidos de agua por mol de calcio en ACC sin aditivos y ACC estabilizado con PAA se ubicaron típicamente en el rango de 0.4–1.58 y 1.33–1.93, respectivamente20,25. Por el contrario, tanto ACC-Gd como ACC-PAA mostraron una relación agua a Ca más alta, y la relación más alta se obtuvo en ACNC (agua/Ca = 7,2) (Fig. 2e), lo que indica una mejora sinérgica de la unión de agua por PAA y Gd en estas nanopartículas amorfas. Más importante aún, para comparar la proporción de agua a Gd como se muestra en la Fig. 2f, el contenido hidratado por mol de gadolinio en presencia de un entorno similar a ACC y PAA en ACNC es más de cuatro veces mayor que el del carbonato de gadolinio ocluido con PAA ( PAA-AGC). En comparación con AGC, la presencia de ACC en el compuesto Gd-ACC también resultó en un aumento del doble del contenido hidratado por ion de gadolinio.

Para investigar el origen de la hidratación, se aplicó ultracentrifugación analítica (AUC) para determinar el agua de hidratación de ACNC a través de la relación de fricción y la función de Perrin asumiendo una forma esférica que se ve en las imágenes de microscopía electrónica (Tabla complementaria 4). Las muestras muestran coeficientes de sedimentación del orden de 10−13 s, lo cual es típico para los grupos de prenucleación (PNC) que tienen tamaños similares26. Los ACNC tienen un diámetro de 1,5 nm, que es incluso más pequeño que el encontrado por SAXS, aunque todavía en un acuerdo razonable. Su masa molar de 2230 g/mol indica que consisten en ~20 pares de iones CaCO3, incluidos los iones Gd3+. La cantidad determinada de agua de hidratación unida en solución de 8,8 mol H2O por CaCO3 (y 23,0 mol H2O por Gd3+) es considerablemente más alta que en los ACC comunes (Fig. 2e, f y Tabla complementaria 5). En particular, el contenido de agua de ACNC determinado por AUC está razonablemente de acuerdo con los resultados de TGA, considerando que la hidratación se determinó en estado húmedo y seco, respectivamente6.

Además de la contribución del dopante del ion gadolinio al contenido de ACC altamente hidratado, se logró un comportamiento paramagnético típico en los nanoclusters de carbonato amorfo como se muestra en la curva M-H (Fig. 3a). Tanto la alta hidratación como el confinamiento de los iones de gadolinio, el ACNC paramagnético fue propicio para aumentar el rendimiento del contraste de la RM. Los tiempos de relajación T1 de ACNC dispersos en solución salina normal a concentraciones variables se midieron utilizando un escáner MR de 3,0 Tesla. Como se muestra en el mapa T1 (Fig. 3b), la relajación longitudinal (r1) de ACNC alcanzó 37,21 mM−1 · s−1 (Fig. 3c), que fue diez veces mayor que la del Gd-DTPA comercialmente utilizado (3,19 mM−1 · s−1). Además de la contribución de las macromoléculas y nanopartículas, ACNC poseía una relajación longitudinal cuatro veces mayor en comparación con el carbonato de gadolinio amorfo modificado con PAA (AGC-PAA) (7,91 mM−1·s−1), lo que se atribuyó al alto contenido de hidratación de ACC -ambientes similares. Este alto contenido de agua puede atribuirse principalmente a la mayor capacidad de hidratación del Gd3+ trivalente en comparación con los iones Ca2+ divalentes19, lo que mejoró razonablemente las relajaciones de la esfera interna y externa del entorno similar a ACC ocluido ACNC14.

una curva M-H de ACNC a temperatura ambiente. b, c Mapa de T1 y 1/T1 frente a la curva de concentración de Gd de ACNC (R2 = 0,9999), AGC-PAA (R2 = 0,9987) y Gd-DTPA (R2 = 0,9966) bajo 3,0 T. d Relación molar de moléculas de agua por mol de la relaxividad de Gd y r1 en ACNC, ACNC(2n-PAA), ACNC(n/2-PAA) y ACNC(n/10-PAA) (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medios ± SD. e 1/T1 frente a la curva de concentración de Gd de ACNC (R2 = 0,9999), ACNC(2n-PAA) (R2 = 0,9999), ACNC(n/2-PAA) (R2 = 0,9999) y ACNC(n/10-PAA) (R2 = 0,9845) bajo 3,0 T. f 1/T1 frente a la curva de concentración de Gd de ACNC(Gd/Ca=1:10) (R2 = 0,9993) y ACNC(Gd/Ca=1:2) (R2 = 0,9996) bajo 3,0 T. g 1/T1 frente a la curva de concentración de Gd de ACNC bajo 3,0 T (n = 3 muestras independientes). h 1/T1 frente a la curva de concentración de Gd de ACNC bajo 3,0 T (R2 = 0,9993) y 0,5 T (R2 = 0,9999). i 1/T2 frente a la curva de concentración de Gd de ACNC bajo 3,0 T (R2 = 0,9991) y 0,5 T (R2 = 0,9999). j Evolución de los valores relativos de R1 desde el tiempo cero hasta cada tiempo (R1(t)/R1(0)) para ACNC, Gd-DTPA y PAA-Ca/Gd (n = 3 experimentos independientes). Los datos muestran medios ± SD.

Aquí, evaluamos más a fondo el efecto del contenido de PAA en el contenido de agua y la relajación. Denotamos la entrada de PAA para el producto ACNC como 'n'. Usando los mismos métodos de síntesis, varios productos con entradas PAA de '2n', 'n/2', 'n/10' (etiquetados como ACNC(2n-PAA), ACNC(n/2-PAA), ACNC(n/10 -PAA)) se obtuvieron en las mismas condiciones experimentales. Encontramos un aumento significativo en el contenido de agua de todo el sistema de producto con PAA agregado (Figura complementaria 15). Sin embargo, también se detectó un efecto de 'montaña rusa' cuando la proporción molar de moléculas de agua por mol de Gd alcanzó su punto máximo con un tamaño de entrada de 'n', pero disminuyó con un tamaño de entrada mayor como '2n' (Fig. 3d). Además, medimos las relaxividades de estas muestras. Curiosamente, su desempeño fue altamente consistente con el contenido de agua por Gd en la forma en que la relajación de ACNC alcanzó el nivel más alto bajo la condición de 'n', pero se redujo cuando la cantidad de PAA fue '2n' y 'n/2'. . Específicamente, la relajación disminuyó significativamente cuando la cantidad de PAA fue solo '10/n' (Fig. 3d, e). A la luz de los resultados, quedó claro que la relación molar de moléculas de agua por mol de Gd actuó fuertemente en el rendimiento de los productos. Estas comparaciones sugirieron que la relajación estaba cambiando junto con el contenido de agua por Gd, ya que comparten un camino similar de cambio.

