Inmunoensayo cualitativo para la determinación de residuos de antibióticos de tetraciclina en muestras de leche seguido de una HPLC cuantitativa mejorada

Jun 19, 2023

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 14502 (2022) Citar este artículo

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El contaminante ambiental es uno de varios problemas que dañan a las personas y la vida silvestre. Un ejemplo de los contaminantes emergentes actuales son los residuos de antibióticos que pueden presentarse en el agua y los alimentos. Aunque los antibióticos están destinados a tratar o prevenir infecciones humanas y animales, los antibióticos también se han utilizado como suplementos alimenticios para animales por su capacidad para promover el crecimiento y la eficiencia alimenticia. Este uso excesivo de antibacterianos ha resultado en la acumulación de residuos de antibióticos en los productos alimenticios que eventualmente son consumidos por humanos. La exposición continua e innecesaria de los humanos a los antibióticos a través de la carne o la leche directa de los animales, o indirectamente a través de las plantas o el suelo, puede aumentar la posibilidad de que surjan bacterias multirresistentes y, en consecuencia, afectar negativamente a la salud humana. Se han impuesto nuevas regulaciones con respecto a la utilización de antibióticos. Debido a la escasez de datos sobre las condiciones de residuos de antibióticos en diferentes tipos de alimentos destinados al consumo humano en Arabia Saudita, este estudio propuso un método cromatográfico optimizado (HPLC-DAD) seguido de un enfoque de inmunoensayo para detectar específicamente antibióticos tetraciclinas en muestras de leche animal. El método se llevó a cabo utilizando una columna RP-C18 con una fase móvil compuesta por KH2PO4 0,01 M:acetonitrilo:metanol (70:20:10, v/v/v) ajustada a pH 4. Se observaron mejoras en el método en cuanto a de resolución y sensibilidad. El método de precipitación de proteínas utilizado para la extracción demostró un alto porcentaje de recuperación de 85 a 101 %. El método fue validado de acuerdo con las directrices de la Conferencia Internacional para la Armonización (ICH). Evidentemente, queda claro a partir de estos hallazgos que la presencia de residuos de antibióticos de tetraciclina y oxitetraciclina en los productos lácteos del mercado saudí está por debajo de los límites residuales máximos (LMR).

La contaminación ambiental es un desafío que enfrenta el mundo en el siglo actual. Este problema se define como "la contaminación de los componentes físicos y biológicos del sistema tierra/atmósfera hasta tal punto que los procesos ambientales normales se ven afectados negativamente"1. Se consideran contaminantes las sustancias o la energía que se presenten por encima de los niveles naturales1. Los residuos de antibióticos son una forma de contaminante ambiental que puede presentarse en animales, plantas o suelo y puede promover el desarrollo de microbios resistentes. La resistencia microbiana que se produce por el uso innecesario y la exposición a los antibióticos se define como cambios en los mecanismos de resistencia bacteriana o el desarrollo de nuevos mecanismos en respuesta a antibióticos específicos, una clase de antibióticos o varios tipos de antibióticos a los llamados patógenos multirresistentes ( MDR) 2. En un intento por preservar la actividad antimicrobiana, las autoridades reguladoras han restringido el proceso de prescripción de antibióticos. Sin embargo, los antibióticos también se utilizan como conservantes de alimentos, para promover el crecimiento y mejorar la productividad del ganado y las aves de corral, además de su uso en medicina veterinaria3,4,5. Investigaciones anteriores han demostrado que el uso de altos niveles de antibióticos para aumentar la productividad animal está asociado con la presencia de residuos de antibióticos en alimentos de origen animal6,7,8. La exposición continua de los humanos a los residuos de antibióticos puede ser dañina para los humanos, aumentando la posibilidad de desarrollar reacciones alérgicas, alterando la flora intestinal normal, o puede transferir bacterias resistentes a los antibióticos (ARB) o genes de resistencia a los antibióticos (ARG) de animales a humanos5.

