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Jun 17, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1290 (2022) Citar este artículo

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Las bacterias y Eucarya utilizan la vía de las pentosas fosfato no oxidativas para dirigir las fracciones de ribosa de los nucleósidos al metabolismo del carbono central. Muchas arqueas no poseen esta vía y, en cambio, Thermococcales utiliza una vía de bifosfato de pentosa que involucra a la ribosa-1,5-bisfosfato (R15P) isomerasa y ribulosa-1,5-bisfosfato (RuBP) carboxilasa/oxigenasa (Rubisco). Curiosamente, múltiples genomas de arqueas halófilas parecen albergar solo la isomerasa R15P y no albergan Rubisco. En este estudio, identificamos una vía de degradación de nucleósidos previamente no reconocida en arqueas halófilas, compuesta por guanosina fosforilasa, ribosa-1-fosfato quinasa dependiente de ATP, isomerasa R15P, fosfatasa RuBP, ribulosa-1-fosfato aldolasa y glicolaldehído reductasa. La vía convierte la fracción ribosa de la guanosina en fosfato de dihidroxiacetona y etilenglicol. Aunque la ruta metabólica de guanosina a RuBP a través de R15P es similar a la ruta del bifosfato de pentosa en Thermococcales, la ruta posterior no utiliza Rubisco y es exclusiva de las arqueas halófilas.

Está bien establecido que Archaea muestra enzimas y vías metabólicas únicas que no se encuentran en Bacteria y Eucarya1,2,3. Un ejemplo representativo es el metabolismo de las pentosas. Las bacterias y los eucariotas utilizan la ruta de las pentosas fosfato4 para sintetizar o degradar los restos de pentosas de los ácidos nucleicos. La vía oxidativa de las pentosas fosfato (vía OPP) sintetiza los precursores de ácido nucleico ribulosa 5-fosfato (Ru5P) y ribosa 5-fosfato (R5P) a partir de glucosa 6-fosfato y proporciona equivalentes reductores en forma de NADPH. La vía de las pentosas fosfato no oxidativas (vía NOPP) lleva a cabo la interconversión entre las pentosas (Ru5P y R5P) y la fructosa 6-fosfato y el gliceraldehído 3-fosfato y, por lo tanto, puede convertir los restos de ribosa de los nucleósidos en intermediarios del metabolismo central del carbono (Fig. .1a). Sin embargo, muchas arqueas no poseen las vías OPP y NOPP. En su lugar, utilizan la ruta del monofosfato de ribulosa (RuMP) para producir las pentosas necesarias para la biosíntesis de ácidos nucleicos5,6,7, convirtiendo la fructosa 6-fosfato en Ru5P y formaldehído. Como excepciones, la mayoría de las arqueas halófilas poseen la vía OPP7,8,9,10, mientras que se predice que varias especies de arqueas, incluidos miembros de Thermoplasmatota, Thaumarchaeota, Halorhabdus, Methanococcus y Methanocaldococcus, albergan genes homólogos que constituyen la vía NOPP. Cabe señalar, sin embargo, que aunque Methanocaldococcus jannaschii alberga tanto la vía NOPP como la vía RuMP11, R5P parece ser generado por la vía RuMP12.

En cuanto a la degradación de nucleósidos, el archaeon hipertermofílico Thermococcus kodakarensis utiliza una vía de bifosfato de pentosa 13,14,15 (Fig. 1a y Fig. 1b complementaria). Los metabolitos de la vía difieren mucho de los de la vía de las pentosas fosfato y están involucradas varias enzimas únicas. Al igual que en las bacterias y los eucariotas, los nucleósidos se convierten en ribosa-1-fosfatos (R1P) y bases nitrogenadas mediante tres nucleósidos fosforilasas que reconocen la uridina, la guanosina y la adenosina (TK1479, TK1482 y TK1895, respectivamente). Mientras que R1P se convierte en R5P en la ruta de las pentosas fosfato, R1P es fosforilada por una ribosa-1-fosfato quinasa dependiente de ADP (ADP-R1PK; TK2029) en T. kodakarensis, generando ribosa-1,5-bisfosfato (R15P). La isomerasa R15P (TK0185) luego convierte R15P en ribulosa-1,5-bisfosfato (RuBP), que posteriormente se convierte en 3-fosfoglicerato (3-PGA) por la actividad carboxilasa de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco ;TK2290)16,17,18,19. T. kodakarensis también alberga un nucleósido-5'-monofosfato fosforilasa único (NMP fosforilasa, anteriormente denominada AMP fosforilasa; TK0352) que cataliza la fosforólisis de AMP, CMP y UMP14,15. Esto permite la conversión directa de NMP a R15P, así como la conversión de nucleósidos a NMP a través de R1P y R15P (Fig. 1a y Fig. 1b complementaria). R15P actúa así como un nodo que conecta el metabolismo de nucleósidos y nucleótidos con el metabolismo central del carbono13,20.

a Se predice que la vía clásica de bisfosfato de pentosa identificada en Thermococcus está involucrada en la degradación de nucleósidos y/o la conversión de nucleósidos en NMP. La derivación NMP, compuesta por NMP fosforilasa, isomerasa R15P y Rubisco, degrada las NMP a 3-PGA. b Se muestra la ruta de bifosfato de pentosa no carboxilante propuesta en este estudio. Las flechas rojas indican reacciones específicas de la vía identificada en este estudio y ausentes en la vía clásica de bifosfato de pentosa. Se muestran las etiquetas de locus que codifican las enzimas cuyas proteínas recombinantes se examinaron en este estudio. Las etiquetas de locus entre paréntesis son genes predichos para codificar enzimas cuyas actividades se detectaron en el extracto libre de células de H. salinarum. Con respecto a VNG_6270G, se investigaron enzimas tanto nativas como recombinantes. NMP nucleósido-5'-monofosfato, R1P ribosa-1-fosfato, R15P ribosa-1,5-bisfosfato, RuBP ribulosa-1,5-bisfosfato, 3-PGA 3-fosfoglicerato, Ru1P ribulosa-1-fosfato, DHAP dihidroxiacetona fosfato .

Cuando se examina la distribución de la vía de las pentosas bisfosfato, se encuentran homólogos de NMP fosforilasa, R15P isomerasa y Rubisco en una amplia variedad de arqueas; la mayoría de los miembros de Archaeoglobales, Lokiarchaeota, Methanomicrobiales, Methanosarcinales y Thermococcales, así como algunos miembros de Desulfurococcales, Halobacteriales, Methanococcales y la mayoría de las especies de Thermofilum en Thermoproteales. Además, recientemente se informó que el análisis metagenómico sugirió la presencia de estos genes en varias especies bacterianas21. Esto aumenta las posibilidades de que esta parte de la vía del bifosfato de pentosa, a la que nos referimos aquí como "derivación de NMP", funcione en muchas especies de arqueas y algunas bacterias. Por otro lado, la distribución de homólogos de ADP-R1PK parece estar limitada a miembros de Thermococcales, que incluyen los géneros Palaeococcus, Pyrococcus y Thermococcus. Sin embargo, es bien sabido que las quinasas dependientes de ADP en Thermococcales tienen contrapartes en otras arqueas que dependen de ATP como donante de fosfato. Estos incluyen las glucocinasas22,23,24 y las fosfofructocinasas25,26 en la glucólisis, la serina cinasa en el metabolismo de los aminoácidos27,28 e incluso la propia R1P cinasa13,29. Estas quinasas dependientes de ATP y ADP que reconocen el mismo aceptor de fosfato generalmente no muestran similitud entre sí. Por lo tanto, es difícil concluir con precisión la distribución de la actividad de la quinasa R1P basándose únicamente en las secuencias del genoma. Hay una gran cantidad de proteínas en las arqueas que se anotan como azúcar quinasas cuyos aceptores de fosfato no se han identificado, y estas podrían incluir quinasas R1P no identificadas.

Curiosamente, encontramos que varias arqueas halófilas albergan homólogos de isomerasa R15P, pero no tienen homólogos para NMP fosforilasa y Rubisco. Además, los homólogos claros de la quinasa R1P no están presentes en ninguno de los genomas halófilos. Por lo tanto, las secuencias del genoma sugieren que en estos halófilos no hay enzimas que suministren el sustrato o utilicen el producto de la isomerasa R15P. En este estudio, buscamos enzimas vinculadas a la isomerasa R15P aparentemente independiente, y hemos identificado una ruta metabólica previamente desconocida que involucra a los bifosfatos de pentosa R15P y RuBP en arqueas halófilas.

Este estudio se inició antes del descubrimiento de toda la ruta de las pentosas bisfosfato, cuando solo se conocía una ruta de NMP a 3-PGA que constaba de NMP fosforilasa, R15P isomerasa y Rubisco14,15 (Fig. 1a). Varias especies de arqueas albergaban homólogos de las tres enzimas, pero curiosamente, algunas arqueas halófilas albergaban solo homólogos de isomerasa R15P15. Estos incluyen Halobacterium salinarum que posee la proteína VNG_1853G, que es 48,1% idéntica a la isomerasa R15P de T. kodakarensis (TK0185), pero no alberga homólogos de NMP fosforilasa ni Rubisco. Entre las 63 arqueas halófilas que se muestran en la Tabla 1, estos casos se observan en 19 especies (Tabla 1, rojo o naranja en la columna VNG_1853G). Por otro lado, 14 arqueas halófilas albergan un conjunto completo de homólogos (azul en columnas TK0352/VNG_1853G/TK2290), mientras que 11 especies poseen solo homólogos de isomerasa R15P y Rubisco (verde en columnas VNG_1853G/TK2290).