Además, diseñamos y fabricamos dos nanoclusters de carbonato amorfo más con proporciones variables de Gd agregado para fines de comparación. En la síntesis de ACNC, mol[GdCl3]:mol[CaCl2] es igual a 1:5. También preparamos dos muestras con una relación de alimentación inicial de Gd/Ca de 1:10 y 1:2 (indicadas como ACNC(Gd/Ca=1:10) y ACNC(Gd/Ca=1:2), respectivamente). ACNC (Gd/Ca = 1:10) y ACNC (Gd / Ca = 1: 2) eran fases amorfas, y no se pudieron encontrar picos de cristalización en los patrones XRD de los dos productos dispersos en soluciones acuosas durante 3 meses (Figura complementaria . dieciséis). ACNC(Gd/Ca=1:10) retuvo un buen rendimiento de MR con una alta relajación de 34,25 mM−1·s−1 cuando la proporción de dopaje de Gd era baja. Sin embargo, cuando se elevó el nivel de incorporación de Gd, los valores de relajación longitudinal (r1) de ACNC (Gd/Ca=1:2) disminuyeron notablemente a 17,21 mM−1·s−1 (Fig. 3f). Una explicación podría ser que la cantidad excesiva de Gd podría perturbar potencialmente el entorno similar a ACC altamente hidratado, lo que a su vez afectó la generación de ACC con alto contenido de agua. En resumen, la cantidad de dopaje de Gd afectó significativamente la relajación del ACNC paramagnético, ACNC resultó ser el mejor producto en términos de rendimiento de contraste.

Después de tres pruebas, se calculó que el valor r1 de ACNC era de ~37,93 ± 0,63 mM−1 · s−1 (Fig. 3g). Además, los valores r1 y r2 de ACNC se midieron bajo diferentes campos magnéticos (3,0 T y 0,5 T), y se calculó su correspondiente relación r2/r1 (Fig. 3h, i). El valor r1 de ACNC medido en 3,0 T fue tan alto como 38,19 mM−1 · s−1, y el valor r2 correspondiente y la relación r2/r1 fueron 72,49 mM−1 · s−1 y 1,90, respectivamente. Utilizando un sistema de escáner de RM de campo bajo (0,5 T), los valores r1 y r2 correspondientes de ACNC fueron 66,37 mM−1 · s−1 y 78,04 mM−1 · s−1, respectivamente, y la relación r2/r1 fue 1,18. Según los resultados de las mediciones de AUC, la masa molar de ACNC con un diámetro de 1,5 nm fue de 2230 g/mol. La densidad de relajación de ACNC se puede calcular finalmente con la ayuda del volumen y el peso molecular (21,46 mM-1 · s-1/nm3, 17,01 mM-1 · s-1/kDa, respectivamente).

La alta estabilidad es esencial para los agentes de contraste basados ​​en gadolinio, ya que la transmetalación conducirá a la liberación de iones de gadolinio disociados con toxicidad reportada como fibrosis sistémica nefrogénica14,27. Laurent y Muller informaron sobre la poca inercia cinética frente a la transmetalación de los agentes de contraste lineales basados ​​en gadolinio, como el Gd-DTPA28 de uso comercial. Como se muestra en la Fig. 3j, el quelato PAA-Ca/Gd exhibió una inercia aún peor que el Gd-DTPA después de la exposición a Zn2+ en PBS durante 48 h. Por el contrario, ACNC mejoró demostrablemente la estabilidad contra la transmetalación, debido al confinamiento con gadolinio en entornos similares a ACC. Además, abordamos un ensayo de competencia de ligandos en una solución acuosa homogénea que contiene DTPA y ACNC. No hubo evidencia observable que mostrara que la relajación de ACNC se alteró significativamente, lo que confirmó que ACNC no se vio afectado por la competencia entre el complejo Gd (III) y el ligando libre de DTPA excesivo (Fig. 17 complementaria).

El espectro de absorción de Arsenazo III se usa generalmente para detectar la fuga de iones de gadolinio de nanocompuestos basados ​​en Gd y quelatos de gadolinio29,30. Cuando la solución acuosa de Arsenazo III se mezcló con Gd3+, la solución rosa se volvió azul debido a la formación del complejo arsenazo-Gd3+ (Fig. 4a). Como se muestra en la Fig. 4b, el ion de gadolinio libre a una concentración baja de 1 µg/mL fue detectable mediante espectros de absorción mediada por Arsenazo III. Sin embargo, en la dispersión de solución salina normal de ACNC, no se detectó fuga de iones de gadolinio libres en diálisis de 1 semana utilizando este análisis colorimétrico, que fue confirmado por ICP-MS (Fig. 4c). En marcado contraste con ACNC, el quelato PAA-Ca/Gd mostró una fuga obvia en comparación con ACNC, lo que confirma aún más el confinamiento de los iones de gadolinio por carbonato.

a Fotos de las mezclas de solución acuosa de Arsenazo III con soluciones dializadas de ACNC, solución salina normal (NS, sirvió como control negativo) y solución acuosa de cloruro de gadolinio en concentraciones variables (1, 10 y 100 µg Gd/mL) (sirvió como controles positivos), respectivamente. b Los espectros de absorción de las mezclas de dializado y Arsenazo III y los dializados se recolectaron en diferentes puntos de tiempo en 7 días para monitorear la fuga de gadolinio de ACNC. No se controló ninguna fuga detectable de iones de gadolinio en comparación con los controles negativo (NS) y positivo (solución acuosa de cloruro de gadolinio). c Análisis cuantitativo y comparación de la fuga de ion gadolinio libre de ACNC y PAA-Ca/Gd en NS mediante ICP-AES. El quelato PAA-Ca/Gd mostró poca inercia en NS, y se filtró ~9% de gadolinio del quelato después de 7 días. Por el contrario, se detectaron pocos iones de gadolinio libres en los dializados de ACNC (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medios ± SD. d, e Espectros de absorción de la mezcla de Arsenazo III con soluciones dializadas recolectadas en diferentes puntos de tiempo de d suero humano con ACNC disperso y e suero humano con ACNC disperso y fosfato adicional suplementado. f Evaluación de compatibilidad sanguínea de ACNC a concentraciones variables de gadolinio (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medios ± SD.

Es bien sabido que el pH juega un papel clave en la homeostasis tisular y celular. Además, los diferentes compartimentos celulares presentan una variedad de condiciones ácido-base. Utilizamos tampones PBS con un pH de 6,0 a 6,8 para imitar la condición débilmente ácida de diferentes ubicaciones intracelulares. Aunque se puede observar la fuga de iones de Ca, la fuga de iones de Gd apenas se detectó con 7 días (Fig. 18 complementaria). Suponemos que Gd(III) dentro de ACNC tenderá a formar GdPO4 con fosfato en el tampón PBS debido al producto de solubilidad termodinámica (Ksp) más bajo del fosfato que el del carbonato31. La precipitación de iones Gd3+ libres se suprimió en condiciones casi neutras (pH = 6)32, lo que evitó la fuga de iones Gd, lo que indica la buena bioseguridad de ACNC en condiciones de ácido débil. Bajo un pH ambiental más ácido (pH 4.5–5.5) simulado por tampones de acetato, la liberación de iones Gd aumenta ligeramente con la disminución del pH (Figura complementaria 18). En comparación con los resultados en el entorno de PBS, la fuga mejorada de iones Gd se atribuyó a la pérdida de protección proporcionada por el fosfato. Por lo tanto, especulamos que Gd (III) era difícil de filtrar de ACNC y existía como iones en un entorno fisiológico.