La tetraciclina (TTR), la clortetraciclina (CTC) y la oxitetraciclina (OXY), se encuentran entre los antibióticos más utilizados en la ganadería debido a su eficacia y bajo costo9,10. Numerosos estudios han demostrado la utilización inadecuada de estos antibióticos a nivel mundial y las consecuencias de tal práctica6,11. Por ejemplo, existe un uso descontrolado de antibióticos en la alimentación mixta de animales o como conservantes en la industria alimentaria12,13. Además, los antibióticos a menudo se administran a los animales directamente antes del sacrificio o se introducen en la arteria carótida inmediatamente después del sacrificio para aumentar el período de almacenamiento de la carne fresca12. Eventualmente, las concentraciones residuales de antibióticos pueden exceder los límites residuales máximos (LMR) permitidos por la Unión Europea (UE) y la Organización Mundial de la Salud (OMS).

Los métodos de determinación de antibióticos de tetraciclina (TC) han sido ampliamente investigados por muchos métodos analíticos en diferentes muestras de productos alimenticios, así como en muestras ambientales. Por ejemplo, Al-Ghamdi et al., confirmaron el uso indebido de antibióticos TC en productos avícolas en la región oriental de Arabia Saudita utilizando un método microbiológico14. Además, otros dos estudios realizados en la región de Al-Ahsa'a han mostrado la presencia de residuos de antibióticos en animales. El primer estudio utilizó LC-MS/MS para detectar residuos de nueve antibióticos (quinolonas, fluoroquinolonas, sulfonamidas y tetraciclinas) en tejidos de camellos, vacas y ovejas15. El segundo, realizado por Al-Nazawi et al., utilizó la prueba Delvotest P Multiplate para detectar principalmente TC, estreptomicina y neomicina en productos lácteos16.

Gran parte de la literatura actual utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas LC-MS/MS como el método más apropiado para la detección y cuantificación de antibióticos multiclase en muestras de alimentos y leche17,18. Otras técnicas reportadas para la determinación de residuos de antibióticos TCs en muestras de leche incluyen electroforesis capilar (CE-FL19 y CE-DAD20), una detección microbiológica21 y un método espectroscópico22. Los datos de dos artículos de revisión recientes revelaron el uso de kits inmunológicos como una herramienta de monitoreo para los residuos de antibióticos tetraciclinas en la leche12,17. La Tabla 1 resume algunos métodos cromatográficos informados para la determinación de residuos de antibióticos TC en muestras de leche por HPLC-DAD. Estos artículos de revisión señalan una serie de similitudes entre los métodos publicados. La gran mayoría de los estudios han utilizado una fase estacionaria C18 con HPLC12 de fase inversa. Además, se ha observado que las mezclas binarias de agua-acetonitrilo o agua-metanol con diferentes concentraciones de componentes orgánicos son más utilizadas que las mezclas terciarias (agua-acetonitrilo-metanol). Los ácidos oxálico, fórmico, acético y cítrico se encuentran entre los productos químicos más utilizados en la fase móvil12,23. Se han reportado sistemas de elución en gradiente con muestras complejas y mezclas de antibióticos, lo que permite realizar la separación12.

El objetivo principal del estudio fue determinar residuos de antibióticos tetraciclinas en muestras de leche del mercado saudí mediante HPLC acoplado a la técnica DAD.

Los materiales de referencia de oxitetraciclina (98,07 % de pureza NMR), tetraciclina (> 98,00 %), clortetraciclina (> 95,00 %) y el estándar interno ornidazol (ORZ, > 99,00 %) se compraron a Haoyuan ChemExpress Co., Ltd. (Shanghai, China). ). El dihidrogenoortofosfato de potasio anhidro (KH2PO4) se obtuvo de Loba Chemie Pvt. Ltd. (Mumbai, India). La sal disódica dihidratada del ácido etilendiaminotetraacético (Na2EDTA) se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemie Gmbh (Steinheim, Alemania). El ácido ortofosfórico (H3PO4) se obtuvo de Avonchem Ltd. (Cheshire, Reino Unido). Los disolventes de acetonitrilo y metanol en la fase móvil eran de grado UHPLC y HPLC. En todos los experimentos se usó agua desionizada. Las muestras de leche se compraron en múltiples mercados locales y granjas en la ciudad de Riyadh. Los kits de prueba de inmunoensayo rápido de tetraciclina se obtuvieron de Meizheng Biotech Group, una empresa de PerkinElmer (Beijing, China). El sistema de HPLC (Waters, Milford, MA, EE. UU.) constaba de una bomba de HPLC binaria Waters 1525, un detector de matriz de fotodiodos Waters 2998 y un automuestreador Waters 2707. Los datos fueron adquiridos y procesados ​​utilizando el software Waters Empower 3.