Examinamos si los homólogos de isomerasa R15P realmente catalizan la reacción de isomerasa de ribosa-1,5-bisfosfato. Los genes correspondientes de H. salinarum (VNG_1853G) y Haloterrigena turkmenica (Htur_0571) se sobreexpresaron en Escherichia coli. Solo la proteína Htur_0571 de H. turkmenica se pudo obtener en forma soluble y se purificó hasta una aparente homogeneidad (Fig. 2a complementaria). RuBP se generó a partir de R15P en presencia de proteína Htur_0571 purificada (Fig. 2a), lo que indica que la proteína mostró actividad de isomerasa R15P y se denominó isomerasa Ht-R15P. El resultado sugirió la presencia de vías desconocidas que involucran R15P y RuBP en arqueas halófilas.

a En presencia o ausencia de la enzima isomerasa Ht-R15P, se investigó la generación de RuBP a partir de R15P. Las líneas negras, rosadas, azules y verdes indican el producto de reacción sin la enzima, el compuesto estándar R15P 20 mM y el compuesto estándar RuBP 10 mM con la enzima, respectivamente. b En presencia o ausencia de la proteína Hx-RbsK, se examinó la generación de R15P a partir de R1P. Las líneas negras, rosadas, azules y verdes indican el producto de reacción sin la enzima, con la enzima, el compuesto estándar R1P 10 mM y el compuesto estándar R15P 20 mM, respectivamente. c Se examinó la conversión de R1P con las proteínas isomerasa Hx-RbsK y Ht-R15P. Después de la reacción de quinasa por Hx-RbsK, se llevó a cabo la reacción de isomerasa por Ht-R15P isomerasa. El producto de reacción se analizó por HPLC. Las líneas rosas y negras indican productos de reacción con y sin isomerasa Ht-R15P en la segunda reacción, respectivamente. Los compuestos separados con una columna se controlaron con un detector de índice de refracción diferencial.

Para identificar enzimas involucradas en el metabolismo de R15P o RuBP, se buscaron genes candidatos utilizando las secuencias del genoma. Las arqueas halófilas con el homólogo independiente de la isomerasa R15P incluyen H. salinarum30, Halopiger xanaduensis31, Halorubrum lacusprofundi32, H. turkmenica33, arqueas halófilas DL31, Natrinema pellirubrum, Natronobacterium gregoryi y Natronococcus occultus. Buscamos genes que formaran un operón con el homólogo de isomerasa R15P en estas 8 especies y encontramos que los genes anotados como "azúcar quinasa, riboquinasa"/"proteína de dominio PfkB" (rbsK) formaron operones con los homólogos de isomerasa R15P en los ocho casos, mientras que Los genes de la "uridina fosforilasa" (urdpasa) formaron operones en seis casos (Fig. 3). Entre los 19 genomas que albergan un homólogo de isomerasa R15P pero no un homólogo de fosforilasa de Rubisco y NMP, todos, con la excepción de Halorhabdus tiamatea, poseen homólogos de rbsK y urdpasa (Tabla 1, columnas VNG_1851G/VNG_1850G). Esto sugirió que los dos productos génicos están unidos metabólicamente con la isomerasa R15P.

Los códigos de color de los genes relevantes se indican en la figura. Los recuadros con flechas blancas y grises son genes que probablemente forman operones con los cinco genes enfocados. En los cuadros con flechas grises, la longitud del gen no se refleja en el ancho de cada cuadro con flechas. Las flechas negras indican los operones predichos.

Se produjeron proteínas RbsK recombinantes de H. salinarum, H. turkmenica y H. xanaduensis (Hs-RbsK, Ht-RbsK y Hx-RbsK codificadas por VNG_1851G, Htur_0569 y Halxa_1682, respectivamente) en E. coli. Hs-RbsK formó cuerpos de inclusión y los niveles de expresión del gen Ht-RbsK fueron bajos. Se obtuvieron cantidades suficientes de proteína Hx-RbsK soluble y se purificaron parcialmente (Fig. 3a complementaria). Las actividades de quinasa de la proteína Hx-RbsK parcialmente purificada se probaron con varios sustratos aceptores de fosfato (Tabla complementaria 1) utilizando ATP o una mezcla de nucleósidos trifosfatos (NTP) como donante de fosfato (Figura complementaria 4). Examinamos 85 sustratos, incluidos nucleósidos, aldosas, aminoazúcares, alcoholes, cetosas, nucleótidos, fosfatos de azúcar, disacáridos, alcoholes de azúcar y desoxiazúcares. Cuando se normalizó por el tiempo de reacción y la cantidad de enzima, la producción de nucleósido-5'-difosfato (NDP) fue más alta con ribosa-1-fosfato (R1P) (468 nmol ADP min-1 mg-1). Nos abstenemos de designar los valores de estas medidas como velocidades de reacción, ya que la velocidad de formación del producto no es necesariamente constante a lo largo del período de reacción. El siguiente valor más alto se observó con xilulosa (62 nmol NDP min-1 mg-1), seguida de 2'-desoxiguanosina (57 nmol NDP min-1 mg-1) y d-ribulosa (49 nmol NDP min-1 mg-1). 1). La proteína recombinante Hx-RbsK se purificó para análisis bioquímicos adicionales (Fig. 2b complementaria). Usando R1P como aceptor de fosfato, la enzima prefirió ATP entre los NTP (Fig. 5a complementaria). El análisis por HPLC del producto de reacción Hx-RbsK indicó que se generó R15P a partir de R1P (Fig. 2b). Además, el producto Hx-RbsK, R15P, se isomerizó a RuBP mediante la isomerasa Ht-R15P (Fig. 2c). Hx-RbsK requería sal para su actividad quinasa, y 2.0 M era la concentración óptima de KCl (Fig. 5b complementaria). En presencia de ATP 4 mM y R1P 20 mM, observamos una actividad específica de 30,1 μmol min-1 mg-1. Los análisis de la proteína Halxa_1682 indicaron que la proteína Hx-RbsK es una ribosa-1-fosfato quinasa dependiente de ATP (ATP-R1PK) que genera el sustrato para la isomerasa R15P.

Casi todos los genomas de arqueas halófilas albergan dos proteínas anotadas como uridina fosforilasa (Tabla 1, columnas VNG_1850G/VNG_0893G). Los homólogos de VNG_1850G forman un operón con los genes de isomerasa R15P y ATP-R1PK en algunas especies, mientras que las posiciones de los homólogos de VNG_0893G no están relacionadas con el operón. El primero se designa aquí como Urdpase1 y el último Urdpase2. Se pueden distinguir filogenéticamente (Fig. 6 complementaria), lo que sugiere que sus funciones y/o propiedades enzimáticas son distintas. En este estudio, se investigó la proteína Urdpase1. Aunque asumimos que Urdpase1 cataliza una reacción de nucleósido fosforilasa y genera R1P, el sustrato para ATP-R1PK, no estaba claro qué nucleósidos reconoce la enzima.

Se prepararon cuatro proteínas recombinantes Urdpase1 de H. salinarum, H. xanaduensis, H. lacusprofundi y H. turkmenica (Hs-, Hx-, Hl- y Ht-Urdpase1 codificadas por VNG_1850G, Halxa_1684, Hlac_2318 y Htur_0567, respectivamente). utilizando E. coli. Hl-Urdpase1 y Ht-Urdpase1 se obtuvieron como proteínas solubles, mientras que los otros dos formaron cuerpos de inclusión. La proteína recombinante Hl-Urdpase1 se purificó hasta una aparente homogeneidad (Fig. 2c complementaria). La actividad de nucleósido fosforilasa de Hl-Urdpase1 purificada se examinó frente a seis nucleósidos, adenosina, inosina, guanosina, citidina, uridina y timidina (Fig. 4a y Fig. 7 complementaria). Hl-Urdpase1 exhibió la mayor actividad hacia la guanosina y pudo reconocer la adenosina y la inosina en menor medida. Sorprendentemente, la actividad fue menor a concentraciones más altas de KCl (Fig. 8a complementaria). Sin embargo, la enzima retuvo una actividad considerable de guanosina fosforilasa incluso a 2-4 M KCl. La temperatura de reacción óptima y el pH de la enzima fueron 30 ° C y 7, 5, respectivamente (Fig. 8b, c complementaria). Los análisis cinéticos hacia la guanosina y el fosfato revelaron que los parámetros cinéticos Vmax y Km eran 1,5 ± 0,1 μmol min-1 mg-1 y 56 ± 10 μM hacia la guanosina (Fig. 9a complementaria) y 2,1 ± 0,1 μmol min-1 mg-1 y 4,8 ± 0,8 mM hacia el fosfato (Fig. 9b complementaria), respectivamente. Los resultados sugieren que Hlac_2318 codifica una guanosina fosforilasa. La identificación de guanosina fosforilasa, ATP-R1PK e isomerasa R15P implicó la presencia de una vía metabólica que convierte guanosina, fosfato y ATP en RuBP, guanina y ADP a través de R1P y R15P (Fig. 1b). Aunque el donador de fosfato de la quinasa R1P es ATP, la ruta metabólica de guanosina a RuBP corresponde a la ruta de bifosfato de pentosa identificada en Thermococcus13.