Además, ACNC se dispersó en suero humano a 1 mmol (Gd)/L. Mientras tanto, para simular las concentraciones elevadas de fosfato en suero en pacientes con enfermedad renal en etapa terminal33, la misma concentración de ACNC se dispersó en suero humano complementado con una concentración adicional de fosfato de 10 mmol/L durante 15 días, seguido de diálisis en diferentes momentos. . No se detectó fuga de iones de gadolinio libres en los dializados utilizando ICP-MS y análisis colorimétrico (Fig. 4d, e y Fig. 19 complementaria), lo que indica el bajo riesgo de disociación para ACNC en el período de retención in vivo.

Para determinar si el ACNC causa hemólisis, se incubó ACNC en diferentes concentraciones con suero sanguíneo humano a 37 °C para una prueba de hemólisis. De acuerdo con el estándar, los ACNC no tienen hemocilólisis incluso a una concentración alta de 0,5 mg (Gd)/mL, lo que sugiere una buena compatibilidad con la sangre (Fig. 4f). El ensayo MTT se utilizó como evaluación de la citotoxicidad mediante el cultivo conjunto de células epiteliales tubulares renales humanas (HK-2) o líneas de queratinocitos inmortales humanos (HaCaT) con ACNC durante 24 h y 48 h. Se indujo una pequeña reducción de la viabilidad en las células después de la exposición a ACNC, incluso a una concentración alta de 0,5 mg (Gd)/ml (Fig. 20 complementaria). Además, se validaron buenas citocompatibilidades tanto de ACNC (Gd / Ca = 1: 10) como de ACNC (Gd / Ca = 1: 2) (Fig. 21 complementaria). Alentados por los resultados hasta el momento, se llevaron a cabo una serie de estudios de compatibilidad subcelular utilizando células epiteliales tubulares renales humanas (HK-2). Las mitocondrias sanas de las células HK-2 se demostraron mediante el estudio de potenciales de membrana mitocondrial (MMP) (Fig. 22 complementaria). El ensayo de tinción inmunofluorescente de HK-2 con dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) mediado por TdT mostró que ACNC no tenía daño acumulado en el ADN nuclear de las células (Fig. 23 complementaria). Se realizó un ensayo EdU (5-Etinil-2′-desoxiuridina) y se confirmó que ACNC no tenía efectos sobre la proliferación celular (Fig. 24 complementaria).

Mientras tanto, se recolectaron secciones histológicas de los órganos principales 2 semanas después de la inyección intravenosa en ratones a una dosis de 5 mg Gd/kg, y no se identificó evidencia de cambios patológicos en las imágenes teñidas con H&E (Figura complementaria 25). También se realizó la tinción H&E de riñón de conejo y no se observó toxicidad renal aguda (Fig. 26 complementaria). Tres días y 3 semanas después de la inyección intravenosa de ACNC en ratones, todos los valores de los parámetros hematológicos y bioquímicos estaban de acuerdo con el rango estándar y nuestros grupos de control (Fig. 27 complementaria). Para realizar más pruebas en el perro beagle de animales grandes a una dosis alta (9 mg Gd/kg de peso corporal), no hubo una diferencia obvia de los parámetros hematológicos y bioquímicos entre los grupos de control y experimental después de la inyección intravenosa (Fig. 28 complementaria), lo que sugiere que fisiológico Las funciones no se vieron afectadas por ACNC.

La mejora del rendimiento de la resonancia magnética ponderada en T1 de ACNC se confirmó aún más mediante angiografía por resonancia magnética en ratas, conejos y perros beagle. Después de la inyección intravenosa en bolo de ACNC a una dosis baja (3 mg/kg de peso corporal), se pueden identificar claramente la yugular, la carótida, la aorta y la vena cava caudal (Fig. 5a-c), y la dosis es <1/5 de el valor típicamente empleado en la clínica. Las imágenes de angiografía de cuerpo completo de rata, conejo y la parte superior del cuerpo de perro beagle exhibieron un mejor contraste angiográfico y más detalles en comparación con el grupo de control de Gd-DTPA. Mientras tanto, el análisis semicuantitativo mostró claramente que las intensidades de señal en los grupos ACNC tienen una mejora notable en comparación con las de los grupos Gd-DTPA (Figuras complementarias 29, 30). Como se muestra en la Fig. 5d, la mejora del contraste de ACNC in vivo se reflejó cuantitativamente en el valor medio de la relación señal-ruido (SNR) en conejo y perro beagle, respectivamente34.

a, b Imágenes de angiografía por RM (ARM) mejoradas con contraste de todo el cuerpo en una rata yb conejo inmediatamente después de la inyección en bolo de (i) Gd-DTPA y (ii) ACNC. c Imágenes de MRA de la parte superior del cuerpo en un perro beagle inmediatamente (IM) y 20 s después de la inyección en bolo de (i) Gd-DTPA y (ii) ACNC, respectivamente. (C) y (S) representan el plano coronal y el plano sagital respectivamente. d Medición cuantitativa de SNR de ROI en (i) arteria del tronco braquiocefálico, (ii) arteria subclavia izquierda, (iii) arteria carótida común izquierda, (iv) rama derecha de la arteria olfatoria del perro beagle, y eso en (v) aorta descendente , (vi) arco aórtico, (vii) aorta ascendente de conejo, respectivamente. El tiempo para la medición cuantitativa de SNR de ROI fue en el período "IM" (n = 3 experimentos independientes). Los datos muestran medios ± SD. P se calculó utilizando la prueba t de Student de dos colas (** P < 0,01, *** P < 0,001).