Las separaciones cromatográficas se llevaron a cabo en una columna Macherey-Nagel C18 de fase inversa (250 × 4,5 mm de diámetro interno, tamaño de partícula de 5 μm). La fase móvil fue una mezcla de dihidrogenoortofosfato de potasio 10 mM:acetonitrilo:metanol en una relación 70:20:10 (v/v/v), y se ajustó el pH a 4 con ácido ortofosfórico 0,01 M. La fase móvil se filtró a través de un papel de filtro Whatman de 0,45 µm seguido de desgasificación durante 10 min y luego se entregó a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El análisis se realizó a 25 °C y la elución de los compuestos se controló con un detector de matriz de diodos (DAD) de 210 a 600 nm. Los cromatogramas se registraron a 358 nm y el volumen de inyección fue de 50 µl.

Las soluciones madre (1) a concentraciones de 1 mg/mL para OXY, TTR, CTC y estándar interno ORZ se prepararon en metanol. Se requirió una mayor dilución para preparar la solución madre mixta (2) a una concentración de 10 µg/mL para cada solución, y las concentraciones de trabajo utilizadas fueron 0,09, 0,3, 0,5, 0,7 y 1 µg/mL. La solución madre del patrón interno (2) se preparó por separado mediante el mismo procedimiento. Las soluciones se mantuvieron en un congelador (-20 ℃) ​​y selladas de la luz durante un período de un mes24,25.

Las muestras de leche (n = 100) se clasificaron principalmente según su especie en leche de vaca, camello y cabra. Otras clasificaciones incluían su fuente (producto comercial local/producto comercial importado/granjas locales), vida útil (fresco/de larga vida), contenido de grasa (leche entera, baja en grasa y descremada) y alimentación (orgánica/no orgánica). La información de las muestras se muestra en la Tabla 2. La leche se compró en mercados y granjas saudíes locales (ciudad de Riad) durante los meses de octubre a noviembre de 2021 y febrero de 2022.

La extracción de muestras de leche implica agregar un solvente orgánico para precipitar la proteína y un agente quelante. Esta técnica es común y ha sido utilizada en muchos estudios23. Las muestras se prepararon mediante el siguiente procedimiento. El proceso de extracción se inició mezclando 2 mL de una muestra de leche con 0,4 mL de Na2EDTA 0,2 M y 0,6 mL de metanol en tubos de centrífuga de polipropileno. Una vez que se había formado una solución homogénea, el tubo se centrifugó a 16.000 rpm durante 20 min, se filtró a través de un filtro de jeringa Whatman de 0,22 µm en un vial de HPLC para su análisis.

El kit de prueba rápida de tetraciclina es un ensayo cualitativo que determina la presencia de residuos de antibióticos de tetraciclina en la leche de vaca y camella. Los componentes del kit deben alcanzar la temperatura ambiente (20–25 ℃) antes de su uso. Las muestras de leche se agitaron y se añadieron a los micropocillos (200 µL de muestras de leche de vaca y 100 µL de muestras de leche de camella diluidas con 100 µL de agua desionizada). El polvo de conjugado de recubrimiento se disolvió pipeteando el contenido hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Las mezclas de muestras se incubaron durante 2 min a temperatura ambiente antes de colocar la tira reactiva en los micropocillos. Se observó el desarrollo de color de las tiras reactivas durante 5 minutos y luego se retiraron, y los resultados se interpretaron en 1 minuto.

Después de revisar la literatura, se ha observado que muchos métodos analíticos de CT se llevan a cabo utilizando ácido oxálico como solución de ácido orgánico en la fase móvil, además de acetonitrilo y metanol como modificadores orgánicos. Los experimentos preliminares en estas condiciones revelaron los efectos de cada componente de la fase móvil. Por ejemplo, aumentar la proporción de acetonitrilo por encima del 20% redujo significativamente la resolución. Para optimizar el método en materiales de referencia, se estudiaron diferentes concentraciones de ácido oxálico con diferentes proporciones del modificador orgánico. La relación de fase móvil preliminar fue 70:20:10 (v/v/v) solución de ácido oxálico 10 mM, acetonitrilo y metanol, respectivamente. De acuerdo con publicaciones anteriores, nuestros resultados indicaron que el ácido oxálico 25 mM mostró una resolución óptima sobre otras concentraciones probadas (0, 10, 40, 50 y 60 mM). Nuestros hallazgos también muestran que se observaron tiempos de retención más cortos con ácido oxálico 10 mM.