Se analizó una actividad de nucleósido fosforilasa de Hl-Urdpase1 frente a seis nucleósidos mediante la cuantificación de las nucleobases liberadas con HPLC. b Se investigó la actividad de fosfatasa de Hx-HAD hidrolasa hacia once fosfatos de azúcar y pNPP mediante la cuantificación del fosfato liberado con verde de malaquita. G1P glucosa-1-fosfato, G6P glucosa-6-fosfato, G16P glucosa-1,6-bisfosfato, F1P fructosa-1-fosfato, F6P fructosa-6-fosfato, F16P fructosa-1,6-bisfosfato, R5P ribosa-5 -fosfato, Ru5P ribulosa-5-fosfato, pNPP p-nitrofenilfosfato. c Se examinó la actividad aldolasa del DHAP de condensación de Hx-FucA y seis aldehídos mediante la cuantificación del DHAP residual después de las reacciones con una enzima de acoplamiento. Las actividades se calcularon a partir de n = 3 experimentos independientes. Las barras de error indican las desviaciones estándar.

Aparte de la isomerasa R15P, Rubisco es la única enzima conocida que utiliza RuBP como sustrato. La presencia de una ruta metabólica que genera RuBP en arqueas halófilas sin Rubisco sugirió la presencia de enzimas no identificadas involucradas en la conversión de RuBP. Tomamos un enfoque de genómica comparativa, junto con un análisis filogenético, para identificar las enzimas que podrían estar involucradas en este metabolismo. Descubrimos que un gen anotado como fuculosa-1-fosfato aldolasa (fucA) está específicamente presente en 17 de las 19 arqueas halófilas que albergan una isomerasa R15P independiente. Los homólogos de FucA están ampliamente distribuidos entre las arqueas halófilas y no es evidente una relación con la aparición de la isomerasa R15P. Sin embargo, un análisis filogenético (Fig. 10 complementaria) revela un grupo de homólogos de FucA que muestra la coexistencia con isomerasas R15P independientes (Tabla 1, VNG_1201G [séptima columna], designado FucA) y se puede distinguir de los demás (Tabla 1, VNG_1201G [undécima columna], designado como FucA*). Solo había dos organismos (H. tiamatea y Halohasta litchfieldiae) que albergaban una isomerasa R15P independiente pero no FucA. Por otro lado, encontramos que otro gen, anotado como haloácido deshalogenasa (HAD)-superfamilia hidrolasa (HAD hidrolasa, hadhlasa), también está específicamente presente en los 17 halófilos (Tabla 1, columna VNG_1202C). Además, estos dos genes forman un operón (Fig. 3) en las 17 arqueas halófilas. Además, en H. lacusprofundi, Halorubrum sp. PV6 y Halorubrum ezzemoulense, los cuatro genes que codifican ATP-R1PK, R15P isomerasa, HAD hidrolasa y FucA forman un operón. Los dos genes fucA y hadhlasa muestran una marcada coincidencia con los tres genes que codifican la guanosina fosforilasa, ATP-R1PK y la isomerasa R15P, lo que aumenta considerablemente las posibilidades de que estas cinco proteínas estén metabólicamente relacionadas.

Examinamos la posibilidad de que las proteínas anotadas como HAD hidrolasa y FucA estén involucradas en el metabolismo de RuBP. Se sabe que la hidrolasa de la superfamilia HAD de Arabidopsis thaliana cataliza la reacción de fosfatasa de ribosa 5-fosfato (R5P) a ribosa (Fig. 11a complementaria)34. Con base en la similitud estructural entre R5P y RuBP (Fig. 11a, b complementaria), planteamos la hipótesis de que la enzima cataliza una reacción de fosfatasa de RuBP. El gen que codifica HAD hidrolasa de H. xanaduensis (Halxa_2271) se sobreexpresó en E. coli y la proteína recombinante (Hx-HAD hidrolasa) se purificó hasta una aparente homogeneidad (Fig. 2d complementaria). La actividad de la fosfatasa se midió frente a 12 fosfatos de azúcar. Observamos una producción de fosfato notable solo cuando se usó RuBP como sustrato (Fig. 4b), lo que sugiere que la enzima era una fosfatasa con una estricta especificidad de sustrato hacia RuBP. La concentración óptima de KCl fue superior a 2,5 M (Fig. 12a complementaria), mientras que el pH óptimo de la reacción fue ~ 6 (Fig. 12b complementaria). La especificidad catiónica de la enzima fue amplia, con niveles similares de actividad detectados en presencia de Mg2+, Mn2+, Co2+ y Ni2+ 1 mM (Fig. 12c complementaria). El análisis cinético hacia RuBP (Fig. 13 complementaria) reveló que Vmax y Km hacia RuBP eran 31 ± 2 µmol min−1 mg−1 y 2,2 ± 0,5 mM, respectivamente. Los resultados implicaron que la enzima, que había sido anotada como HAD hidrolasa (codificada por Halxa_2271), es una enzima que cataliza una reacción biológica previamente desconocida, la desfosforilación de RuBP. Designamos a la enzima como RuBP fosfatasa.

La desfosforilación de RuBP puede resultar en la generación de tres productos de reacción, ribulosa-1-fosfato (Ru1P), ribulosa-5-fosfato (Ru5P) y ribulosa. Por lo tanto, llevamos a cabo un análisis de 1H-NMR del producto de reacción (Fig. 14 complementaria). Aunque también se detectaron cambios químicos derivados de RuBP, los cambios químicos específicos de un Ru1P ciclado que se muestra en un informe anterior35 se confirmaron en el producto de reacción (Figura complementaria 14b, c). Esto sugirió que la fosfatasa de RuBP cataliza la hidrólisis del grupo fosfato en la posición C5 de RuBP, generando Ru1P (Fig. 1b).

FucA clásico es una enzima que cataliza la reacción de aldolasa de fuculosa-1-fosfato (Fu1P). Fu1P se escinde en fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) y l-lactaldehído (Fig. 11c complementaria). Notamos que las estructuras químicas de Ru1P y Fu1P son similares y la diferencia radica solo en el grupo metilo C6 (Figura complementaria 11b, c). Además, tomamos nota del hecho de que, mientras que los niveles de actividad de los sustratos fisiológicos DHAP y l-lactaldehído solo alcanzaban el 10 %, la fuculosa-1-fosfato aldolasa de E. coli, que muestra una identidad del 33,8 % con FucA de H. xanaduensis (Hx-FucA), podría reconocer DHAP y glicolaldehído36. Por lo tanto, se preparó Hx-FucA recombinante usando E. coli y se purificó hasta una aparente homogeneidad (Fig. 2e complementaria). Como Ru1P no está disponible comercialmente, examinamos si Hx-FucA puede catalizar la reacción de aldolasa que condensa DHAP y aldehídos cuantificando el DHAP residual. Los aldehídos probados fueron acetaldehído, propionaldehído, isobutilaldehído, dl-gliceraldehído, dl-lactaldehído y glicolaldehído (Fig. 15 complementaria). La proteína mostró actividad de aldolasa hacia DHAP y todos los aldehídos probados (Fig. 4c). El resultado implicaba que, aunque la especificidad de sustrato de la enzima era amplia, podía catalizar la reacción de aldolasa que escindía Ru1P en DHAP y glicolaldehído. Con HPLC, confirmamos además que el producto de reacción de la reacción Hx-FucA con DHAP y glicolaldehído mostró un tiempo de elución idéntico al del producto de reacción de la fosfatasa RuBP (Fig. 16a complementaria). Se observó un aumento en la actividad con la adición de ZnCl2 a la mezcla de reacción, mientras que se observó una disminución con la adición de EDTA, lo que sugiere que la enzima dependía de los cationes de zinc (Fig. 17 complementaria). Además, examinamos si la fosfatasa Hx-RuBP y la proteína Hx-FucA juntas podrían generar DHAP a partir de RuBP. Solo cuando ambas proteínas estaban presentes en la mezcla de reacción, se produjo DHAP a partir de RuBP (Fig. 16b complementaria). Además, los análisis cinéticos de la enzima revelaron que Vmax y Km hacia el glicolaldehído eran 2,0 ± 0,0 µmol min−1 mg−1 y 3,4 ± 0,3 mM, respectivamente (Fig. 18a complementaria), y aquellos hacia DHAP eran 2,0 ± 0,0 µmol min− 1 mg−1 y 3,5 ± 0,3 mM, respectivamente (Fig. 18b complementaria). Con base en estos resultados, concluimos que la proteína que se había anotado como FucA, codificada por Halxa_2272, es una aldolasa Ru1P que reconoce DHAP y varios aldehídos, incluido el glicolaldehído.

Con base en los resultados obtenidos aquí, proponemos que la isomerasa R15P independiente es un componente de una vía metabólica de nucleósidos previamente no identificada que convierte el resto ribosa de la guanosina en glicolaldehído y DHAP (Fig. 1b). Como la ruta no involucra a Rubisco, aquí designamos esta ruta como la ruta del bifosfato de pentosa no carboxilante.

Aunque DHAP puede ser metabolizado por el metabolismo central del azúcar, el destino del glicolaldehído aún no estaba claro. Sin embargo, no pudimos identificar una enzima candidata basada en la información del genoma que metabolizaría el glicolaldehído. Al medir la actividad enzimática en el extracto libre de células de H. salinarum que potencialmente podría convertir el glicolaldehído, pudimos detectar la actividad reductora del glicolaldehído utilizando NADH como donante de electrones.