Recientemente, la traducción clínica de biomateriales de tamaño nanométrico atrajo gran atención, prometiendo el desarrollo de herramientas nanomédicas novedosas y específicas para el diagnóstico y la terapia16,35,36,37,38. La mayoría de los nanomateriales administrados fueron secuestrados por el hígado y el bazo, que se convierten así en las principales barreras biológicas para la traducción de los nanomedicamentos39. Para evitar el riesgo potencial in vivo, la depuración renal es la ruta de excreción deseable y preferida para los agentes médicos para un catabolismo y una exposición corporal mínimos. Sin embargo, en comparación con los agentes de contraste de pequeño peso molecular, los agentes de contraste de RM de tamaño nanométrico, especialmente las inyecciones de óxido de hierro de tamaño nanométrico aprobadas por la FDA, sufren una excreción renal deficiente como resultado de su distribución de gran tamaño (>20 nm)40. El hígado es el objetivo primario o secundario de transmisión de nanopartículas con acceso al sistema circulatorio, lo que resulta en una acumulación inevitable de nanopartículas en el hígado. Las nanopartículas detenidas en el hígado podrían eliminarse del hígado a través del aclaramiento hepatobiliar41. Además de la eliminación convencional del hígado (Fig. 31 complementaria), se observó la eliminación renal rápida de ACNC de los vasos sanguíneos en las imágenes de MRA después de la inyección intravenosa (Fig. 32 complementaria). Además, la vejiga del perro beagle también se iluminó en 20 minutos en la imagen T1w (Fig. 33 complementaria). Además, como se muestra en la curva de concentración en sangre-tiempo en ratones y perros beagle medidos por ICP-AES, podría eliminarse de manera efectiva de los vasos sanguíneos en 6 h y rara vez hay contenido residual de gadolinio después de 24 h (Fig. 6a , b y Tabla Suplementaria 6). En la orina de rata recolectada después de la inyección intravenosa de ACNC, el contenido de gadolinio fue detectado por ICP-AES y demostró una eficiencia de eliminación renal de ~ 13% ID a las 24 h (Fig. 34 complementaria), que es comparable a la de oro nanoclusters con diámetros similares42. Se pudieron observar abundantes agregados de grupos amorfos de SAED en imágenes TEM de orina dializada (Fig. 6c), y el mapeo de EDS reveló una distribución coincidente de elementos de gadolinio, calcio, carbono y óxido en estos agregados correspondientes a ACNC (Fig. 6d, e) . La estabilidad fisicoquímica y fisiológica en sinergia con dosis de inyección bajas y eliminación parcial por vía renal condujo a la biocompatibilidad in vivo y la capacidad de traducción potencial de estos grupos de carbonato amorfo a base de gadolinio.

a, b La distribución dependiente del tiempo de ACNC en plasma de a ratones y b perros beagle dentro de las 24 h (n = 5 animales biológicamente independientes). Los datos muestran medios ± SD. c TEM, d resultados de EDS y e imagen HAADF-STEM y mapeo EDS de ACNC observado en orina de rata recolectada 12 h después de la inyección. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos individuales. El recuadro de c es un patrón SAED relativo. Los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente.

Se han diseñado y aprobado en todo el mundo una serie de agentes de contraste basados ​​en gadolinio para imágenes de RM T114. Como resultado de una alta densidad de electrones libres en la banda de valencia y una funcionalización versátil para interactuar con biomoléculas in vivo, se anticipa que los nanomateriales inorgánicos que sirven como agentes de contraste en varias modalidades de imagen lograrán la traducción clínica de la nanomedicina15,43. Por lo tanto, los científicos estudiaron incansablemente la inclusión de diversos métodos de fabricación y la farmacocinética clara para investigar la traducibilidad de las nanopartículas inorgánicas basadas en Gd16. Teniendo en cuenta el peligro originado por la liberación de iones Gd libres, un objetivo específico era reducir la dosis de nanopartículas inyectadas a través del rendimiento mejorado.

El nivel de hidratación juega un papel importante en la determinación del rendimiento de contraste de un agente de contraste MR14. Desafortunadamente, el contenido de hidratación de los nanocristales basados ​​en Gd está limitado por los procesos tradicionales de síntesis a alta temperatura15. Vale la pena mencionar que el alto contenido de humedad, que incluye agua interior y agua estructural profundamente localizada, es la característica más distintiva de ACC7,8,9,10,11. Sin embargo, la aplicación potencial de ACC hidratado inestable se ignora en gran medida. Curiosamente, el radio iónico del ion de gadolinio es muy cercano al del ion de calcio, lo que implica una posible interacción entre los iones de gadolinio y los iones de calcio que podemos aprovechar.

En resumen, nuestro estudio confirma los efectos mutuos entre el ion de gadolinio de lantánido paramagnético y el carbonato de calcio amorfo, que es beneficioso para maximizar el contenido de agua en los nanoclusters compuestos amorfos obtenidos. El material se sintetiza a través de un sencillo proceso de un solo recipiente a temperatura ambiente, lo que permite una producción rentable y a gran escala. Es importante destacar que este alto contenido de agua contribuye a la mejora de contraste de resonancia magnética transparente de nanoclusters basados ​​en gadolinio. En combinación con su baja toxicidad, aclaramiento renal parcial y fácil potencial para la producción en masa, nuestro trabajo permite una mayor identificación del potencial biomédico de los compuestos ACC, y anticipamos que podría conducir a una próxima generación de agentes de diagnóstico más eficientes sobre la base de nanoclusters amorfos en el futuro.

El cloruro de calcio anhidro, el carbonato de sodio anhidro y el alcohol etílico se adquirieron de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd (Shanghai). El hexahidrato de cloruro de gadolinio (GdCl3·6H2O, 99,95 %) se adquirió de Yutai QingDa Fine Chemical Co., Ltd. (Shandong, China). El poli(ácido acrílico) (PAA, Mw ≈ 1800) se adquirió de Aldrich. Todos los reactivos se usaron tal como se recibieron sin purificación adicional. El Gd-DTPA usado comercialmente fue producido por Guangdong Consun Pharmaceutical Group, China (especificación: 20 ml).

En un procedimiento típico para sintetizar carbonato de calcio amorfo (ACC) sin aditivos, se vertieron 10 mL de solución acuosa de Na2CO3 (0,1 mol·L−1, 10 mL) en soluciones acuosas de cloruro de calcio (0,1 mol·L−1, 10 mL) bajo agitación magnética vigorosa durante 15 s. La suspensión acuosa después de agregar 20 ml de etanol se centrifugó a 850 × g durante 2 min inmediatamente, luego los precipitados se lavaron con etanol y se centrifugaron durante 5 min a 5000 × g dos veces.

En un procedimiento típico para sintetizar ACNC, se disolvieron cloruro de calcio anhidro (CaCl2, 0,1 mol·L−1), hexahidrato de cloruro de gadolinio (GdCl3, 0,02 mol·L−1) y PAA (0,45 g) en 10 ml de DIW con magnetómetro. emocionante. Se vertió carbonato de sodio anhidro (Na2CO3, 0,1 mol·L−1, 10 mL) en la solución anterior con agitación magnética vigorosa durante 1 min. Se agregaron 20 mL de etanol para terminar la reacción. La mezcla se centrifugó inmediatamente durante 2 min a 850 × g, y los precipitados se resuspendieron en DIW, se centrifugaron durante 5 min a 5000 × g dos veces. Para la síntesis a escala de un litro, el volumen de reacción se amplió 50 veces y se llevó a cabo bajo fuerte agitación mecánica.

Para la síntesis de ACC estabilizado por PAA (ACC-PAA), se utilizaron 0,45 g de PAA en el proceso de síntesis sin la adición de sal de gadolinio, y el producto se lavó con etanol. Para la preparación de ACC-Gd, el PAA estuvo ausente en el proceso de síntesis y se mezclaron CaCl2 anhidro (0,1 mol·L−1) y GdCl3 (0,02 mol·L−1) en 10 mL DIW. Luego, el ACC-Gd obtenido se lavó con etanol.