Con respecto a los modificadores orgánicos, se demostró la separación de picos con resolución satisfactoria con acetonitrilo solo como modificador orgánico en una proporción del 20%. Sin embargo, el uso de acetonitrilo solo ha aumentado el tiempo de retención hasta 30 min. lo que reveló que tanto el metanol como el acetonitrilo son necesarios para las condiciones óptimas. El aumento de las proporciones por encima del 20 % y el 10 % para acetonitrilo y metanol, respectivamente, dio como resultado una reducción significativa en la resolución, mientras que la disminución de estas proporciones resultó en un tiempo de ejecución más largo. Estos hallazgos respaldan ampliamente el trabajo de otros estudios en el caso de analizar el material de referencia estándar, ya que este método no ha logrado proporcionar una resolución aceptable cuando se aplica a matrices de leche. Sorprendentemente, se demostró la interferencia de picos entre un componente de matriz de leche y los picos de TC. Por lo tanto, no se obtuvo una resolución aceptable, lo que sugiere una mayor optimización del método en una matriz de leche enriquecida. Las Figuras 1 y 2 muestran una descripción general de los cromatogramas experimentales para los efectos de cambiar la concentración de ácido oxálico en la matriz de leche enriquecida con fármaco. Contrariamente a las expectativas, estos juicios no lograron una resolución razonable; los métodos no lograron separar el pico de la matriz de los picos del fármaco, a pesar de las diferentes proporciones y concentraciones utilizadas. En general, estos hallazgos indican que la fase móvil a base de ácido oxálico no es adecuada para matrices de leche.

Efectos de cambiar la concentración de ácido oxálico en las drogas enriquecidas con leche de vaca. (a) Ácido oxálico:ACN:MeOH 5 mM (70:20:10). (b) Ácido oxálico:ACN:MeOH 10 mM (70:20:10). (c) Ácido oxálico:ACN:MeOH 15 mM (70:20:10). Condiciones cromatográficas: Volumen de inyección: 30 µL, Temperatura: 25 ℃, Velocidad de flujo: 1 mL/min, Longitud de onda de detección: 358 nm.

Efectos de cambiar la concentración de ácido oxálico en las drogas enriquecidas con leche de vaca. (a) Ácido oxálico:ACN:MeOH 25 mM (70:20:10). (b) Ácido oxálico:ACN:MeOH 30 mM (70:20:10). (c) Ácido oxálico:ACN:MeOH 50 mM (70:20:10). Condiciones cromatográficas: Volumen de inyección: 30 µL, Temperatura: 25 ℃, Caudal: 1 mL/min, Longitud de onda de detección: 358 nm.

El trabajo anterior planteó la posibilidad de reemplazar el ácido oxálico con dihidrogenofosfato de potasio KH2PO4 como sal inorgánica en la fase móvil junto con los modificadores orgánicos para la determinación de antibióticos TC. Por ejemplo, la determinación de OXY y TTR en muestras de leche se llevó a cabo utilizando un sistema de elución isocrático de dihidrogenofosfato de potasio 0,05 M (pH 2,8)/ACN (80:20, v/v)26. El resultado del experimento práctico preliminar fue prometedor, lo que alentó a realizar más investigaciones que evaluaran diferentes concentraciones de KH2PO4 con diferentes proporciones de modificador orgánico.

Inicialmente, se probaron KH2PO4 0,025 M con ACN y MeOH en diferentes proporciones. Sin embargo, la disminución de KH2PO4 a 0,01 M mostró una mejor resolución. La Figura 3 representa el efecto de cambiar las proporciones de las composiciones móviles en la matriz de leche enriquecida. Quizás el hallazgo más significativo es que se logra una buena separación con la fase móvil en una proporción de 70:20:10 de KH2PO4:ACN:MeOH. Sin embargo, se observó una reducción en la sensibilidad, que se esperaba que se deba a la pérdida del farmacóforo en la estructura química de los TC y al cambio del pH de la fase móvil. Por lo tanto, se evaluó el pH de la fase móvil para aumentar la sensibilidad.