A partir del extracto libre de células de H. salinarum cultivado con nucleósidos, purificamos la proteína que muestra actividad de glicolaldehído reductasa hasta una aparente homogeneidad (Fig. 2f complementaria). Mediante análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), se demostró que la proteína purificada era el producto del gen VNG_6270G, anotado como sn-glicerol-1-fosfato deshidrogenasa. El análisis enzimático reveló que la concentración óptima de KCl era superior a 4 M, y que la temperatura de reacción y el pH óptimos eran de 40 °C y ~6, respectivamente (Fig. 19 complementaria). El análisis cinético hacia el glicolaldehído (Fig. 20a complementaria) mostró que la enzima estaba sujeta a la inhibición del sustrato. Los valores de Vmax, Ks1 y Ks2 fueron 33 ± 4 μmol min−1 mg−1, 10 ± 2 mM y 35 ± 8 mM, respectivamente. Teniendo en cuenta la anotación original, examinamos más a fondo si la proteína cataliza la reacción de sn-glicerol-1-fosfato deshidrogenasa o no (Fig. 20b complementaria). La enzima purificada no mostró niveles notables de actividad para la oxidación de glicerol-1-fosfato ni la reducción de DHAP. Además, la proteína recombinante VNG_6270G se preparó con E. coli y se purificó parcialmente (Fig. 3b complementaria). Como era de esperar, la proteína recombinante (Hs-GaR) mostró altos niveles de actividad de glicolaldehído reductasa (40,7 ± 0,4 μmol min-1 mg-1).

Como se supone que la sn-glicerol-1-fosfato deshidrogenasa contribuye a la biosíntesis de los precursores de lípidos de la membrana de las arqueas mediante la reducción de DHAP a glicerol-1-fosfato, la enzima parece ser esencial en todas las arqueas. Sin embargo, encontramos otro gen anotado como sn-glicerol-1-fosfato deshidrogenasa distribuido en todas las arqueas halófilas, incluida H. salinarum (VNG_0406C) (Tabla 1, columna VNG_0406C). La deshidrogenasa de glicerol-1-fosfato arqueal caracterizada de Methanothermobacter thermautotrophicus37,38,39 muestra una mayor similitud con la proteína VNG_0406C (50,7 % idéntica) que con la proteína VNG_6270G (22,5 % idéntica). Esto sugiere que el gen VNG_6270G codifica la glicolaldehído reductasa y no la sn-glicerol-1-fosfato deshidrogenasa (Fig. 1b), y que el gen que codifica la auténtica sn-glicerol-1-fosfato deshidrogenasa es probablemente VNG_0406C.

Con respecto a la distribución de los homólogos del gen VNG_6270G (tabla 1, columna VNG_6270G), su distribución se limita a solo diez arqueas halófilas y el homólogo en H. salinarum está codificado en un plásmido. Aunque la mitad posee un conjunto completo de genes que forman la vía del bifosfato de pentosa no carboxilante, la otra mitad no. Aunque no pudimos excluir la posibilidad de que haya plásmidos cuyas secuencias se hayan pasado por alto en los análisis del genoma, la contribución de los homólogos de VNG_6270G a la degradación de nucleósidos en arqueas halófilas puede ser limitada y pueden existir otras rutas para el metabolismo del glicolaldehído.

Los análisis bioquímicos descritos anteriormente involucran enzimas de diferentes especies de arqueas halófilas. Para confirmar que la vía propuesta está presente en una sola especie, examinamos las actividades enzimáticas en el extracto libre de células de H. salinarum. Cuando se añadió cada sustrato a la mezcla de reacción, incluidos los extractos libres de células, se detectaron los productos de las reacciones de guanosina fosforilasa (R1P), R1P quinasa dependiente de ATP (R15P), RuBP fosfatasa (Ru1P) y glicolaldehído reductasa (etilenglicol) ( Figura complementaria 21a, b, d, f). Por otro lado, cuando se añadió R15P a la mezcla de reacción, no pudimos detectar RuBP, el producto de la isomerasa R15P. Sin embargo, en lugar de RuBP, pudimos observar la generación de Ru1P (Fig. 21c complementaria). Este resultado implicaba que la RuBP generada a partir de R15P por la isomerasa de R15P se convertía posteriormente en Ru1P por la fosfatasa de RuBP. Para confirmar la actividad de la aldolasa de Ru1P, dado que Ru1P no está disponible comercialmente, se examinó una reacción de acoplamiento catalizada por la fosfatasa de RuBP y la aldolasa de Ru1P. Como resultado, DHAP, que se supone que es producido por la aldolasa Ru1P a partir de Ru1P, se detectó claramente cuando se agregaron RuBP y ZnCl2 (Fig. 21e complementaria). Las actividades predichas de las enzimas codificadas por los seis genes fueron detectables en H. salinarum, lo que sugiere la presencia de la ruta de bifosfato de pentosa no carboxilante en este organismo.

Con base en los resultados de este estudio, proponemos una vía de degradación de nucleósidos previamente no reconocida, la vía de bifosfato de pentosa no carboxilante, en arqueas halófilas (Fig. 1b). Aunque el metabolismo de guanosina a RuBP a través de R15P es similar al de la ruta de las pentosas bisfosfato en Thermococcales, la ruta aguas abajo es única. Podemos suponer que el papel fisiológico de la ruta es convertir el resto de ribosa de los nucleósidos en DHAP y etilenglicol. DHAP se puede utilizar en varios metabolismos, incluida la oxidación a piruvato a través de gliceraldehído 3-fosfato, gluconeogénesis y conversión a glicerol para su uso en la biosíntesis de lípidos de membrana y la producción de osmolitos. Por otro lado, el destino metabólico del etilenglicol aún no está claro y será necesario un examen más detenido para comprender si las células utilizan los dos carbonos derivados de las pentosas y cómo lo hacen.

Nuestros resultados y la distribución de genes homólogos sugieren la presencia de múltiples variaciones de las vías de degradación de nucleósidos en arqueas halófilas, todas relacionadas con las pentosas bifosfatos R15P y RuBP. Una característica común en las vías de degradación de los nucleósidos que se encuentran en las arqueas halófilas es que la ADP-R1PK que se encuentra en Thermococcales se reemplaza por la ATP-R1PK identificada en este estudio (Figs. 1 y 5). Como se muestra en la Tabla 1, entre las 63 especies de arqueas halófilas cuyas secuencias genómicas se han determinado, 44 ​​especies albergan homólogos de isomerasa R15P en sus genomas, lo que sugiere la presencia de un metabolismo que involucra a las pentosas bifosfatos R15P y RuBP en estos organismos. Entre estas, 25 especies parecen utilizar Rubisco para el metabolismo de RuBP. La ruta de bifosfato de pentosa no carboxilante identificada en este estudio, que utiliza fosfatasa RuBP y aldolasa Ru1P, se encuentra en 17 especies halófilas y también está ampliamente distribuida. Las dos especies restantes con una isomerasa R15P no albergan Rubisco ni RuBP fosfatasa/Ru1P aldolasa. En cuanto a la NMP fosforilasa, los homólogos solo se encuentran en especies con Rubisco. Entre las 25 especies con Rubisco, 14 albergan un homólogo de fosforilasa de NMP, mientras que 11 no. Por lo tanto, parece que hay tres variaciones principales de la ruta del bifosfato de pentosa en los halófilos que representan 42 de las 63 especies que se muestran en la Tabla 1; (i) uno con Rubisco y NMP fosforilasa, como se ve en los miembros de Thermococcales (Fig. 5a), (ii) uno con Rubisco pero sin NMP fosforilasa (Fig. 5b), y (iii) la ruta de bifosfato de pentosa no carboxilante identificada en este estudio (Figs. 1b y 5c). La distribución de estas variaciones entre las arqueas halófilas no está vinculada a las relaciones filogenéticas de sus organismos fuente (Fig. 6). Curiosamente, todavía hay 10 especies que albergan un conjunto de homólogos correspondientes a la nucleósido fosforilasa y ATP-R1PK (Tabla 1, amarillo en las columnas VNG_1851G/VNG_1850G), que convertirían los restos de ribosa de los nucleósidos en R15P. Esto plantea la posibilidad de que pueda haber incluso más variaciones de las vías de degradación de los nucleósidos en las arqueas halófilas que involucran bifosfatos de pentosa.

Los resultados obtenidos en este estudio y la distribución de genes relevantes implican la aparición de tres tipos de vías de degradación de nucleósidos en arqueas halófilas. Las tres rutas metabólicas son con NMP fosforilasa y Rubisco (a), con Rubisco pero sin NMP fosforilasa (b), sin Rubisco o NMP fosforilasa pero con RuBP fosfatasa y Ru1P aldolasa (c).

El árbol filogenético se construyó utilizando secuencias del gen 16S rRNA. Se utilizó una secuencia de Thermoplasma volcanium (tvo) como grupo externo. Los colores de los círculos corresponden a los de las rutas metabólicas de los nucleósidos en la Fig. 5. Los organismos que se muestran en los códigos rojo y rosa indican las arqueas halófilas que se muestran en la Fig. 3. Los organismos en los códigos rojos muestran aquellos cuyas proteínas se examinaron realmente en este estudio. .

Como se indicó anteriormente, hay 21 especies halófilas cuyas secuencias genómicas sugieren una ausencia de las vías de bifosfato de pentosa carboxilante/no carboxilante. Entre ellos, Halorhabdus utahensis y Halorhabdus tiamatea albergan homólogos de la vía NOPP clásica que se encuentra en bacterias y eucariotas, y la vía NOPP puede ser responsable de la degradación de nucleósidos en estas especies. Sin embargo, todavía hay 19 arqueas halófilas cuyas secuencias genómicas no proporcionan ninguna pista sobre cómo llevan a cabo la degradación de los nucleósidos. Aunque no podemos descartar la posibilidad de que estas especies no utilicen nucleósidos, hemos tomado nota de un homólogo de FucA* distinto al identificado como la aldolasa Ru1P en este estudio (Tabla 1, última columna). El homólogo tiende a ocurrir en estos halófilos, incluidas 9 especies en Haloarcula, Haloplanus y Halohasta, y podría proporcionar pistas para identificar vías adicionales involucradas en el metabolismo de nucleósidos o pentosas.