En un procedimiento típico para sintetizar carbonato de gadolinio amorfo (AGC) y AGC-PAA, se vertió Na2CO3 (0,1 mol·L−1, 10 mL) en 10 mL de solución acuosa de GdCl3 (0,067 mol·L−1, mol[GdCl3]: mol[Na2CO3] = 2:3) bajo agitación magnética vigorosa durante 15 s, luego se vertieron 20 ml de etanol en la suspensión acuosa. Después de centrifugar a 850 × g durante 2 min inmediatamente, los precipitados se lavaron con etanol y se centrifugaron durante 5 min a 5000 × g dos veces. Además, en presencia de 0,45 g de PAA en la solución acuosa de GdCl3, se preparó AGC-PAA con el mismo procedimiento.

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se llevó a cabo en H7700 (Hitachi, Japón) con un voltaje de aceleración de 100 KV. La microscopía electrónica de criotransmisión (cryo-TEM) se realizó en la microscopía crioelectrónica de transmisión Tecnai F20. El TEM de escaneo de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF-STEM), el espectrómetro de dispersión de energía (EDS) y el mapeo de EDS se realizaron en un microscopio electrónico de transmisión de alta resolución de emisión de campo (FEI, Talos F200X). Los patrones de difracción de rayos X en polvo (XRD) se realizaron en un difractómetro de rayos X de ánodo giratorio (SmartLabTM 9 kW). La espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) se realizó en un espectrómetro de fotoelectrones (ESCALAB, 250Xi, Thermo Fisher, EE. UU.). La resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C se realizó en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de estado sólido de 400 MHz WB (Bruker AVANCE III 400 WB). Los espectros FT-IR se registraron con un espectrómetro Thermo Nicolet 8700 FT-IR a temperatura ambiente. Los espectros Raman se registraron utilizando un espectrómetro Evolution Raman de alta resolución (HR) Horiba LabRAM. La fuente de luz del microscopio se transfirió a un láser de diodo (780 nm). Los espectros fueron escaneados por 3 × 100 s44,45. El análisis termogravimétrico (TGA), el calorímetro diferencial de barrido (DSC) y el análisis termogravimétrico junto con la espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (TG-FTIR) se registraron a una velocidad de calentamiento de 10 K min-1 bajo flujo de nitrógeno en un analizador térmico TGA (NETZSCH STA 449F3). La investigación magnética se llevó a cabo en un magnetómetro de dispositivo de interfaz cuántica superconductora (SQUID) (Quantum Design SQUID-VSM). ICP-AES se realizaron en un instrumento Optima 7300 DV. Los espectros UV-vis se midieron en un espectrofotómetro Shimadzu UV-2600 a temperatura ambiente.

El análisis de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) se realizó en un SAXSpoint 2.0 (Anton Paar). La función de distribución de tamaño determinada por SAXS se evaluó utilizando el software GIFT (transformación de Fourier indirecta generalizada) con la condición previa de esferas homogéneas ponderadas por número. Se calcula mediante las siguientes fórmulas46:

Las mediciones de espectroscopia de absorción de rayos X (XAS) en el borde K de calcio (4,0381 keV) se realizaron en el sincrotrón Elettra de Italia, que opera a una energía de 2 GeV y una corriente de 300 mA. Las muestras se molieron en un mortero de ágata, se diluyeron con polvo de grafeno y se compactaron en gránulos delgados. Se preparó un grosor de muestra óptimo de ~ 300 μm y una concentración de calcio óptima después de la dilución óptima con polvo de grafeno para cada muestra, incluidos los estándares ACNC, ACC-Gd y ACC. Se recolectaron tres escaneos completos por muestra de la estructura de borde cercano de absorción de rayos X (XANES) y la estructura fina de absorción de rayos X extendida (EXAFS) en modo de transmisión utilizando un detector de cámara de iones FMB-OXFORD, en pasos de 5 eV en el pre -región de borde (de 3738,43 a 4028,53 eV) y 0,2 eV en la región de borde (de 4061,51 a 4061,71 eV), aumentando gradualmente a 2,6 eV en la región posterior al borde (de 4061,71 a 4589,30 eV) hasta k = 13. Alineación, La calibración de energía y la eliminación de fallas se realizaron utilizando funciones integradas del paquete de software Athena47. La primera capa de coordinación alrededor del calcio (Ca-O) se ajustó generando una vía de dispersión única de Ca-O basada en datos cristalográficos de calcita. El análisis de las rutas de dispersión individuales se llevó a cabo desde 1,3 a 2,53 Å en el espacio R en datos ponderados con k2 transformados de Fourier desde 3 a 9,1 Å. Los errores estándar asociados con el ajuste de datos EXAFS en el rango k utilizado aquí son del 15 % para el número de coordinación de la primera capa, 0,03 Å para la distancia radial y 15 % para los factores de Debye-Waller.

Los puntos de datos independientes fueron determinados por la regla de Stern que define la limitación fundamental a la cantidad de información que puede ser determinada por XAFS. De acuerdo con la regla de Stern, el número de parámetros (Npar) utilizados para el ajuste debe ser estrictamente inferior al número de parámetros independientes (Nind) definidos como 2∆k∆R/π + 2, donde ∆k y ∆R son los parámetros ajustados. rango en el espacio k y R, respectivamente48,49. Si Nind < Npar, el modelo no puede tomarse como una prueba del entorno de coordinación porque el conjunto de datos está subdeterminado por el nivel de complejidad del modelo. En este caso, Nind = 7,5 para ACC estándar, ACC-Gd y muestra ACNC, Nind = 8,16 para ACC-PAA y Npar = 4 como tal que Nind > Npar. El modelo de componentes múltiples que produce el mejor ajuste de los datos experimentales se considera razonable y, por lo tanto, puede considerarse una representación probable para caracterizar el entorno de coordinación del calcio. La combinación lineal se realizó en la región XANES y EXAFS cercana (desde 30 Å-1 antes hasta 80 Å-1 después del salto de borde). Las muestras ACC-Gd, ACNC y PAA-Gd/Ca se compararon con las muestras estándar ACC-PAA y PAA-Ca.

Las mediciones de AUC se realizaron en un Optima XL-A modificado (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) utilizando una óptica de absorbancia y una óptica de interferencia de Rayleigh avanzada desarrollada por Nanolytics (https://www.nanolytics-instruments.de/ interferencia_óptica_aida). Para todos los experimentos se utilizaron piezas centrales de titanio de doble sector de 12 mm de longitud de paso óptico con ventanas de zafiro (Nanolytics, Potsdam, Alemania). Para la medición de la muestra ACNC, la muestra ACNC original se presedimentó en una centrífuga UNIVERSAL 320 Hettich (Hettich, Tuttlingen, Alemania) durante 20 min a 9 000 rpm, lo que corresponde a una fuerza centrífuga de 6000 × g. Se utilizaron 360 µL de solución de ACNC pretratada en el sector de la muestra y 360 µL de una solución de PAA-Ca/Gd previa a la reacción diluida 1:175 (con NaCl 0,154 M) (mezcla acuosa que incluye PAA, cloruro de calcio y cloruro de gadolinio) en el sector de la muestra. sector de referencia. Para la medición de muestras de PAA como referencia, se disolvieron 10 mg de PAA (1800 Da) en 1 ml de solución de NaCl 0,154 M. Todas las muestras se investigaron a 20 °C y 60 000 rpm, lo que corresponde a una fuerza centrífuga de hasta 290 000 × g.