Efecto de la concentración de KH2PO4 en la leche de vaca enriquecida. (a) KH2PO4 25 mM: ACN: MeOH (70:20:10). (b) KH2PO4 10 mM: ACN: MeOH (70:20:10).

La influencia del pH se evaluó utilizando ácido ortofosfórico 0,1 M para ajustar la mezcla de fase móvil de KH2PO4:ACN:MeOH 0,01 M en una proporción de 70:20:10 en el rango de pH de 2–5,5. Se evaluó el cambio del pH en términos del efecto sobre la resolución y la sensibilidad. Se notó un aumento en la resolución hacia el pH de 5,5, mientras que en esta región se perdió la sensibilidad. La disminución del pH a cerca de 2-3 mejoró la sensibilidad, pero disminuyó la resolución. A pH 4, la fase móvil mostró una resolución satisfactoria y una sensibilidad aceptable para el propósito del estudio, por lo que fue elegida para la evaluación de muestras de leche. La Figura 4 muestra un cromatograma para el método propuesto.

El cromatograma del método propuesto. Condiciones cromatográficas: KH2PO4 10 mM: ACN: MeOH (70:20:10), Volumen de inyección: 50 µL, Temperatura: 25 ℃, Caudal: 1 mL/min, Longitud de onda de detección: 358 nm.

Aunque solo se detectaron trazas de clortetraciclina (CTC), ajustar el pH de la fase móvil a 4 proporcionó una buena resolución y sensibilidad. Como alternativa, aumentar el volumen de inyección para aumentar la detección y reducir los límites de cuantificación de CTC. Una regla general es mantener el volumen de inyección lo más bajo posible para evitar la sobrecarga de la columna y la ampliación de los picos27. Se examinó un aumento gradual en el volumen de inyección para garantizar que se detectaran concentraciones bajas de CTC sin signos de ampliación del pico. El volumen de inyección se fijó en 50 µL, ya que está dentro de la capacidad del instrumento, y no se observaron signos de ensanchamiento de picos (Fig. 4).

Los espectros de absorción de los tres fármacos, OXY, TTR y CTC, se investigaron con un DAD en el rango de longitud de onda de 200 a 600 nm. Los espectros de los tres fármacos revelaron dos valores lambda max, 267 nm y 358 nm. La longitud de onda de 358 nm se seleccionó como la longitud de onda de detección óptima ya que la matriz de la muestra es compleja y aparecieron muchos picos de interferencia a 267 nm. La Figura 5 muestra los espectros de absorbancia de los analitos objetivo.

Espectros de absorbancia de los analitos objetivo (a) oxitetraciclina, (b) tetraciclina, (c) clortetraciclina y (d) patrón interno.

El procedimiento de extracción fue desarrollado para obtener un buen porcentaje de recuperación manteniendo una muestra concentrada. Los métodos informados anteriormente indicaron que las matrices alimentarias tienen un alto contenido de proteínas, por lo tanto, la precipitación de proteínas se emplea en el paso de pretratamiento17. Además, las moléculas de TC tienen una alta afinidad para formar quelatos de complejos metálicos con cationes metálicos polivalentes como el calcio y el magnesio (Ca+2 y Mg+2), sin embargo, esta formación de complejos podría evitarse agregando un agente quelante a la muestra12. El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y los disolventes orgánicos como el acetonitrilo y el metanol se han utilizado ampliamente en el pretratamiento de muestras de leche23. En el procedimiento de extracción propuesto, se identificaron tres factores clave que podrían afectar el porcentaje de recuperación y la concentricidad de la muestra: (1) el volumen del solvente orgánico, (2) la concentración del agente quelante y (3) el tiempo y velocidad de centrifugado. El volumen de metanol se mantuvo al mínimo para evitar la dilución de la muestra. En este método se empleó EDTA de sodio (Na2-EDTA), que es más fácilmente soluble en agua que el EDTA, como agente quelante sin ajuste adicional del pH. Se demostró que el aumento del tiempo y la velocidad de centrifugación y la concentración de Na2-EDTA a 0,2 M dieron como resultado un aumento significativo en la transparencia del sobrenadante y el porcentaje de recuperación.