El análisis de Hl-Urdpase1 recombinante indicó que la enzima prefería la guanosina como sustrato nucleósido para la reacción de la fosforilasa. Curiosamente, la enzima (Hlac_2318) muestra una mayor similitud con la uridina fosforilasa (TK1479) (40,2 % idéntica) que con la guanosina fosforilasa (TK1482) (18,7 % idéntica) en T. kodakarensis. Además de la guanosina fosforilasa, casi todas las arqueas halófilas albergan un segundo homólogo de uridina fosforilasa, Urdpase2. Aunque estos segundos homólogos no forman un operón con genes de la vía de las pentosas bisfosfato, existe una gran posibilidad de que los productos génicos también generen R1P a través de la fosforólisis de nucleósidos. El análisis filogenético reveló claramente que Urdpase1 y Urdpase2 son distintas (Fig. 6 complementaria), lo que sugiere que las características enzimáticas de los miembros de los dos subgrupos difieren entre sí. La identificación del sustrato nucleósido de Urdpase2 se sumará a nuestra comprensión de la degradación de nucleósidos en arqueas halófilas. Es intrigante que sólo uno de los dos genes de nucleósido fosforilasa, el gen de la guanosina fosforilasa, forma un operón con los genes de la ruta de las pentosas bifosfato no carboxilantes. Esto puede estar relacionado con los altos contenidos de GC en los genomas de arqueas halófilas como H. salinarum (67,9%)30. Los nucleósidos/nucleótidos con guanina y citosina podrían mantenerse en una concentración más alta dentro de estas células.

Se han identificado dos quinasas R1P en estudios previos; una quinasa R1P dependiente de ADP de la arquea hipertermófila T. kodakarensis (TK2029) y una quinasa R1P dependiente de ATP de la arquea hipertermófila Pyrobaculum calidifontis (Pcal_0041). La quinasa R1P dependiente de ATP identificada en este estudio (Halxa_1682) era 25 % idéntica a la proteína TK2029 y 36,8 % idéntica a la proteína Pcal_0041. Al comparar las propiedades de las tres enzimas, la quinasa R1P de T. kodakarensis es ADP-dependiente, mientras que las enzimas de P. calidifontis y H. xanaduensis/H. salinarum son dependientes de ATP. Por otro lado, las enzimas de T. kodakarensis y H. xanaduensis muestran una estricta especificidad de sustrato hacia R1P, mientras que la quinasa R1P de P. calidifontis puede reconocer citidina y uridina además de R1P29. Ni los homólogos de los genes de la isomerasa R15P ni de la NMP fosforilasa están presentes en P. calidifontis, lo que se asemeja al caso de las diez arqueas halófilas con solo homólogos de nucleósido fosforilasa y ATP-R1PK descritos anteriormente. Por otro lado, se ha sugerido la presencia de la quinasa R1P en E. coli40. Un examen de enzimas/genes que pueden suprimir una deleción en el gen de la 5-fosfo-D-ribosil-1-difosfato (PRPP) sintasa condujo a una ruta propuesta con la secuencia de reacción R5P → R1P → R15P → PRPP. Se identificó una proteína codificada por phnN que muestra actividad quinasa hacia R15P, lo que conduce a la producción de PRPP. Una proteína responsable de la segunda reacción propuesta, aunque no identificada, sería una quinasa R1P. E. coli posee varias enzimas que muestran similitud con las proteínas arqueales que muestran actividad de quinasa R1P. Como estos incluyen proteínas cuyas funciones no han sido determinadas, una de ellas también puede ser la quinasa R1P. La quinasa R1P y su producto, R15P, pueden distribuirse a través de Archaea y Bacteria más ampliamente de lo que se esperaba anteriormente.

A menos que se indique lo contrario, los reactivos químicos se adquirieron de Nacalai Tesque (Kyoto, Japón), FUJIFILM Wako Pure Chemicals (Osaka, Japón) o Merck (Darmstadt, Alemania). Las cepas y los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 2. La arquea halófila Halobacterium salinarum y su ADN genómico fueron proporcionados por el Centro de Investigación RIKEN BioResource a través del Proyecto Nacional de BioRecursos de MEXT/AMED, Japón. H. salinarum se cultivó a 40 °C en un medio que contenía 250 g l−1 de cloruro de sodio, 20 g l−1 de MgSO4 · 7H2O, 3 g l−1 de citrato trisódico, 2 g l−1 de cloruro de potasio, 5 g l−1 de triptona y 3 g l−1 extracto de levadura (definido como medio alto en sal en este estudio). Cuando fue necesario, se añadieron nucleósidos al medio. La cepa de Escherichia coli DH5α utilizada para la construcción del plásmido y las cepas de E. coli BL21 CodonPlus(DE3)-RIL y Rosetta (DE3) utilizadas para la expresión génica se cultivaron a 37 °C en medio de caldo de lisogenia (LB) que contenía ampicilina (100 mg l−1 ).

Los plásmidos para expresar genes que codifican la isomerasa Hs-R15P y Hs-Urdpase1 se construyeron como sigue. Las regiones codificantes de los genes Hs-R15P isomerasa y Hs-Urdpase1 se amplificaron mediante PCR utilizando ADN genómico de H. salinarum como plantilla y expHs-R15Pi-F/-R y Hs-Urdpase1-F/-R como conjuntos de cebadores, respectivamente. Los cebadores se diseñaron de modo que los sitios de restricción NdeI y BamHI se introdujeran en los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ADN amplificados, respectivamente. Las secuencias de estos cebadores se enumeran en la Tabla complementaria 3. Después de la digestión con NdeI y BamHI, los fragmentos de ADN se ligaron individualmente con pET-21a(+) digeridos con las mismas enzimas de restricción. Los plásmidos de expresión resultantes se denominan isomerasa pET-Hs-R15P y pET-Hs-Urdpase1 (Tabla complementaria 2).

Plásmidos de expresión para genes que codifican la isomerasa Ht-R15P, Hs-RbsK, Ht-RbsK, Hx-RbsK, Ht-Urdpase1, Hx-Urdpase1, Hl-Urdpase1, Hx-HAD hidrolasa, Hx-FucA y Hs-GaR (Tabla complementaria 2) se prepararon de la siguiente manera. Se diseñaron y sintetizaron genes (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) para disminuir su contenido de GC y optimizar sus codones para mejorar la expresión génica en E. coli. Los genes diseñados con sitios NdeI y BamHI en los extremos 5' y 3', respectivamente, se digirieron con NdeI y BamHI y se ligaron con pET-21a(+) digeridos con las mismas enzimas de restricción. Para los 10 plásmidos de expresión resultantes (Tabla complementaria 2) con los dos plásmidos descritos anteriormente, llevamos a cabo un análisis de secuenciación de ADN y confirmamos la ausencia de mutaciones no deseadas. Las secuencias diseñadas de cada gen se muestran en la Fig. 22 complementaria.

Los plásmidos de expresión construidos se introdujeron en E. coli Rosetta (DE3) (para genes que codifican R15P isomerasa, RbsK, HAD hidrolasa y FucA) o E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (para genes que codifican Urdpase1 y GaR). Los transformantes se cultivaron a 37 °C hasta que su DO660 alcanzó 0,4–0,8 y la expresión génica se indujo mediante la adición de isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,1 mM. Después de un cultivo adicional a 37 °C durante 4 h, se recogieron las células.

Las células que expresan las proteínas recombinantes Hs-GaR, Ht-R15P isomerasa, Hx-RbsK y Hx-FucA se resuspendieron con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y se rompieron mediante sonicación. Después de la centrifugación (5000 x g, 15 min, 4 °C), el sobrenadante se aplicó a una columna de intercambio aniónico (Resource Q, GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido) equilibrada con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl (0 a 1,0 M) en Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). Para las tres proteínas distintas de GaR, los tampones de las fracciones relevantes se cambiaron a tampón de fosfato de sodio con NaCl 2 M y se aplicaron a una columna de afinidad de hidroxiapatita cerámica (Bio-Scale CHT 10-1, Bio-Rad, Hercules, CA) equilibrada con Fosfato de sodio 7 mM (pH 7,5) incluyendo NaCl 2 M. Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de fosfato de sodio (7 a 280 mM) en NaCl 2 M. Las fracciones relevantes se recogieron y se purificaron adicionalmente con una columna de filtración en gel Superdex200 (GE Healthcare) equilibrada con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que incluía NaCl 2 M. El mismo tampón se utilizó como fase móvil. Para Hs-GaR, las fracciones relevantes después de la cromatografía de intercambio de aniones se aplicaron a una columna de filtración en gel equilibrada con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que incluía KCl 2 M.

Las proteínas recombinantes Hl-Urdpase1 y Hx-HAD hidrolasa se purificaron con Bio-Scale CHT 10-1 y Superdex200. Las células que producían proteínas Hl-Urdpase1 y Hx-HAD hidrolasa se resuspendieron en fosfato de sodio 5 mM y 7 mM (pH 7,5) con NaCl 2 M, respectivamente, y se rompieron mediante sonicación. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se aplicaron a Bio-Scale CHT 10-1 equilibrado con los mismos tampones utilizados para la suspensión celular. Hl-Urdpase1 y Hx-HAD hidrolasa se eluyeron con gradientes lineales de fosfato de sodio (5 a 500 mM y 7 a 280 mM, respectivamente) en NaCl 2 M. Hl-Urdpase1 y Hx-HAD hidrolasa se purificaron adicionalmente con una columna Superdex200 equilibrada con fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5) con KCl 2 M y Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) con KCl 2 M, respectivamente, con los tampones utilizados como fases móviles.