Los datos de velocidad de sedimentación se evaluaron con Sedfit y UltraScanIII. En Sedfit (Schuck, PP SEDFIT versión 16.1c. http://analyticalultracentrifugation.com/download.htm), se utilizaron los modelos ls-g*(s) y continuo c(s,ff0). Para el cálculo de las distribuciones del coeficiente de sedimentación g(s) con el modelo de mínimos cuadrados-g*(s)50, los datos se ajustaron con una regularización de Tikhonov-Phillips utilizando un nivel de confianza (relación F) de 0,683 y una resolución de cuadrícula de 100 puntos. Para la determinación de la densidad de partículas sedimentantes51 con el análisis c(s,ff0)52, los datos se ajustaron con una regularización de máxima entropía utilizando un nivel de confianza (relación F) de 0,683 y una resolución de 100 puntos de cuadrícula en s y cuadrícula de 10–20 puntos en f/f0. Las distribuciones 2D c(s,ff0) se trazaron utilizando el software MATLAB versión R2017b, 64 bits de MathWorks. Para el cálculo de la densidad de la muestra a partir de distribuciones 2D, se utilizó un script de máscara MATLAB desarrollado por Quy Khac Ong (Institute of Materials, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Station 12, 1015 Lausanne, Suiza. Correo electrónico: quy.ong @epfl.ch). Para la caracterización de la anisotropía, UltraScanIII (Demeler, B. UltraScan versión 4.0, versión 2783. Paquete completo de software de análisis de datos para experimentos analíticos de ultracentrifugación. Universidad de Lethbridge, Departamento de Química y Bioquímica. http://www.ultrascan3.aucsolutions. com/download.php) para realizar el análisis de espectro bidimensional (2DSA)53. Los análisis 2DSA-Monte Carlo (MC) se realizaron con 50 iteraciones en una supercomputadora.

La función que define la forma, la flexibilidad y el grado de solvatación (por agua, iones de sal y cualquier otra molécula de disolvente) de la macromolécula es la función de fricción traslacional de Perrin, P (ver la siguiente ecuación). Este grado de asociación de agua se denomina hidratación del soluto, δ, y se define como la masa en gramos de disolvente asociado por gramo de soluto anhidro54.

donde f/f0 es la relación de fricción (que es la relación adimensional del coeficiente de fricción de traslación observado f al de una molécula esférica equivalente de la misma masa anhidra y densidad f0), \(\bar{v}\) es la relación parcial volumen específico (cm3/g) del soluto y \({\bar{v}}_{s}\) es el volumen específico hidratado (el volumen ocupado por el soluto y el solvente asociado por unidad de masa del soluto anhidro) y \({\bar{v}}_{{{{{{\rm{H2O}}}}}}}\) = volumen específico de agua dado como:

Si todo el exceso de fricción se debe a la hidratación y el soluto es una esfera, entonces P es 155 y la hidratación se puede calcular como:

Los moles de moléculas de agua por mol de CaCO3 se calcularon de acuerdo con el resultado de la espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES), el análisis TG y la medición volumétrica de la titulación de Karl Fischer. La medida de la titulación se realizó en un titulador de humedad Karl Fischer (V10S, titulador volumétrico KF, Mettler Toledo). El contenido hidratado se asignó a la pérdida de peso a partir del pico endotérmico hasta los 300 °C, mientras que el contenido de iones Ca2+ y Gd3+ se determinó por ICP-AES. La relación molar entre el agua y los iones Ca2+ en ACC se puede calcular de acuerdo con informes anteriores20,56,57.

La detección de fuga de ion gadolinio se realizó mediante un método informado previamente29,30. Los ACNC se dispersaron en una serie de entornos fisiológicos simulados que incluían solución salina normal, suero humano y suero humano complementado con una concentración adicional de fosfato de 10 mmol/l. El ACNC se dispersó con una concentración final de 1 mmol (Gd)/L. La diálisis de ACNC se realizó a 37 °C durante 7 días utilizando una bolsa de diálisis (MWCO 1000 Da). La concentración de gadolinio en los dializados recogidos en diferentes momentos se midió tanto mediante el ensayo cromogénico mediado por Arsenazo III como por ICP-AES. En el ensayo cromogénico, los dializados recolectados se mezclaron con Arsenazo III (0,05 mM) disuelto en solución tampón de ácido cloroacético-hidróxido de sodio (pH 2,8), y se detectó la absorción a 658 nm. Se usaron solución salina normal y solución de GdCl3 como controles negativo y positivo, respectivamente.

Las muestras de ACNC, Gd-DTPA y PAA-Ca/Gd se prepararon recientemente. En t = 0, cada muestra (Gd 2,5 mM) y solución acuosa de ZnCl2 (250 mM, 20 μL) se mezclaron en 2 mL de tampón de fosfato. Luego, se colocó 1 ml de solución mixta en una botella cromatográfica para la medición. Las mediciones se llevaron a cabo a 37 °C en un sistema de análisis e imagen NMI20-Analyst NMR de 0,5 T. TR/TE = 100/5,6ms. Los tiempos de relajación longitudinal se midieron en diferentes puntos en el tiempo28. La tasa de relajación en t = 0 (indicada como R1(0)) se calculó mediante la fórmula R1 = (1/T1). Las tasas de relajación en otros puntos de tiempo se calcularon y registraron respectivamente como R1(t) correspondiente, con el fin de evaluar la transmetalación de 2 días mediante el control de la proporción de R1(t)/R1(0).

Se añadió 1 ml de solución acuosa de ACNC (Gd 5 mM) a 1 ml de solución de DTPA (5 mM) y se tomó la solución homogénea para medir. En comparación con el Gd-DTPA comercial, la concentración de las soluciones de Gd-DTPA fue idéntica a las soluciones de ACNC como Gd 5 mM. Las medidas y los cálculos fueron consistentes con el estudio de transmetalación.

Se introdujo 1 mL de solución acuosa de ACNC (1 mg (Gd)/mL) en bolsas de diálisis (MWCO: 1000 KD). Luego, las bolsas se colocaron en 50 ml de tampones de PBS o acetato con diferentes pH y se incubaron con agitación a 50 rpm a 37 °C. Recolectamos todas las soluciones de acetato o PBS circundantes en cada intervalo de tiempo para el análisis y luego las reemplazamos con 50 ml de tampones de acetato o PBS frescos. Para evitar la posible interferencia que los iones de metal libres generados por la degradación precipitan con los iones de fosfato en el tampón de PBS, se agregó 1 ml de ácido cloroazótico recién preparado (HNO3/HCl = 3:1) a la solución de acetato o PBS circundante recolectada. , lo que lleva a un entorno ácido fuerte (pH < 3,0) de la solución mixta. En última instancia, las concentraciones de iones Gd en las soluciones circundantes se determinaron mediante ICP-AES.