La validación del método se realizó mediante análisis estadístico de acuerdo con las directrices del Consejo Internacional de Armonización ICH28. Los parámetros de validación se evaluaron en el material de referencia del fármaco y en las tres matrices de leche diferentes (vaca, camello y cabra). Se investigaron la selectividad y el porcentaje de recuperación en matrices de leche además de la linealidad, los límites de detección y cuantificación, la precisión y la exactitud.

La respuesta de linealidad de cada fármaco se determinó trazando la relación del área del pico del fármaco sobre el área del pico del IS frente a la concentración del fármaco y luego se establecieron las ecuaciones de regresión. La curva de calibración fue lineal en el rango de 0,09–1 µg/mL (90–1000 ng/mL) para cada fármaco. Los coeficientes de correlación fueron > 0,9998 para cada fármaco, lo que demuestra que el método es lineal en el rango especificado. Las concentraciones utilizadas para la curva de calibración fueron 0,09, 0,3, 0,5, 0,7 y 1 µg/mL.

Los límites de detección y cuantificación se determinaron de acuerdo con la relación señal-ruido. El límite de detección se fijó como una relación señal/ruido de 3:1, mientras que el límite de cuantificación se fijó como una relación señal/ruido de 10:1. Los límites de detección de OXY y TTR fueron de 20 ng/mL (0,020 µg/mL), mientras que el límite de detección de CTC fue de 80 ng/mL (0,080 µg/mL). El límite de cuantificación fue de 50 ng/mL (0,050 µg/mL) para OXY y TTR y de 90 ng/mL (0,090 µg/mL) para CTC.

La precisión se evaluó preparando diferentes concentraciones de mezclas de fármacos dentro del rango lineal y una concentración fija de ornidazol como IS (0,8 µg/mL) y luego calculando el % de recuperación y el error relativo. La Tabla 3 muestra un buen % de recuperación (conc. teórica/conc. práctica %) y un pequeño error relativo para OXY, TTR y CTC. Para la precisión intradiaria, las mismas concentraciones de fármaco utilizadas para evaluar la precisión se analizaron tres veces en el mismo día y luego en los dos días siguientes para evaluar la precisión interdiaria. Los valores de desviación estándar relativa (RSD) se calcularon para cada fármaco y concentración en la Tabla 3. Los valores bajos de RSD (< 2) indican un alto grado de precisión.

La selectividad del método se evaluó examinando el cromatógrafo de la muestra de leche en blanco (libre de analitos probados por inmunoensayo y HPLC antes de la adición) frente a una muestra de agua y leche enriquecida. Las tres matrices de leche no mostraron picos de interferencia en los tiempos de retención de los analitos; por lo tanto, se demostró que el método es específico para los TC en la matriz de la leche. La Figura 6 muestra un ejemplo de la selectividad del método en leche de vaca (la muestra de leche en blanco frente a la muestra de agua y leche enriquecida).

Selectividad de la matriz de leche de vaca. fase móvil: 10 mM KH2PO4:ACN:MeOH (70:20:10), pH 4.

Los porcentajes de recuperación se calcularon como la relación de la respuesta de la leche enriquecida con las muestras de agua enriquecida a la misma concentración. Los porcentajes de recuperación de OXY, TTR y CTC en la matriz de leche estuvieron dentro del rango especificado (80–120%). Los porcentajes medios de recuperación ± DE de OXY, TTR y CTC en leche de vaca fueron 94,45 % ± 4,00, 88,77 % ± 3,89 y 89,86 % ± 2,41, respectivamente. Para leche de camella y cabra fueron 101,20% ± 4,05, 98,43% ± 2,28 y 89,33% ± 11,03 y (96,45% ± 2,10, 92,73% ± 3,95 y 86,70% ± 1,95 para OXY, TTR y CTC, respectivamente.

La respuesta de linealidad de cada fármaco en las tres matrices de leche se determinó trazando la relación del área del pico del fármaco sobre el área del pico de IS frente a la concentración del fármaco enriquecido en la muestra de leche en blanco, y luego se establecieron las ecuaciones de regresión y se presentaron en la Tabla 4. Las curvas de calibración fueron lineales en el rango de 0,09–1 µg/mL para OXY y TTR, mientras que el rango de CTC fue de 0,200–1 µg/mL (200–1000 ng/mL). Los coeficientes de correlación fueron ≥ 0,9997 para cada fármaco, lo que demuestra que el método es lineal en un rango específico. Las concentraciones utilizadas para la curva de calibración fueron 0,09, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1 µg/mL.