Las concentraciones de las enzimas purificadas se determinaron con el Protein Assay System (Bio-Rad), usando albúmina de suero bovino (BSA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) como estándar. La homogeneidad de la proteína se confirmó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).

Se cultivó H. salinarum en 200 ml de medio con alto contenido de sal complementado con cuatro nucleósidos (adenosina, uridina, guanosina y citidina: 0,5 mM cada uno). Después de que la densidad celular (OD660) alcanzara 0,7, las células se recogieron, se resuspendieron con 5 ml de fosfato sódico 5 mM (pH 7,5) con KCl 2 M y se rompieron mediante sonicación. Después de la centrifugación (5000 x g, 15 min, 4 °C), el sobrenadante se aplicó a una columna Bio-Scale CHT 10-1 equilibrada con fosfato de sodio 5 mM (pH 7,5) con KCl 2 M. Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de fosfato de sodio (5 a 500 mM) en KCl 2 M. Se recogieron las fracciones que mostraban actividad de glicolaldehído reductasa. Se realizó una purificación adicional con una columna Superdex200 equilibrada con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) que incluía NaCl 2 M. El mismo tampón se utilizó como fase móvil. La concentración de proteína se determinó como se describe anteriormente.

La secuencia de aminoácidos de la proteína purificada que presenta actividad de glicolaldehído reductasa se identificó mediante análisis LC-MS. Después de la separación con SDS-PAGE, las proteínas se tiñeron con tinción de plata. La porción del gel que contenía la proteína diana se cortó y se destiñó con Silver Stain MS Kit. La proteína del gel se redujo, se alquiló, se digirió con tripsina y se extrajo con el kit de digestión tríptica In-Gel (Thermo Fisher Scientific). Los péptidos digeridos con tripsina se analizaron mediante cromatografía líquida de fase inversa de nanoflujo seguida de MS en tándem, utilizando un espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific). Las muestras se inyectaron automáticamente utilizando el sistema PAL (CTC analytics, Zwingen, Suiza) en una columna OSD de trampa L de péptidos (5 µm; AMR, Tokio, Japón) conectada a una válvula inyectora para desalinizar y concentrar péptidos. Después de lavar la trampa con agua de grado MS que contenía ácido TFA al 0,1 % y acetonitrilo al 2 % (disolvente C), los péptidos se cargaron en una columna capilar de nano HPLC (rellena con C18 con un tamaño de partícula de gel de 3 µm, 0,1 × 150 mm; Nikkyo Technos, Tokio, Japón). Los eluyentes fueron: A, 100 % de agua que contenía 0,5 % de acetato, y B, 80 % de acetonitrilo que contenía 0,5 % de acetato. En la columna se incrementó el gradiente de concentración de acetonitrilo: de 5% B a 45% B en 60 min, 45% B a 95% B en 1 min, manteniendo 95% B por 19 min, de 95% B a 5% B en 1 min, y finalmente reequilibrando con 5% B por 9 min. El caudal se aceleró de 200 a 500 nl min−1 con un gradiente de concentración de acetonitrilo. Se utilizó el sistema Xcalibur 2.1 (Thermo Fisher Scientific) para analizar los espectros de péptidos dentro del rango de masas de m/z 350–1500 y analizar los espectros de MS/MS en la adquisición de datos dependientes de la información dentro del rango de masas de m/z 150–2000. La fragmentación se realizó mediante disociación inducida por colisión (CID). Se eligieron múltiples péptidos cargados con buenas características de fragmentación para los experimentos de MS/MS. Se interpretaron los espectros MS/MS y se prepararon listas de picos con Proteome Discoverer 1.4 y 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Las búsquedas de genes se llevaron a cabo utilizando SEQUEST-HT (Thermo Fisher Scientific).

La actividad de la isomerasa R15P se examinó usando ribosa-1,5-bisfosfato (R15P) como sustrato y detectando el producto RuBP con HPLC. La mezcla de reacción (100 μl) estaba compuesta por Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), R15P 5 mM (Tokyo Chemical Industry, Tokio, Japón), MgCl2 10 mM, KCl 1,84 M y 2 ó 3 μg del compuesto recombinante purificado. Proteína isomerasa Ht-R15P. La mezcla de reacción sin R15P se preincubó a 47 °C durante 3 min. La reacción se inició mediante la adición de R15P, se llevó a cabo a 47 °C durante 15 min y se detuvo mediante un enfriamiento rápido en hielo y la eliminación de la enzima mediante ultrafiltración con la unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5 (MWCO: 10 K) (EMD Millipore , Billerica, MA). El producto de reacción se analizó por HPLC utilizando una columna Asahipak NH2P-50 4E (Shodex, Tokio, Japón) con fosfato de sodio 300 mM (pH 4,4) como fase móvil. Los compuestos eluidos se controlaron con un detector de índice de refracción diferencial. Los datos del cromatograma de HPLC medidos con los sistemas LC-10A o Nexera X2 (Shimadzu, Kyoto, Japón) se recopilaron utilizando LCsolution 1.22 SP1 o LabSolutions 5.57.

La actividad quinasa de Hx-RbsK se midió cuantificando la cantidad de NDP producidos a partir de NTP con enzimas de acoplamiento, piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa (PK/LDH). PK convierte fosfoenolpiruvato y NDP en piruvato y NTP. LDH cataliza la conversión de piruvato y NADH en lactato y NAD+. Los NDP generados se calcularon midiendo la disminución de la absorbancia a 340 nm (A340) derivada de NADH.

Para medir la actividad de Hx-RbsK, se examinó la producción de NDP como sigue. La mezcla de reacción de la quinasa (100 μl) contenía una mezcla de Tris-HCl 50 mM y Bicine-NaOH 50 mM (pH 8,3 u 8,4), aceptores de fosfato 25 mM que incluían ribosa-1-fosfato (R1P) (Toronto Research Chemicals Inc., Toronto, Canadá), NTP (4 mM de ATP [ORIENTAL YEAST, Tokio, Japón], 4 mM de ATP con 2 mM de cada GTP/UTP/CTP, 2 mM de cada ATP/GTP/UTP/CTP/TTP o 4 mM de ATP con 1,5 mM de cada GTP/UTP/CTP/TTP), MgCl2 20 mM, NaCl 1,8 M o 4 M y 2, 2,5 o 4 μg de proteína Hx-RbsK parcialmente purificada. Ochenta y cinco aceptores de fosfato probados como sustratos y las condiciones de reacción se resumen en la Tabla complementaria 1. La mezcla de reacción sin NTP se incubó a 42 o 47 ° C durante 3 min y la reacción se inició mediante la adición de NTP y se llevó a cabo durante 15, 30 o 60 min. La reacción se detuvo por enfriamiento rápido en hielo durante 10 min y se eliminó la enzima por ultrafiltración como se describió anteriormente. La mezcla de reacción de PK/LDH (100 μl) estaba compuesta por MES-NaOH 15 o 50 mM (pH 6,5), 25–50 μl de la mezcla de reacción de quinasa, fosfoenolpiruvato (PEP) 5 o 20 mM, NADH 0,2 mM (LEVADURA ORIENTAL ), 5 unidades de PK y 7 unidades de LDH. Se midió A340 de la mezcla de reacción PK/LDH sin enzimas de acoplamiento. Se agregaron las enzimas de acoplamiento y se controló A340 a temperatura ambiente hasta que ya no se observó una disminución. A menos que se indique lo contrario, la absorbancia se midió con un espectrofotómetro, Ultrospec 3000 (GE Healthcare) o Ultrospec 6300 pro (GE Healthcare). El coeficiente de absorbancia molar aplicado de NADH fue ε340 nm = 6,22 × 103 M−1 cm−1. La reacción se realizó sin sustrato aceptor de fosfato y se restó el valor de los valores obtenidos con los sustratos aceptores. Las cantidades de NDP producidas se normalizaron dividiendo el tiempo de reacción (min) y la cantidad de proteína (mg).

Cuando se examinó la especificidad de NTP, la reacción se realizó a 42 °C durante 5 min en presencia de R1P 25 mM, NTP 4 mM, NaCl 0,8 M, 1,2 μg de proteína purificada y otros componentes descritos anteriormente. Para la determinación de la actividad específica hacia R1P, la reacción se llevó a cabo a 47 °C durante 3, 4 y 5 min con la mezcla de reacción que incluía R1P 20 mM, ATP 4 mM, KCl 2 M y otros componentes descritos anteriormente. Para determinar la dependencia de KCl, se reemplazó NaCl con KCl (0–3 M) y se midieron las actividades específicas a 47 °C en presencia de R1P 15 mM, ATP 4 mM y otros componentes descritos anteriormente. En el análisis del producto de reacción Hx-RbsK con HPLC, se incluyeron R1P 10 mM, ATP 30 mM, KCl 2 M, 1 μg de proteína purificada y otros componentes descritos anteriormente en la mezcla de reacción de 100 μl. La reacción se llevó a cabo a 47 °C durante 15 min. Después de un enfriamiento rápido en hielo durante 10 min y ultrafiltración para eliminar Hx-RbsK, el filtrado se analizó con HPLC como se describe anteriormente. Para la reacción acoplada de isomerasa Hx-RbsK y Ht-R15P, se añadieron partes alícuotas de 50 μl del filtrado a una mezcla de reacción de isomerasa Ht-R15P con AMP 5 mM y sin R15P. Después de la incubación a 47 °C durante 3 min, se inició la reacción y se llevó a cabo durante 15 min. La formación de RuBP se detectó por HPLC como se describe anteriormente.