Se cultivaron células epiteliales tubulares renales humanas (HK-2) y queratinocitos inmortales humanos (HaCaT) en medio de Eagle modificado por Dulbecco. La viabilidad celular se realizó mediante el método MTT estándar. Brevemente, las células se colocaron en placas a una densidad de aproximadamente 1 × 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 12 h. Luego se añadió medio de cultivo DMEM con ACNC y las células se expusieron a ACNC a diversas concentraciones durante 24 h y 48 h. Luego se agregaron 10 μL de solución de MTT (5 mg/mL en PBS) a cada pocillo para una incubación adicional de 4 h a 37 °C. Después de retirar el medio, se agregaron 150 μL de DMSO para disolver los cristales de formazán formados en cada pocillo y se midió la densidad óptica de la solución a 570 nm utilizando Microplate Reader (BioTek Instruments, EE. UU.). La célula HK-2 se usó para el ensayo de potenciales de membrana mitocondrial (MMP), el ensayo de etiquetado dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) mediado por TdT y el ensayo de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU). Kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con agregados J (JC-1) (Beyotime, Shanghai, China), kit de ensayo de apoptosis TUNEL de un solo paso (Beyotime, Shanghai, China) y kit de proliferación celular EdU con Alexa Fluor 555 (Beyotime, Shanghai , China) fueron empleados.

La sangre para el experimento fue recolectada profesionalmente de voluntarios por profesionales médicos en el departamento de transfusión de sangre del primer hospital afiliado de la universidad médica de Anhui. Los estudios de sangre se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China y la Universidad Médica de Anhui (número de licencia: 20170267, 20170268).

Se compraron ratones BALB/c libres de patógenos específicos (SPF) (macho, 6 semanas), conejo de Nueva Zelanda (macho, 2 kg) y perro Beagle (macho, 6 kg) de la Universidad Médica de Anhui. Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Los estudios de compatibilidad in vivo y los estudios de resonancia magnética in vivo se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Médica de Anhui (LLSC20170299, LLSC20170300) y el Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China (2021- N(A)-041).

Las soluciones salinas normales de ACNC se inyectaron por vía intravenosa en ratones (a través de la vena de la cola) a una dosis de 5 mg de Gd/kg de peso corporal y perros Beagle (a través de la vena de las patas traseras) a una dosis de 9 mg de Gd/kg de peso corporal. Para la evaluación del índice sanguíneo y el índice bioquímico, los ratones se sacrificaron mediante anestesia durante 3 días y 3 semanas después de la inyección intravenosa, respectivamente. Se recogió sangre de perros Beagle cada dos semanas a través de la vena de las patas traseras. Las muestras de sangre se recogieron mediante los tubos de recogida de sangre con anticoagulante y los tubos de gel de separación. El examen del índice sanguíneo y el índice bioquímico se realizaron en Sysmex XE2100 y Vitros 5600, respectivamente.

Las soluciones salinas normales de ACNC se inyectaron por vía intravenosa en veinte ratones (macho, 20 g) a 3 mg Gd/kg de peso corporal (0,5 mg Gd/mL, 120 µL) a través de una inyección manual rápida para un estudio de inyección en bolo simulado. Estos ratones se dividieron al azar en cuatro grupos y se extirparon varios órganos de los ratones en cada grupo 1, 7, 15 y 30 días después de la inyección intravenosa, respectivamente. Las muestras de orina se recogieron 12 h después de la inyección iv de ACNC en ratas a 5 mg de Gd/kg de peso corporal, seguido de diálisis a 25 °C. Después de 24 h, los dializados en bolsas de diálisis (MWCO = 1000 Da) se recolectaron para su posterior caracterización.

ACNC y Gd-DTPA dispersos en solución salina normal a gradiente de concentración en microtubos de 5 mL se colocaron sobre un soporte sumergido en solución de NiSO4. Las concentraciones de gadolinio se midieron por ICP-AES. El mapa MR T1 se adquirió utilizando una secuencia de recuperación de inversión en un escáner MR de 3,0 Tesla (Trio Tim, Siemens) equipado con una bobina de cabeza. Los parámetros de imagen fueron los siguientes: tiempo de repetición (TR) = 4000 ms, tiempo de eco (TE) = 14 ms, tiempo de inversión (TI) de 25 a 3500 ms (TI incluido 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 , 300, 350, 400, 500, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 ms), campo de visión (FOV) = 220 × 144 mm2. La relaxividad longitudinal (r1) se calculó de la siguiente manera según una ecuación reportada previamente con un gradiente de concentración de 0.05 a 0.4 mM de ion gadolinio. El inverso del tiempo de relajación (1/T1, s−1) se representó frente a la concentración de gadolinio, y la pendiente del gráfico fue la relajación del agente (mM−1 · s−1)58,59. Las mediciones en un sistema de escáner de RM de campo bajo se realizaron utilizando un instrumento LF-NMR de 0,5 T a 32 °C proporcionado por Suzhou Niumag Analytical Instrument Corporation.

Después de la anestesia intravenosa completa, los animales se fijaron en diferentes soportes con el tamaño adecuado. Luego, se inyectaron por vía intravenosa ACNC disperso en solución salina normal o Gd-DTPA diluido en solución salina normal. Se inyectó a la rata desde la vena caudal usando una aguja permanente a una dosis de 2,5 mg Gd/kg. La inyección en bolo en conejos y perros beagle se realizó a una dosis de 3 mg Gd/kg de las venas de las extremidades anteriores mediante un inyector mecánico de alta presión (Optistar LE, Mallinckrodt, EE. UU.). Se empleó la secuencia FLASH 3D para recopilar datos angiográficos. Los parámetros detallados de la angiografía por RM de rata fueron los siguientes: Se usó una bobina de rodilla. TR = 3,95 ms, TE = 1,9 ms, FOV: 210 × 280 mm2. El tiempo de adquisición (TA) fue de 24,62 s. El ángulo de giro (FA) fue 20. La matriz de adquisición fue 288p * 512. El número de adquisición y el número de promedios fueron ambos 1. Los parámetros detallados de la angiografía por RM de conejo fueron los siguientes: Se utilizó una bobina local de cabeza y cuello. TR = 3,6 ms, TE = 1,65 ms, FOV: 210 × 280 mm2. El tiempo de adquisición (TA) fue de 23,4 s. El ángulo de giro (FA) fue 18. La matriz de adquisición fue 288p * 512. El número de adquisición y el número de promedios fueron ambos 1. Los parámetros detallados de la angiografía por RM del perro beagle fueron los siguientes: una bobina local de cabeza y cuello, una bobina de columna y radiofrecuencia Se utilizaron bobinas de transmisión del cuerpo. TR = 3,19 ms, TE = 1,28 ms, FOV: 240 × 320 mm2. El tiempo de adquisición (TA) fue de 20,74 s. El ángulo de giro (FA) fue 16. La matriz de adquisición fue 288p * 512. El número de adquisición y el número de promedios fueron ambos 1. Las imágenes fueron procesadas primero por la estación de trabajo Siemens Syngo MR.