Los límites de detección y cuantificación se determinaron de acuerdo con la relación señal-ruido. El límite de detección se fijó como una relación señal/ruido de 3:1, mientras que el límite de cuantificación se fijó como una relación señal/ruido de 10:1. La Tabla 4 muestra las ecuaciones de regresión y los valores r para cada fármaco en matrices de leche además del límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ). Aunque el LMR de CTC en la leche fue de 0,100 µg/mL, aquí la concentración de CTC detectada con mayor frecuencia en la matriz de la leche fue de 0,180 µg/mL, y la capacidad de cuantificación comenzó en solo 0,200 µg/mL, lo que se considera un inconveniente de el método.

La precisión y la exactitud se investigaron en muestras de leche enriquecidas y se analizaron tres veces el mismo día y en los tres días sucesivos. La Tabla 5 revela que el método propuesto tiene un alto grado de exactitud y precisión.

El enfoque metodológico adoptado en este estudio es una combinación de análisis cualitativo y cuantitativo. Al emplear un enfoque cualitativo, fue más fácil realizar este estudio exploratorio con el fin de escanear el mayor tamaño de muestra posible. La técnica de inmunoensayo es útil para identificar muestras positivas en poco tiempo. El kit de prueba rápida de TC utilizado es un ensayo de flujo lateral que puede determinar cualitativamente los residuos de TC en la leche de vaca y camella (100 µg/kg). Una tira reactiva se compone de una almohadilla absorbente en el extremo inferior y se utilizan dos líneas en una membrana de nitrocelulosa (línea T y línea C). La línea T es la línea de prueba, que se une a las moléculas de TC, mientras que la línea C es la línea de control, que se une a los anticuerpos secundarios para indicar la validez de la tira reactiva. El componente principal de la prueba son los anticuerpos de tetraciclina conjugados con oro que deben mezclarse con la muestra antes de insertar la tira reactiva. El kit no es selectivo para los antibióticos de cada TC y sus valores de sensibilidad (límites de detección) se establecieron en 14 µg/kg para TTR y CTC y 10 µg/kg para OXY y Doxiciclina.

La figura 7 muestra la presentación visual de los resultados de la prueba para muestras positivas y negativas y los resultados no válidos. La interpretación del resultado se basa en visualizar y comparar las intensidades de color para determinar si los residuos de TCs en la muestra son mayores al LMR (100 µg/kg) o dentro de la limitación, por lo que existe una fuente de sesgo o incertidumbre por la naturaleza autoinformada del resultado como un estudio observacional. Por lo tanto, para minimizar la interpretación negativa falsa del resultado, este kit se utilizó para detectar si había residuos de antibióticos TC en una muestra, independientemente del nivel, de modo que la muestra que muestre un grado de similitud de color cercano o igual entre la línea T y la línea C se considera una muestra positiva y, por lo tanto, se clasifica con las muestras positivas (solo la línea C es visible o la línea T débil) para su posterior determinación mediante análisis HPLC-DAD.

Muestra negativa (-): la muestra está libre de residuos de tetraciclinas si la intensidad de la línea T es mayor que la línea C, y es inferior a la limitación si sus intensidades son similares. Muestra positiva (+): los residuos de antibióticos TC son iguales a la limitación si la intensidad de la línea T es más ligera que la línea C, y es mayor que la limitación si solo la línea C es visible. Resultado no válido: si la línea C es invisible.

Para el control de calidad, se prepararon un control positivo (tetraciclina: 14 ppm = 14 ng/mL) y una muestra de control negativo de acuerdo con las instrucciones y se analizaron cada vez que se utilizó el kit, además de una muestra de leche enriquecida con 100 ng/mL. TC. Este procedimiento asegura la sensibilidad y validez del kit durante el tiempo de almacenamiento. Además, una muestra aleatoria de cada una de las cinco muestras negativas se sometió a análisis por HPLC-DAD para confirmar el resultado del inmunoensayo.