La actividad de nucleósido fosforilasa de Hl-Urdpase1 se midió cuantificando la nucleobase liberada con HPLC. A menos que se describa lo contrario, la mezcla de reacción (100 μl) incluía fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5), nucleósidos 2 mM (adenosina, inosina, guanosina, uridina, citidina o timidina), KCl 2 M y 1 μg de enzima purificada. Después de la incubación de la mezcla de reacción sin nucleósidos a 37 °C durante 3 min, se inició la reacción añadiendo nucleósidos. Después de la incubación a 37 °C durante varios períodos de tiempo, la reacción se detuvo por enfriamiento rápido en hielo durante 20 min y se eliminó la enzima por ultrafiltración como se describió anteriormente. Para HPLC, se añadió al filtrado un volumen igual de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,5), solución de metanol al 20%. Los productos de reacción se analizaron por HPLC utilizando una columna empacada COSMOSIL 5C18-PAQ (4.6 ID x 250 mm, Nacalai Tesque) equilibrada con fosfato de sodio 20 mM (pH 7.5) con 10% de metanol a una temperatura de 40 °C. Las nucleobases liberadas se detectaron mediante absorbancia UV a 260 nm. Se utilizaron adenosina, adenina, inosina, hipoxantina, guanosina, guanina, uridina, uracilo, citidina, citosina, timidina y timina como compuestos patrón para preparar las curvas patrón.

Para determinar las propiedades enzimáticas generales, variar las concentraciones de KCl (0–4 M), las temperaturas de reacción (20–90 °C) y el pH de la reacción (tampón de fosfato de sodio para pH 2,0–5,0, tampón MES-NaOH para pH 5,5–7,0, HEPES -Tampón NaOH para pH 7,0–8,0, tampón Bicine-NaOH para pH 8,0–9,0). Para el análisis cinético de la guanosina, se probaron varias concentraciones de guanosina (0–1000 μM) a 30 °C en presencia de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5) y KCl 2 M. El análisis cinético hacia el fosfato se llevó a cabo con varias concentraciones de fosfato de sodio (0-32 mM) en presencia de guanosina 1 mM a 30 °C con KCl 2 M. En todos los análisis cinéticos de enzimas, el ajuste de curvas y el cálculo de los valores de Vmax y Km se realizaron con IGOR Pro versión 6.03AJ.

La actividad de fosfatasa de Hx-HAD hidrolasa se determinó cuantificando el fosfato liberado con un ensayo de verde de malaquita. La mezcla de reacción (100 μl) incluía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), fosfatos de azúcar 5 mM, KCl 2 M, MgCl2 5 mM y 1 μg de proteína recombinante Hx-HAD hidrolasa purificada. Doce sustratos, glucosa-1-fosfato (G1P), glucosa-6-fosfato (G6P), glucosa-1,6-bisfosfato (G16P), fructosa-1-fosfato (F1P), fructosa-6-fosfato (F6P), fructosa-1,6-bisfosfato (F16P), ribosa-5-fosfato (R5P), ribosa-1-fosfato (R1P), ribosa-1,5-bisfosfato (R15P), ribulosa-5-fosfato (Ru5P), ribulosa Se examinaron -1,5-bisfosfato (RuBP) y p-nitrofenilfosfato (pNPP). Después de la incubación de la mezcla de reacción sin sustratos durante 5 min a 37 °C, se inició la reacción mediante la adición del sustrato. Después de 10 min de incubación, la reacción se detuvo por enfriamiento rápido en hielo y se eliminó la enzima por ultrafiltración como se describió anteriormente. El fosfato libre liberado se cuantificó utilizando kits de ensayo de fosfato verde de malaquita (BioAssay Systems, Hayward, CA). Los productos de reacción se diluyeron adecuadamente hasta un volumen final de 80 μl y luego se mezclaron con 20 μl del reactivo especificado. Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 660 nm con un espectrofotómetro.

Para determinar las propiedades enzimáticas generales, la reacción se llevó a cabo en una mezcla de reacción de 100 μl que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) o MES 50 mM (pH 6,1), RuBP 10 mM, KCl 2,5 M, MgCl2 5 mM y 0,5 μg de la enzima purificada. Los efectos de las sales se examinaron variando la concentración de KCl (1–3 M) o usando NaCl (3 M). Los efectos del pH se examinaron con 50 mM de ácido acético (pH 4,4–5,9), MES (pH 6,1–7,4) o PIPES (pH 7,5–8,5). Los efectos de los cationes metálicos divalentes se examinaron con MgCl2, CaCl2, MnCl2, CoCl2, NiCl2 o EDTA 5 mM. El análisis cinético de RuBP se realizó en una mezcla de reacción de 100 μl que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), varias concentraciones de RuBP (0–20 mM), KCl 2 M, MgCl2 5 mM y 0,5 μg de la enzima purificada. . Después de 5 min de preincubación, se inició la reacción añadiendo RuBP. Los tiempos de reacción fueron de 1, 3 y 5 min para las reacciones con RuBP 0,1–0,5 mM y de 1, 4 y 7 min para aquellas con otras concentraciones.

Las actividades de aldolasa de Hx-FucA se midieron con fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) y varios aldehídos como sustratos. El DHAP residual después de la reacción de condensación se cuantificó con glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (GPDH) midiendo el consumo de NADH. La mezcla de reacción de aldolasa (100 μl) contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), DHAP 5 mM, aldehídos 25 mM (acetaldehído, propionaldehído, isobutilaldehído, dl-gliceraldehído, dl-lactaldehído o glicolaldehído), KCl 2 M, 1 ZnCl2 mM y 4 μg de enzima purificada. Después de la incubación de la mezcla de reacción sin aldehídos a 47 °C durante 3 min, se inició la reacción añadiendo aldehídos individuales. Después de una incubación adicional a 47 °C (3–20 min), la reacción se detuvo enfriando rápidamente en hielo durante 5 min y eliminando la enzima por ultrafiltración como se describió anteriormente. La mezcla de reacción de acoplamiento (100 μl) contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), 5 μl de una alícuota apropiadamente diluida de la primera mezcla de reacción, NADH 0,2 mM y 1,7 unidades de GPDH. Después de agregar GPDH, se controló A340 con un Ultrospec 6300 pro hasta que ya no se observó una disminución y se cuantificó el DHAP residual en función de la cantidad de NADH consumido.

La reacción de hidrolasa de Hx-HAD junto con la reacción de Hx-FucA se examinó detectando la producción de DHAP a partir de RuBP. La mezcla de reacción (100 μl) contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), RuBP 10 mM, MgCl2 5 mM, KCl 2 M, ZnCl2 1 mM, 1 μg de Hx-HAD hidrolasa y Hx-FucA. Después de la incubación sin RuBP a 47 °C durante 3 min, se inició la reacción añadiendo RuBP. Después de 3 h de incubación, la reacción se detuvo por enfriamiento rápido en hielo y se eliminó la enzima por ultrafiltración. La mezcla de reacción (100 μl) para cuantificar DHAP contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), 40 μl de la primera mezcla de reacción, NADH 0,3 mM y 1,7 unidades de GPDH. La producción de DHAP se cuantificó como se describe anteriormente.

Los parámetros cinéticos de la proteína Hx-FucA hacia DHAP y glicolaldehído se determinaron de la siguiente manera. La mezcla de reacción (100 μl) incluía Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), los sustratos glicolaldehído y DHAP, KCl 2 M, ZnCl2 1 mM y 2 μg de proteína Hx-FucA purificada. Se probaron varias concentraciones de DHAP (1 a 20 mM) o glicolaldehído (1 a 30 mM) con una concentración constante de glicolaldehído (50 mM) o DHAP (20 mM), respectivamente. Después de la incubación a 47 °C durante 3 min, se inició la reacción añadiendo DHAP o glicolaldehído. Después de 12, 16 y 20 min de incubación, la reacción se detuvo mediante enfriamiento rápido en hielo durante 5 min y eliminando las proteínas con columnas de ultrafiltración. El Ru1P producido se cuantificó por HPLC usando una columna Asahipak NH2P-50 4E y un detector UV (200 nm). La columna se equilibró con tampón de fosfato de sodio 300 mM (pH 4,4) a 40 °C y se usó el mismo tampón como fase móvil.

Como Ru1P no está disponible comercialmente, se utilizó la proteína hidrolasa Hx-HAD para producir Ru1P para construir una curva estándar de Ru1P. La reacción se llevó a cabo como sigue. La mezcla de reacción (100 μl) incluía tampón MES-NaOH 50 mM (pH 6,0), RuBP 10 mM, KCl 2 M, MgCl2 5 mM y 1 μg de proteína hidrolasa Hx-HAD. Después de la incubación a 37 °C durante 5 min sin RuBP, se inició la reacción añadiendo RuBP. Después de la incubación a 37 °C durante 5 h, la reacción se detuvo mediante enfriamiento rápido en hielo durante 5 min y se eliminaron las proteínas con una columna de ultrafiltración. Después de confirmar el consumo completo de RuBP por HPLC, se supuso que la concentración de Ru1P generada era de 10 mM y se usó para construir una curva estándar para Ru1P.