La relación señal-ruido (SNR) se calculó en una sola imagen (κ) en función de dos regiones de interés (ROI) separadas. Uno en el vaso de interés (ROIvessel) se midió colocando una señal en el mismo ROI en el mismo corte tanto en el grupo Gd-DTPA como en el grupo ACNC, que se registró como las intensidades de señal media del vaso (Svessel). Uno en el fondo de la imagen (ROIbackground) se ubicó en un área homogénea libre de artefactos, que se definió como la señal de fondo (Sbackground)34. SNR corresponde a la relación entre Svessel y Sbackground se calculó utilizando la ecuación. (5):

Se seleccionaron tres ROI en la aorta descendente, el arco aórtico y la aorta ascendente en conejos, y se midieron cuatro regiones en la arteria del tronco braquiocefálico, la arteria subclavia izquierda, la arteria carótida común izquierda y la rama derecha de la arteria olfatoria en perros beagle, respectivamente.

Todos los datos se expresaron como media ± DE. Se usó la prueba t de Student de dos colas para el análisis estadístico de la comparación entre dos grupos, y se usó ANOVA unidireccional para el análisis estadístico de la comparación entre múltiples grupos. Se consideró diferencia estadística un valor de P < 0,05 (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001). La significancia estadística se determinó utilizando SPSS estadístico 17.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los autores declaran que los datos generados en este estudio se proporcionan en el documento y en la Información complementaria, o están disponibles a pedido de los autores correspondientes.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones 51732011 y U1932213 a SHY; 22122502 y 51972090 a YL; 51702309 a LD; 81801831 a HQW), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Subvenciones 2021YFA0715700 y 2018YFE0 202201) a SHY, los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (WK9110000062 a YJX; WK2060190056 a LD), el Programa de Innovación de Sinergia Universitaria de la Provincia de Anhui (Grant GXXT-2019-028) a SHY, Proyecto Principal de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Anhui (201903a05020003 ) a SHY, la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Anhui (2008085J06 a YL; 1708085ME114 a YJX), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2015M570540) a LD, la Fundación del Programa Principal/Innovador de Desarrollo del Centro de Ciencias Físicas y Tecnología de Hefei (2016FXZY005 ) a YL Los autores desean agradecer a Mei Sun, Yan-Wei Ding, Cheng-Min Wang, Yu-Song Wang, Guan-Yin Gao, Han-Bao Chong, Yu-Feng Meng, Yang-Yi Liu en la Universidad de Ciencias y Tecnología de China, Hao Ding en Suzhou Niumag Analytical Instrument Corporation, Yong-Hong Song, Wen-Shu Wu en la Universidad Tecnológica de Hefei, Hai-Shen Qian en la Universidad Médica de Anhui, He Chen, Li Zhang y Hui Wang en The First Affiliated Hospital de la Universidad Médica de Anhui, Kun Liu en la Universidad de Xiamen, Duo An en la Universidad de Cornell y Ye-Ping Li de Anton Paar China por su útil ayuda en este manuscrito, y Luca Olivi, Giuliana Aquilanti y Simone Pollastri en la línea de luz XAFS en Elettra Synchrotron por su ayuda. DG es profesor de la Leibniz Universität Hannover. JA está financiado en el marco del SFB 1214 (Centro de Investigación Colaborativo financiado por la Fundación Alemana de Investigación, DFG, proyecto A02). HC agradece al centro de análisis de partículas del SFB 1214 por el equipo AUC.

Estos autores contribuyeron por igual: Liang Dong, Yun-Jun Xu, Cong Sui.

Departamento de Química, Instituto de Materiales Biomiméticos y Química, Laboratorio de Ingeniería de Materiales Biomiméticos de Anhui, División de Nanomateriales y Química, Centro Nacional de Investigación de Ciencias Físicas a Microescala de Hefei, Instituto de Energía, Centro Nacional Integral de Ciencias de Hefei, Universidad de Ciencia y Tecnología de China, Hefei, 230026, China

Liang Dong, Cong Sui, Yang Zhao, Li-Bo Mao, Huai-Ling Gao, Zhao Pan y Shu-Hong Yu

The Cancer Hospital of the University of Chinese Academy of Sciences (Zhejiang Cancer Hospital), Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences, Hangzhou, Zhejiang, 310022, China

Liang Dong y Zhao Pan

Laboratorio clave de la provincia de Anhui de materiales catalíticos avanzados e ingeniería de reacción, Escuela de Química e Ingeniería Química, Universidad Tecnológica de Hefei, Hefei, 230009, China

Liang Dong, Ya-Dong Wu, Xu Yan, Fei Li y Yang Lu

Departamento de Radiología, Hospital Provincial de Anhui, Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China, Hefei, 230001, China

Yun-Jun Xu

Instituto de Química Inorgánica, Leibniz Universität Hannover, Callinstr. 9, 30167, Hanóver, Alemania

Denis Gebauer

Química Física, Departamento de Química, Universidad de Konstanz, Universitätsstr. 10, Constanza, D-78457, Alemania

Rose Rosenberg y Helmut Colfen

Científico - Centro de análisis de rayos X, Empa - Swiss Federal Laboratories for Materials Science and Technology, Lerchenfeldstrasse 5, 9014, St. Gallen, Suiza

jonathan avaro

Departamento de Transfusión de Sangre, Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui, Hefei, 230022, China

Hui Qin Wen

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SHY y YL concibieron la idea, diseñaron los experimentos y supervisaron la investigación, LD, CS, YL, YZ, LBM, DG, HC, RR, YDW y FL llevaron a cabo el experimento sintético y el análisis. DG, JA, HC y LD trabajaron en la medición y el análisis de EXAFS. LD, YZ, HLG, ZP, HQW, XY y FL procesaron la evaluación biocompatible. LD, YJX, YDW, YL, HLG, ZP, XY, FL y CS trabajaron en los experimentos con animales, LD, YJX, YL, FL y CS investigaron el rendimiento de la resonancia magnética, LD, YJX, CS, DG, YL, HC , y SHY escribieron el artículo, todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Yang Lu, Helmut Cölfen o Shu-Hong Yu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Peng Huang y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Dong, L., Xu, YJ., Sui, C. et al. Nanoclusters de carbonato de calcio amorfo paramagnético altamente hidratado como agente de contraste de resonancia magnética. Nat Comun 13, 5088 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32615-3

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Recibido: 06 junio 2021

Aceptado: 08 agosto 2022

Publicado: 29 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32615-3

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