Las muestras de leche de vaca y camello se escanearon primero en busca de residuos de antibióticos TC mediante el kit de inmunoensayo. Solo las muestras que mostraron una línea T oscura en comparación con la línea C con residuos de antibióticos TC en el kit de inmunoensayo se consideraron muestras negativas y se excluyeron del análisis HPLC-DAD. Las muestras que mostraban solo una línea C o una línea T que era tenue o similar a la línea C en intensidad se determinaron para residuos de antibióticos TC mediante HPLC-DAD, junto con las muestras de leche de cabra. El día del análisis, se prepararon e inyectaron muestras de agua y leche enriquecidas para garantizar la idoneidad del sistema cromatográfico. A continuación, se prepararon muestras de leche y se inyectaron en el sistema HPLC-DAD. Los tiempos de retención de estos picos se compararon con los tiempos de retención de la muestra de leche enriquecida y los espectros UV. El siguiente paso fue añadir a estas muestras una concentración conocida de los fármacos y luego inyectarlas dos veces y examinar su pureza máxima para excluir cualquier interferencia de la matriz. El nivel de residuos de antibióticos TC se determinó calculando su concentración frente a leche enriquecida con una concentración conocida de los fármacos. El flujo de trabajo se representa en la Fig. 8.

Diagrama esquemático del flujo de trabajo.

Para la prueba cualitativa en leche de vaca y camello (hubo 18 muestras positivas en dos tipos de leche; 17 muestras fueron leche de vaca y 1 muestra fue leche de camello). Estas muestras positivas se analizaron más a fondo mediante el método propuesto para determinar los niveles de residuos de antibióticos TC.

Como muestra la Tabla 6, la presencia de residuos de CT en los productos lácteos (tamaño de la muestra = 100) fue inferior al LMR (0,1 µg/ml). Los antibióticos detectados prominentes fueron OXY y TTR con niveles inferiores al LMR en la mayoría de las muestras positivas. Con respecto al total de residuos de antibióticos TC, solo 9 muestras (11,54%) excedieron el LMR. No se detectó CTC en ninguna de las muestras, lo que posiblemente se deba al límite de detección de este método (0,180 µg/mL) que era superior al LMR. Sin embargo, este hecho no está respaldado ya que las muestras positivas contienen otros antibióticos TC y el uso de CTC está restringido.

Los TC se usan comúnmente en medicina veterinaria como antibióticos o promotores del crecimiento. El uso inapropiado o la falta de protocolos claros de utilización pueden dar lugar a la presencia de sus residuos en los productos pecuarios. Nuestro método HPLC-DAD muestra una mejora en los parámetros de resolución y sensibilidad que fue validado de acuerdo con las pautas de la ICH. Los porcentajes de recuperación son altos (85-100%) con efectos de matriz mínimos. Nuestro hallazgo indica que en la mayoría de las muestras de leche obtenidas del mercado saudí, los residuos de TC están por debajo del LMR para TTR y OXY. Las únicas excepciones fueron el 7,5 % de las muestras que excedieron el LMR de TTR y el 11,5 % de las muestras que excedieron el LMR para la suma de TTR y OXY, pero no OXY solo. Nuestros datos reflejan la buena práctica clínica de estos dos TC en términos de uso en alimentación y tratamiento de animales en Arabia Saudita. Nuestro método no era adecuado para la determinación de CTC en muestras de leche, ya que su límite de cuantificación es dos veces el MRL. Por lo tanto, se necesita una mayor optimización de la sensibilidad para que el método pueda determinar los residuos de CTC en muestras de leche. Recomendamos el uso simultáneo de otras técnicas analíticas como el inmunoensayo en el monitoreo de rutina de los TC, así como la ampliación de las muestras utilizadas para incluir leche de granjas individuales y no comerciales para una investigación más detallada sobre la práctica de los períodos de retiro y los protocolos de tratamiento.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Departamento de Química Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad King Saud, Riyadh, Arabia Saudita

Moneera N. Alnassrallah, Nourah Z. Alzoman y Aliyah Almomen

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Correspondencia a Nourah Z. Alzoman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Alnassrallah, MN, Alzoman, NZ y Almomen, A. Inmunoensayo cualitativo para la determinación de residuos de antibióticos de tetraciclina en muestras de leche seguido de un método HPLC-DAD cuantitativo mejorado. Informe científico 12, 14502 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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Recibido: 26 Abril 2022

Aceptado: 22 de agosto de 2022

Publicado: 25 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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