Las actividades de la reductasa hacia el glicolaldehído y DHAP se midieron controlando el consumo de NADH (A340) en la mezcla de reacción con un espectrofotómetro UV, UV-1800 (Shimadzu) y los datos se recopilaron con UVProbe 2.52. La mezcla de reacción (1 ml) incluía Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) o MES-NaOH 50 mM/100 mM (pH 6,0), glicolaldehído 7,5 o 20 mM/DHAP 7,5 mM, NADH 0,2 mM, KCl 2 M y 0,2 o 2 μg de glicolaldehído reductasa purificada. Después de la incubación de la mezcla de reacción sin NADH o proteína recombinante a 40 °C durante 1 min, se inició la reacción agregando NADH o proteína recombinante purificada, respectivamente. El análisis de datos se llevó a cabo con el software UVProbe 2.52.

Efectos de las concentraciones de KCl (0–4 M) en MES-NaOH 50 mM (pH 6,5) a 30 °C, temperaturas de reacción (20–90 °C) con MES-NaOH 50 mM (pH 6,5) y KCl 4 M, y Se probaron los valores de pH (MES-NaOH [pH 5.5–7.0], HEPES-NaOH [7.0–8.0], Bicine-NaOH [8.0–9.0] a 40 °C y en presencia de 4 M KCl. Parámetros cinéticos hacia el glicolaldehído a 40 °C se determinaron en una mezcla de reacción (1 ml) que contenía MES-NaOH 50 mM (pH 6,0), varias concentraciones de glicolaldehído (0–70 mM), NADH 0,2 mM, KCl 3 M y 0,2 μg del compuesto purificado. enzima.

La actividad oxidasa hacia el sn-glicerol-1-fosfato se examinó como sigue. La mezcla de reacción (1 ml) incluía MES-NaOH 50 mM (pH 6,0), sn-glicerol-1-fosfato 7,5 mM, NAD+ 0,2 mM, KCl 2 M y 0,2 µg de glicolaldehído reductasa purificada. Después de incubar la mezcla de reacción sin NAD+ a 40 °C durante 1 min, se inició la reacción añadiendo NAD+ y se midió el A340 derivado de NADH con un UV-1800 para calcular la producción de DHAP y los datos se recopilaron con UVProve 2.52.

El producto de reacción de Hx-HAD hidrolasa se analizó por RMN. La mezcla de reacción (300 μl) contenía acetato de amonio 100 mM (pH 6,65), RuBP 10 mM, KCl 2 M, MgCl2 5 mM y 1 μg de la enzima purificada. Después de incubar la mezcla de reacción sin RuBP durante 5 min a 37 °C, se inició la reacción añadiendo RuBP. Después de 10 min de incubación, la reacción se detuvo eliminando la enzima con una columna de ultrafiltración como se describe anteriormente. El producto de reacción se concentró tres veces mediante secado al vacío, se diluyó apropiadamente con D2O (D, 99,96 %) (Cambridge Isotope Laboratories Inc., Tewksbury, MA) y se analizó con 1H-NMR.

La medición de 1H-NMR se llevó a cabo usando un espectrómetro ECA-600 (JEOL, Tokio, Japón) a 600 MHz y 5 °C y los datos se recolectaron con Delta 4. Los espectros de 1H-NMR se adquirieron usando una secuencia de pulso que incorpora presaturación para agua. supresión. La potencia de presaturación fue de 56 dB, que es el mínimo requerido para la supresión completa del pico de agua. Los desplazamientos químicos de los espectros de 1H-NMR se dieron en ppm en relación con las señales de los disolventes utilizando patrones externos de D2O a 4,62 ppm. Los datos de RMN obtenidos se analizaron con Alice2 versión 6.

Se cultivó H. salinarum en medio con alto contenido de sal suplementado con adenosina 2 mM, uridina 100 mM, guanosina 2 mM y citidina 100 mM. Al medir la actividad de guanosina fosforilasa, las células se cultivaron sin nucleósidos para disminuir las señales de fondo derivadas de los nucleósidos añadidos. Se prepararon extractos libres de células como se describe para purificar GaR. Para reducir los picos de fondo, se redujeron las moléculas pequeñas en el extracto celular diluyendo 8 veces con tampón de fosfato 50 mM (pH 7,5) mediante ultrafiltración. La mezcla de reacción (100 μl) contenía fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5), 1500 μg del extracto libre de células y sustrato. Los sustratos, sus concentraciones y tiempos/temperaturas de reacción fueron guanosina 1 mM para guanosina fosforilasa (5 h/40 °C), R1P 40 mM con ATP 20 mM y MgCl2 20 mM para R1P quinasa (17 h/47 °C), 40 R15P mM para isomerasa R15P (12 h/40 °C), RuBP 20 mM y MgCl2 20 mM para fosfatasa RuBP (15 min/40 °C), RuBP 100 mM con MgCl2 20 mM y ZnCl2 1 mM para aldolasa Ru1P (12 h /40 °C), glicolaldehído 40 mM y NADH 30 mM para glicolaldehído reductasa (1 h/40 °C). La incubación se llevó a cabo durante 3 min antes de agregar los sustratos; guanosina, ATP, R15P, RuBP, RuBP y NADH, respectivamente. Las reacciones se detuvieron por enfriamiento rápido en hielo durante 10 min y se eliminaron las enzimas por ultrafiltración. Los productos de reacción se analizaron por HPLC utilizando una columna empacada COSMOSIL 5C18-PAQ y una fase móvil de H2O a 40 °C para glicolaldehído reductasa y una columna Asahipak NH2P-50 4E y una fase móvil de fosfato de sodio 300 mM (pH 4.4) a 40 °C para las demás proteínas. Los productos (R1P, R15P, RuBP, Ru1P, DHAP y etilenglicol) se controlaron mediante un detector de índice de refracción diferencial. Los compuestos estándar eran R1P (10 mM), R15P (10 mM), DHAP (5 mM) y etilenglicol (15 mM) comercialmente disponibles, junto con Ru1P preparado enzimáticamente a partir de RuBP (5 mM) (descrito anteriormente).

Las búsquedas de homología de proteínas se realizaron en la base de datos KEGG Genes utilizando el programa de búsqueda BLAST (https://www.genome.jp/tools/blast/). Las secuencias de genes de ARN ribosomal 16S de halófilos se obtuvieron de la base de datos KEGG Genes. Cuando hubo múltiples ARN ribosómicos 16S en un organismo, se seleccionó una secuencia al azar. El análisis filogenético se realizó con el programa ClustalW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), mientras que el árbol filogenético se construyó con TreeView versión 1.6.6.

La reproducibilidad de los datos se llevó a cabo realizando n = 3 experimentos independientes para recopilar datos y determinar y proporcionar medias y desviaciones estándar.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Gene locus_tag y el código del organismo se adoptaron de los de una base de datos, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (https://www.genome.jp/kegg/). Imágenes de gel sin recortar de las imágenes de gel que se muestran en las Figs. complementarias. 2 y 3 se muestran en la Fig. 23 complementaria. Todos los datos de los gráficos de barras en la Fig. 4a-c se muestran en los Datos complementarios 1. Secuencias de genes artificiales que codifican la isomerasa Ht-R15P, Hs-RbsK, Ht-RbsK, Hx-RbsK, Ht-Urdpase1, Hx-Urdpase1, Hl-Urdpase1, Hx-HAD hidrolasa, Hx-FucA y Hs-GaR están depositados en GenBank con los números de acceso LC735265, LC735266, LC735267, LC735268, LC735269, LC735270, LC7352 71, LC735272, LC735273 , y LC735274, respectivamente.

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Los autores agradecen a la Sra. Eriko Kusaka y al Sr. Haruo Fujita por el análisis de RMN. Agradecemos al Prof. Itaru Hamachi por proporcionar el aparato para el análisis LC-MS. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (Número de concesión: 18K05411) y el Instituto Noda de Investigación Científica para TS y por el programa CREST de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (Número de concesión: 10104047), JSPS KAKENHI número de concesión 18H03934 y JP19H05679 (Post- Ecología Koch), JP19H05684 a HA

Departamento de Química Sintética y Química Biológica, Escuela de Graduados de Ingeniería, Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón

Takaaki Sato, Sanae (Hodo) Utashima, Yuta Yoshii, Kosuke Hirata, Shuichiro Kanda, Yushi Onoda, Jian-qiang Jin, Suyi Xiao, Ryoko Minami, Hikaru Fukushima y Haruyuki Atomi

Centro Integrado de Investigación para la Ciencia del Carbono Negativo, Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón

Takaaki Sato y Haruyuki Atomi

Departamento de Química, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Osaka, Osaka, Japón

Ayako Noguchi, Yoshiyuki Manabe y Koichi Fukase

Centro de Investigación Forefront, Universidad de Osaka, Osaka, Japón

Yoshiyuki Manabe y Koichi Fukase

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HA y TS diseñaron el trabajo. SU analizó la isomerasa R15P. SU, AN, YM, KF examinaron la quinasa R1P. YY, SU investigó la fosfatasa RuBP. YY, SU, JJ examinaron la aldolasa Ru1P. SK, HF examinó la guanosina fosforilasa. KH, RM estudió la glicolaldehído reductasa nativa. SX examinó la glicolaldehído reductasa recombinante. YO estudió las actividades enzimáticas en células de H. salinarum. TS, SU, YY, KH, SK, YO, JJ, SX, HA escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Haruyuki Atomi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Bettina Siebers y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores de manejo principal: Nishith Gupta y Karli Montague-Cardoso.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Sato, T., Utashima, S.(., Yoshii, Y. et al. Una vía de bifosfato de pentosa no carboxilante en arqueas halófilas. Commun Biol 5, 1290 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003 -022-04247-2

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Recibido: 28 julio 2022

Aceptado: 10 de noviembre de 2022

Publicado: 24 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04247-2

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